Polipéptidos de fusión de GLP-1 (péptido 1 de tipo glucagón) con resistencia a peptidasa incrementada.

Un mimético de armazón de un péptido de fusión que comprende como componente (I) N-terminalmente

(i) GLP-1 (7-37) del SEQ ID NO:

1 o una secuencia funcional que ejerce los efectos biológicos de GLP-1 en forma dehormona incretina, su acción anti-apoptótica o sus propiedades neurotróficas y que tiene al menos 80% de identidadde secuencia con GLP-1 (7-37), o

(ii) un péptido GLP-1 modificado que consiste en la secuencia de aminoácidos de formula II: Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37, con lo que Xaa7 es L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, 3-hidroxi-histidina, homohistidina, N-acetil-histidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina o 4-piridilalanina; Xaa8 es Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, ácido (1-aminociclopropil)carboxílico, ácido (1-aminociclobutil)carboxílico, ácido (1-aminociclopentil)carboxílico, ácido (1-aminociclohexil)carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil)carboxílico, o ácido (1-aminociclooctil)carboxílico; Xaa16 esVal o Leu; Xaa18 es Ser, Lys o Arg; Xaa19 es Tyr o Gln ; Xaa20 es Leu o Met; Xaa22 es Gly, Glu o Aib; Xaa23 esGln, Glu, Lys o Arg ; Xaa25 es Ala o Val ; Xaa26 es Lys, Glu o Arg; Xaa27 es Glu o Leu; Xaa30 es Ala, Glu o Arg;Xaa33 es Val o Lys; Xaa34 es Lys, Glu, Asn o Arg; Xaa35 es Gly o Aib; Xaa36 es Arg, Gly o Lys o amida o estáausente; Xaa37 es Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, amida o está ausente,

y como componente (II) C-terminalmente una secuencia peptídica de al menos 9 aminoácidos y que contiene unasecuencia de acuerdo con el SEQ ID NO: 22 (RRDFPEEVAI) o una secuencia que tiene al menos 80% de identidadde secuencia con el SEQ ID NO: 22, confiriendo una mejora de resistencia a la inactivación por DPP-IV del péptidode fusión ,

en donde el mimético de armazón exhibe una modificación de uno o más miembros de la cadena principal (NH, CH,CO), en forma de una sustitución o en forma de una inserción, y su estructura de la cadena lateral es idéntica a ladel péptido correspondiente.

Polipéptidos de fusión de GLP-1 (péptido 1 de tipo glucagón) con resistencia a peptidasa incrementada La presente invención se refiere a nuevos miméticos de armazón de péptidos de fusión de GLP-1 que tienen extremos C prolongados, son resistentes a la inactivación por la endopeptidasa IV, se pueden expresar a niveles elevados en células animales transformadas, y p. ej. son útiles en el tratamiento de la diabetes de tipo 2.

El gen de glucagón está bien estudiado, véase p. ej. White, J.W. et al., 1986 Nucleic Acid Res. 14 (12) 4719-4730. La molécula de preproglucagón como molécula precursora de elevado peso molecular se sintetiza en las células pancreáticas alfa y en las células L del yeyuno y el colon. El preproglucagón es una prohormona de 180 aminoácidos de longitud y su secuencia contiene, además de glucagón, dos secuencias de estructura relacionada: el péptido 1 de tipo glucagón (GLP-1) y el péptido 2 de tipo glucagón (GLP-2) . En la molécula de preproglucagón, entre el GLP-1 y el GLP-2 se encuentra una secuencia peptídica de 17 aminoácidos (o más bien una secuencia de 15 aminoácidos más el sitio de escisión RR C terminal) , péptido intermedio 2 (IP2) . La secuencia del IP2 localizada entre el GLP-1 y el 2 en la molécula precursora es escindida normalmente de manera proteolítica después del aa 37 del GLP-1. El módulo de preproglucagón es por lo tanto escindido a diferentes péptidos, dependiendo de la célula, y del entorno, incluyendo GLP-1 (1-37) , un péptido de 37 aminoácidos en su forma no procesada. Generalmente, este procesamiento se produce en el páncreas y en el intestino. La secuencia de GLP-1 (1-37) puede ser procesada adicionalmente de manera proteolítica en GLP-1 activo (7-37) , la forma procesada de 31 aminoácidos, o GLP-1 (736) amida. Por consiguiente, la designación GLP-1 (7-37) indica que el fragmento en cuestión comprende los residuos de aminoácido desde (e incluyendo) el número 7 hasta (e incluyendo) el número 37 cuando se cuentas a partir del extremo N terminal del péptido parental, GLP-1. La secuencia de aminoácidos de GLP-1 (7-36) amida y de GLP-1 (7-37) se proporcionan en la fórmula I:

