Una citocina interferón alfa modificada que presenta una resistencia aumentada a la proteolisis en comparación con la citocina no modificada,

en la que:

la citocina interferón alfa modificada es una IFNa-2b o una IFNa-2a que comprende una sustitución de aminoácidos en la SEC ID Nº: 1 ó 182, correspondiente a la sustitución de E por Q en la posición 41, en la que el resto 1 se corresponde con el resto 1 de la citocina IFNa-2b o IFNa-2a madura expuesta en las SEC ID Nº: 1 ó 182; o

la citocina interferón alfa modificada es un homólogo estructural de IFNa-2b que comprende una sustitución de aminoácidos en una posición correspondiente a la sustitución de E por Q en la posición 41 en IFNa2b

Polipéptidos interferón a modificados resistentes a proteasas.

Campo de la invención

Se proponen proteínas citocinas modificadas que tienen propiedades modificadas seleccionadas en comparación con las proteínas no modificadas o naturales, así como moléculas de ácido nucleico que codifican estas proteínas. Así mismo, se ofrecen usos de estas proteínas para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades.

Antecedentes

El suministro de proteínas terapéuticas para uso clínico es un desafío de primera magnitud para la ciencia farmacéutica. Una vez que acceden al torrente circulatorio, estas proteínas son constantemente eliminadas de la circulación en un breve periodo de tiempo a través de diferentes procesos fisiológicos que implican tanto el metabolismo como el aclaramiento, empleando vías normales para la eliminación de proteínas tales como filtración (glomerular) en los riñones o la proteolisis en la sangre. Esta última es con frecuencia el proceso limitante que afecta a la semivida de proteínas usadas como agentes terapéuticos en la administración por vía oral y por inyección intravenosa o intramuscular. Los problemas asociados con estas vías de administración de proteínas son bien conocidos y se han usado diversas estrategias en un intento de resolverlos.

La familia de las citocinas, incluida la del interferón, es una familia de proteínas sobre la que se ha centrado una gran parte del trabajo clínico y de los esfuerzos para mejorar su administración y bio-asimilación. Las moléculas de interferón se agrupan en la familia heterogénea de las citocinas, identificadas originalmente sobre la base de su capacidad para inducir resistencia celular a las infecciones víricas (Díaz et al., J Interferon Cytokine Res, 16:179-180,1996). Los interferones de tipo I, denominados interferones a/ß, incluyen muchos miembros de la familia del interferón a (interferón a1, a2, ? y t), así como el interferón ß. El interferón ? de tipo II es diferente del tipo I en los mecanismos particulares que regulan su producción. Mientras que la producción de interferones a/ß se induce de manera muy eficaz en muchos tipos de células ante una infección vírica, el interferón ? se produce principalmente en células del sistema hematopoyético tales como células T o células asesinas naturales, tras la estimulación de antígenos o citocinas, respectivamente. Estos dos sistemas de interferón son funcionalmente no redundantes en la defensa antiviral del hospedador.

El interferón a, al que se designará en lo sucesivo "interferón alfa-2b" o "interferón a-2b" o "IFN a-2b", usados de forma intercambiable, posee un amplio espectro de efectos biológicos, incluidos los efectos antivirales. Los efectos antivirales incluyen acciones antiproliferativas e inmunomoduladoras (Stark et al., Annu. Rev. Biochem., 67: 227-264, 1998). Además de desencadenar potentes actividades antivirales en células diana, los interferones a/ß activan también células efectoras del sistema inmune innato tales como células asesinas naturales y macrófagos (Pestka et al., Annu. Rev. Biochem., 56:727-777, 1987; Biron et al., Annu. Rev. Immunol., 17: 189-220, 1999). Como parte de su acción inmunomoduladora, el interferón de tipo I protege los linfocitos T de la apoptosis (Scheel-Toller et al., Eur. J. Immunol., 29: 2603-2612, 1999; Marrack et al., J. Exp. Med., 189: 521-530, 1999) y de los factores promotores del crecimiento (Robert et al., Hematol. Oncol. 4: 113-120, 1986; Morikawa et al., J. Immunol., 139: 761-766, 1987). Los efectos biológicos de los interferones a/ß se inician tras la unión al receptor de IFN tipo I, lo que da como resultado la activación de diversas moléculas efectoras corriente abajo (Hibbert y Foster, J. Interferon Cytokine Res., 19: 309-318, 1999). Análisis mutacionales han conducido a la identificación de restos específicos tanto en los interferones a/ß como en sus receptores, que interaccionan tras la unión de ligando-receptor (Piehler et al., J. Mol. Biol., 294: 223-237, 1999).

Los interferones, así como muchas citocinas, son agentes terapéuticos importantes. Dado que las variantes de origen natural no se han desarrollado como agentes terapéuticos, a menudo tienen efectos secundarios indeseables, así como los problemas de breve semivida, de administración y biodisponibilidad mencionados anteriormente. Por lo tanto, existe la necesidad de mejorar las propiedades de las citocinas, incluidos los interferones, para su uso como agentes terapéuticos. Por consiguiente, entre los objetos de este documento, uno es proporcionar citocinas con propiedades terapéuticas mejoradas.

Sumario

Este documento proporciona métodos para el desarrollo dirigido de familias de proteínas y familias resultantes de proteínas modificadas. Inicialmente, se identifica una familia, como la familia de proteínas citocinas. Se selecciona para su modificación una propiedad o fenotipo tal como la resistencia a la proteolisis para una mayor estabilidad en sangre. Se seleccionan uno o más miembros representativos de la familia tales como miembros de la familia del interferón a como IFNa-2b o IFNa-2a, o de la familia del interferón ß. Se les modifica usando cualquier método de desarrollo dirigido y se analizan e identifican proteínas con un fenotipo deseado. Además, es posible mapear la estructura tridimensional de la proteína para identificar topológica y espacialmente los loci que se modifican para lograr el cambio fenotípico. Se generan u obtienen estructuras tridimensionales de otros miembros de la familia, y se comparan con el miembro modificado de la familia. Se identifican y modifican los loci en los otros miembros de la familia que se corresponden con las proteínas de los modificados en la proteína original. Se pueden ensayar las proteínas resultantes para confirmar que exhiben el fenotipo modificado.

En este documento se ofrecen métodos para generar citocinas modificadas basadas en la homología estructural (exploración 3D). Estos métodos se basan en la estructura espacial y topológica; no lo hacen sobre sus secuencias subyacentes de restos aminoacídicos. Los métodos se usan para la identificación de sitios diana para mutagénesis, especialmente en familias de proteínas diana. Las dianas se identifican por la comparación de los patrones del plegamiento del esqueleto proteico entre proteínas relacionadas estructuralmente. En este documento, los métodos se ejemplifican para citocinas. Igualmente, se proporcionan en este documento familias de citocinas modifi- cadas.

Para la optimización usando los métodos de desarrollo dirigido que se proporcionan en este documento resulta apropiada cualquier proteína conocida o disponible de alguna otra forma para el experto en la técnica, incluidas las citocinas (por ejemplo, IFNa, incluidos IFNa-2b e IFNa-2a, e IFNß), o cualquier otra proteína que haya sufrido ya una mutación u optimización.

En este documento se ofrecen citocinas modificadas que muestran resistencia incrementada a la proteolisis, evaluada tanto in vivo como in vitro. Típicamente, el aumento de la resistencia es de al menos 5%, generalmente de 8%, 10% o mayor. Las citocinas modificadas que se proporcionan en este documento incluyen las diseñadas por exploración 3D empleado los interferones a que se han modificado en base a los métodos de exploración 2D de este documento.

También se ofrecen en este documento proteínas citocinas modificadas (mutantes) tales como variantes de IFNa e IFNß, incluidas las proteínas IFNa-2b e IFNa-2a y proteínas IFNß, que poseen propiedades terapéuticas alteradas, en especial mejoradas, incluida una mayor estabilidad en comparación con las formas no modificadas. En particular, los ejemplos de citocinas modificadas que se ofrecen en este documento tienen una estabilidad incrementada que, por ejemplo, mejora su utilización como agentes terapéuticos. Entre las proteínas modificadas que se ofrecen en este documento se cuentan aquellas que muestran una mayor resistencia a la proteolisis comparadas con la citocina no modificada. En especial, dicha resistencia está incrementada en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 70%, 100% o más frente a la proteolisis en comparación con la citocina no modificada. También se ofrecen citocinas que poseen una mayor actividad antiproliferativa y/o antiviral y/o resistencia a la proteolisis con respecto a la citocina no modificada.

Ejemplos de citocinas modificadas que se ofrecen en este documento son interferones modificados que muestran una mayor estabilidad...

1. Una citocina interferón alfa modificada que presenta una resistencia aumentada a la proteolisis en comparación con la citocina no modificada, en la que:

2. La citocina interferón alfa modificada de la reivindicación 1, en la que la citocina modificada es un interferón a modificado que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 87 o una citocina modificada basándose en la homología tridimensional con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 87.

3. La citocina interferón alfa modificada de la reivindicación 1, que es una proteína humana.

4. La citocina interferón alfa modificada de la reivindicación 1, que es una citocina IFNa-2b modificada.

5. Una citocina interferón alfa modificada de la reivindicación 1, en la que la citocina comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 87, en la que la arginina en la posición 23 se sustituye con una lisina.

6. La citocina interferón alfa modificada de la reivindicación 1, en la que el homólogo estructural de IFNa-2b se selecciona de entre IFNa-c, IFNa-d, IFNa-5, IFNa-6, IFNa-4, IFNa-4b, IFNa-I, IFNa-J, IFNa-H, IFNa-F, IFNa-8 y citocina IFNa-consenso.

7. La citocina interferón alfa modificada de la reivindicación 1, que es una IFNa-2b o una IFNa-2a que comprende una sustitución de aminoácidos en la SEC ID Nº: 1 ó 182, que se corresponden con la sustitución de E por Q en la posición 41.

8. Una molécula de ácido nucleico que codifica una citocina de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8.

10. Una célula eucariota aislada que comprende el vector de la reivindicación 9.

11. Un método para la expresión de una citocina interferón alfa modificada que comprende:

12. El método de la reivindicación 11, en el que el hospedador es una célula hospedadora eucariota.

13. Una citocina interferón alfa modificada de acuerdo con la reivindicación 1 producida por el método de la reivindicación 11.

14. Una composición farmacéutica que comprende una citocina de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. La composición farmacéutica de la reivindicación 14, que se formula para administración oral.

16. La composición farmacéutica de la reivindicación 15, que es un comprimido o una cápsula.

17. Una composición farmacéutica de la reivindicación 14 o reivindicación 15 para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección en la que se ha usado interferón alfa para el tratamiento.

18. Uso de una citocina interferón alfa modificada de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para la formulación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o afección en la que se ha usado interferón alfa para el tratamiento.