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-ValLys-Gly-Arg-X (I) que muestra GLP-1 (7-36) amida cuando X es NH2 y GLP-1 (7-37) cuando X es Gly-OH.

GLP-1 es una hormona del intestino y es el agente insulinotrópico endógeno mas potente con acciones que incluyen la estimulación de la actividad de la adenilato ciclasa y de la proteína quinasa en las células beta. Fisiológicamente, junto con el polipéptido inhibidor gástrico de la parte superior del intestino, funciona como una hormona incretina que disminuye el nivel de glucosa en sangre. Por lo tanto, el GLP-1, secretado en respuesta a la ingesta de alimento, tiene p. ej. múltiples efectos sobre el estómago, el hígado, el páncreas y el cerebro que trabajan en concierto para regular el azúcar en sangre. Por consiguiente, el péptido 1 de tipo glucagón GLP-1 (7-36) amida, y su análogo no amidado GLP-1 (7-37) han atraído un considerable interés debido a la potencia de sus acciones sobre el metabolismo de los carbohidratos y su potencial aplicabilidad al tratamiento de la diabetes, incluyendo la diabetes de tipo 2. La diabetes de tipo 2 se caracteriza por la resistencia a la insulina, puesto que las células no responden apropiadamente cuando está presente la insulina. Este es un problema más complejo que la diabetes de tipo 1. La diabetes de tipo 2 puede pasar inadvertida durante años en un paciente antes del diagnóstico, puesto que los síntomas son típicamente más suaves (sin cetoacidosis) y pueden ser esporádicos. Sin embargo, pueden surgir graves complicaciones de la diabetes de tipo 2 inadvertida, incluyendo insuficiencia renal, y enfermedad cardíaca coronaria. Esto conduce a un incremento de la morbidez y la mortalidad.

El GLP-1 (7-36) amida o el GLP-1 (7-37) tienen una vida en suero corta. El péptido es escindido por la dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV) entre los residuos 8 y 9. El péptido escindido es inactivo. De este modo el GLP-1, administrado exógenamente, tiene una vida extremadamente corta y tiene una utilidad limitada en aplicaciones terapéuticas.

Se han realizado varios intentos para sintetizar análogos estabilizados (contra DPP-IV) del GLP-1 de origen natural (GLP-1 (7-37) ) . En particular, el residuo 8 que in vivo es Ala, fue remplazado por otro residuo, por ejemplo, Gly, Ser

o Thr (Burcelin, R., et al. (1999) Metabolism 48, 252-258) . El análogo Gly8 o G8 ha sido ampliamente sometido a ensayo, tanto como molécula sintetizada, como producida por líneas celulares diseñadas genéticamente para secretar el polipéptido mutante (Burcelin, R., et a1 (1999) Annals of the New York Academy of Sciences 875: 277285) . Se han introducido otras modificaciones diferentes en GLP-1 (7-37) para intensificar su estabilidad in vivo sin comprometer su actividad biológica. Sin embargo, todos estos enfoques no lograron una trascendencia terapéutica significativa debido a los considerables problemas que implicaban.

El documento 02/46227 describe las proteínas de fusión de GLP-1, que comprenden los compuestos 1 de tipo glucagón fusionados a proteínas adecuadas para prolongar la vida media in vivo de los péptidos. Concretamente, el documento WO 02/46227 describe una proteína de fusión de GLP-1 con albúmina o inmunoglobulina. De acuerdo con el documento WO 02/46227 tales proetínas se pueden utilizar para tratar la diabetes mellitus no insulinodependiente así como una variedad de otras afecciones. Sin embargo, el documento WO 02/46227 no describe proteínas de fusión que comprenden como componente (I) GLP-1 (7-35, 7-36 o 7-37) N terminal o un derivado del mismo y como componente (II) una secuencia peptídica C terminal que contiene una secuencia de acuerdo con el SEQ ID NO: 22 (RRDFPEEVAI) .

Del mismo modo, la patente de los Estados Unidos US 2003/0221201 describe proteínas de fusión de transferrina y GLP-1. De un modo similar la patente de los Estados Unidos US 2003/0195154 describe una proteína de fusión de GLP-1 y transtiretina como compañero de fusión. Sin embargo, no se describen ni se sugieren más proteínas de fusión de GLP-1 en las patentes de los Estados Unidos US 2003/0221201 o US 2003/0195154, particularmente otros posibles compañeros de fusión para GLP-1, capaces de estabilizar el GLP-1 in vivo.

El documento WO 99/46283 describe un producto conjugado con péptido farmacológicamente activo que comprende una secuencia peptídica farmacológicamente activa (X) , como GLP-1, y una secuencia peptídica estabilizadora (Z) de 4 a 20 residuos de aminoácido, que están unidas covalentemente a la secuencia peptídica farmacológicamente activa (X) . La secuencia peptídica estabilizadora (Z) puede ser p. ej. la secuencia Lysp-Xaaq o Xaap-Lysq , en donde p y q son números enteros en el intervalo de 1 a 14, con la condición de que p+q esté en el intervalo de 3-15, y cada Xaa se seleccione independientemente del grupo que consiste en Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Arg, His, Orn, ácido 2, 4-diaminobutanoico, ácido 2, 3-diaminopropanoico y Met, concretamente secuencias peptídicas cortas de las fórmulas Lys3-Glu3 o Glu3-Lys3. El documento WO 99/46283 no describe proteínas de fusión que comprenden como componente (I) GLP-1 (7-35, 7-36 o 7-37) N terminal o un derivado del mismo y como componente (II) una secuencia peptídica C terminal que contiene una secuencia de acuerdo con el SEQ ID NO 22: (RRDFPEEVAI) .

El documento WO 03/058203 describe un péptido de GLP-1 acoplado a un extremo C prolongado que proporciona un aumento de estabilidad. Este extremo C prolongado comprende al menos 6 aminoácidos, preferiblemente de 7 a 9 aminoácidos. El documento WO 03/058203 no describe proteínas de fusión de GLP-1 que comprenden una secuencia de acuerdo con el SEQ ID NO 22 (RRDFPEEVAI) como extremo C prolongado.

La patente de los Estados Unidos US 2004/0146985 describe una proteína de fusión de GLP-1 (7-37) que contiene múltiples copias del péptido de GLP-1 (7-37) para producir este agente terapéutico a mayor escala. La patente de los Estados Unidos US 2004/0146985 no describe una proteína de fusión de GLP-1 (7-37) que comprende como componente (I) GLP-1 (7-35, 7-36 o 7-37) N terminal o un derivado del mismo y como componente (II) una secuencia peptídica C terminal que contiene una secuencia de acuerdo con el SEQ ID NO 22: (RRDFPEEVAI) .

La patente de los Estados Unidos US 5.861.284 describe péptidos de fusión de GLP-1 (7-37) y una secuencia de aminoácidos derivada del factor de crecimiento de fibroblastos en el extremo C. La invención de la patente de los Estados Unidos US 5.861.284 está dirigida... [Seguir leyendo]

1. Un mimético de armazón de un péptido de fusión que comprende como componente (I) N-terminalmente

(i) GLP-1 (7-37) del SEQ ID NO: 1 o una secuencia funcional que ejerce los efectos biológicos de GLP-1 en forma de hormona incretina, su acción anti-apoptótica o sus propiedades neurotróficas y que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con GLP-1 (7-37) , o

(ii) un péptido GLP-1 modificado que consiste en la secuencia de aminoácidos de formula II: Xaa7-Xaa8-Glu-GlyThr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37, con lo que Xaa7 es L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2amino-histidina, 3-hidroxi-histidina, homohistidina, N-acetil-histidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3piridilalanina, 2-piridilalanina o 4-piridilalanina; Xaa8 es Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, ácido (1aminociclopropil) carboxílico, ácido (1-aminociclobutil) carboxílico, ácido (1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1aminociclohexil) carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil) carboxílico, o ácido (1-aminociclooctil) carboxílico; Xaa16 es Val o Leu; Xaa18 es Ser, Lys o Arg; Xaa19 es Tyr o Gln ; Xaa20 es Leu o Met; Xaa22 es Gly, Glu o Aib; Xaa23 es Gln, Glu, Lys o Arg ; Xaa25 es Ala o Val ; Xaa26 es Lys, Glu o Arg; Xaa27 es Glu o Leu; Xaa30 es Ala, Glu o Arg; Xaa33 es Val o Lys; Xaa34 es Lys, Glu, Asn o Arg; Xaa35 es Gly o Aib; Xaa36 es Arg, Gly o Lys o amida o está ausente; Xaa37 es Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, amida o está ausente,

y como componente (II) C-terminalmente una secuencia peptídica de al menos 9 aminoácidos y que contiene una secuencia de acuerdo con el SEQ ID NO: 22 (RRDFPEEVAI) o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 22, confiriendo una mejora de resistencia a la inactivación por DPP-IV del péptido de fusión ,

en donde el mimético de armazón exhibe una modificación de uno o más miembros de la cadena principal (NH, CH, CO) , en forma de una sustitución o en forma de una inserción, y su estructura de la cadena lateral es idéntica a la del péptido correspondiente.

2. Un mimético de armazón de un péptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la cadena principal peptídica está sustituida en al menos una sola posición por enlaces amida retro-inversos (-CO-NH-) , hidroxil etileno (-CH (OH) -CH2-) , alqueno (CH2=CH-) , carba (CH2-CH2-) y/o -P=O (OH) -CH2-) .

3. Un mimético de armazón de un péptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde NH está sustituido con -O-, -S-, o -CH2-; -CH- está sustituido con -N-, C-alquilo o -BH-; o -CO- está sustituido con -CS-, -CH2-, SOn-, -P=O (OH) - o -B (OH) -.

4. Un mimético de armazón de un péptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la cadena principal es alargada mediante inserciones que flanquean el ácido de carbono alfa, preferiblemente -O-, -S-, -CH-, o -NH-.

5. Un mimético de armazón de un péptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 1 a 4, en donde el componente

(I) es un péptido GLP-1 modificado que comprende la secuencia de aminoácidos de formula III: Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37, en donde Xaa7 es L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, 3hidroxi-histidina, homohistidina, N-acetil-histidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2piridilalanina o 4-piridilalanina; Xaa8 es Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1-aminociclobutil) carboxílico, ácido (1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminociclohexil) carboxílico, ácido (1aminocicloheptil) carboxílico, o ácido (1-aminociclooctil) carboxílico; Xaa18 es Ser, Lys o Arg; Xaa22 es Gly, Glu o Aib; Xaa23 es Gln, Glu, Lys o Arg; Xaa26 es Lys, Glu o Arg; Xaa30 es Ala, Glu o Arg; Xaa34 es Lys, Glu o Arg; Xaa35 es Gly o Aib; Xaa36 es Arg o Lys, amida o está ausente; Xaa37 es Gly, Ala, Glu o Lys, amida o está ausente.

6. El mimético de armazón de un péptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 1 a 5, en donde componente I es GLP-1 (7-35) o GLP-1 (7-36) .

7. El mimético de armazón de un péptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 1 a 6, en donde el componente

(II) es una secuencia peptídica que contiene una secuencia de acuerdo con el SEQ ID NO: 23 (RRDFPEEVAIVEEL)

o SEQ ID NO: 24 (RRDFPEEVAIAEEL) o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con los SEQ ID NO: 23 o 24.

8. El mimético de armazón de un péptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 anteriores, en donde el componente (II) es una secuencia peptídica que contiene una secuencia de acuerdo con el SEQ ID NO: 2 (RRDFPEEVAIVEELG) o el SEQ ID NO: 3 (RRDFPEEVAIAEELG) o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con los SEQ ID NO: 2 o 3.

9. El mimético de armazón de un péptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 anteriores, en donde el componente (I) y componente (II) están conectados directamente o se conectan a través de una secuencia conectora.

10. El mimético de armazón de un péptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la secuencia conectora tiene una longitud de 1 a 10 aminoácidos.

11. El mimético de armazón de un péptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el mimético de armazón de un péptido de fusión contiene una secuencia de acuerdo con el SEQ ID NO: 8 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIAEELG) o el SEQ ID NO: (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIVEELG) o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con los SEQ ID NO: 8 o 12.

12. El mimético de armazón de un péptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 anteriores, en donde el mimético de armazón de un péptido de fusión contiene otro componente (III) conectado al extremo C del componente (II) .

13. El mimético de armazón de un péptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el componente

(III) comprende al menos cuatro residuos de aminoácido, o comprende preferiblemente al menos 10 residuos de aminoácido, o comprende más preferiblemente al menos 20 residuos de aminoácido.

14. El mimético de armazón de un péptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, en donde el componente (III) comprende al menos 4, preferiblemente al menos 10, más preferiblemente al menos 20 residuos de aminoácido de la secuencia N-terminal de GLP-2 como en el proglucagón o de GLP-1 (7-37) .

15. El mimético de armazón de un péptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en donde el componente (III) contiene la secuencia de los SEQ ID NO: 4 o 5 o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con los SEQ ID NO: 4 o 5.

16. El mimético de armazón de un péptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en donde el mimético de armazón de un péptido de fusión contiene una secuencia peptídica seleccionada de un grupo que consiste en: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11 o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con los SEQ ID NO: 6, 7, 10, o 11.

17. El mimético de armazón de un péptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 anteriores, en donde al menos uno de los aminoácidos es derivatizado mediante modificación covalente de una cadena lateral de un aminoácido de origen natural, mediante modificación de los grupos NH2 o carboxi terminales.

18. El mimético de armazón de un péptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 anteriores, en donde el mimético de armazón de un péptido de fusión comprende una proteína portadora, en particular transferrina o albúmina, como componente (IV) .

19. El mimético de armazón de un péptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 17, en donde al menos uno de los aminoácidos es derivatizado mediante un grupo lipilo o carbohidrato.

20. El mimético de armazón de un péptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 17 o 19, en donde el residuo de His N-terminal de GLP-1 (GLP-1 (7) ) es modificado químicamente en su extremo NH2 y/o en su cadena lateral de histidilo, en particular mediante un radical hidrófobo.

21. Un método para producir un mimético de armazón de un péptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 anteriores, mediante síntesis de péptidos en fase sólida.

22. Un mimético de armazón de un péptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 anteriores como medicamento para su uso en una terapia en seres humanos o animales.

23. Un mimético de armazón de un péptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 anteriores para su uso en el tratamiento de la diabetes mellitus de tipo I o tipo II, la resistencia a la insulina, los trastornos de peso y enfermedades o afecciones asociadas a ello.

24. Un mimético de armazón de un péptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 anteriores para su uso en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos y enfermedades o afecciones asociadas a ello.

25. Un mimético de armazón de un péptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 anteriores para su uso en el tratamiento de trastornos y enfermedades o afecciones asociados a ello.