POLIPÉPTIDOS DEL FACTOR VII DE COAGULACIÓN HUMANO.
Polipéptido del factor VII que comprende al menos dos sustituciones en relación a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº:
1, donde L305 ha sido sustituido por cualquier otro aminoácido y K337 ha sido sustituido por cualquier otro aminoácido, y donde dicho polipéptido del factor VII tiene una actividad coagulante aumentada en comparación con el factor VIIa de coagulación humano de tipo salvaje.
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/DK2002/000635.
Solicitante: NOVO NORDISK HEALTH CARE AG.
Nacionalidad solicitante: Suiza.
Dirección: ANDREASSTRASSE 15 8050 ZÜRICH SUIZA.
Inventor/es: OLSEN, OLE HVILSTED, PERSSON,EGON.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- A01H5/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA. › A01H NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION; REPRODUCCION DE PLANTAS POR TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS. › Angiospermas,es decir, plantas con flores, caracterizadas por sus partes vegetales; Angiospermas caracterizadas de forma distinta que por su taxonomía botánica.
- A01K67/027 A01 […] › A01K CRÍA DE ANIMALES; AVICULTURA; APICULTURA; PISCICULTURA; PESCA; ANIMALES PARA CRIA O REPRODUCCIÓN, NO PREVISTOS EN OTRO LUGAR; NUEVAS VARIEDADES DE ANIMALES. › A01K 67/00 Cría u obtención de animales, no prevista en otro lugar; Nuevas razas de animales. › Nuevas razas de vertebrados.
- A61K38/00 A […] › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00).
- A61K38/46 A61K […] › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › Hidrolasas (3).
- A61K38/48 A61K 38/00 […] › que actúan sobre enlaces peptídicos (3.4).
- A61P7/04 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES. › A61P 7/00 Medicamentos para el tratamiento de trastornos de la sangre o del fluido extracelular. › Antihemorrágicos; Procoagulantes; Hemostáticos; Antifibrinolíticos.
- C07K14/745 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Factores de coagulación sanguínea o de fibrinolisis.
- C12N1/15 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
- C12N1/19 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
- C12N15/09 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
- C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
- C12N9/64 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › que provienen de tejido animal, p. ej. renina.
- C12P21/02 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 21/00 Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00). › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.
PDF original: ES-2376694_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Polipéptidos del factor VII de coagulación humano
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a nuevos polipéptidos del factor VIIa de coagulación humano que tienen actividad coagulante al igual que construcciones de polinucleótidos que codifican tales polipéptidos, vectores y células huésped, comprendiendo y expresando el polinucleótido, composiciones farmacéuticas, usos y métodos de tratamiento.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La coagulación de la sangre es un proceso consistente en una interacción compleja de varios componentes sanguíneos (o factores) que da lugar finalmente a un coágulo de fibrina. Generalmente, los componentes sanguíneos, que participan en lo que se ha referido como la coagulación en "cascada", son proteínas enzimáticamente inactivas (proenzimas o zimógenos) que se convierten en enzimas proteolíticas por la acción de un activador (que por sí mismo es un factor de coagulación activado) . Factores de coagulación que han sufrido esta conversión son generalmente referidos como "factores activos", y se designan por la adición de la letra "a" al nombre del factor de coagulación (p. ej. factor VIIa) .
La iniciación del proceso hemostático se media por la formación de un complejo entre factor tisular, expuesto como resultado de una lesión de la pared del vaso y factor VIIa. Este complejo luego convierte los factores IX y X en sus formas activas. El factor Xa convierte cantidades limitadas de protrombina en trombina en la célula que contiene factor tisular. La trombina activa las plaquetas y los factores V y VIII en factores Va y VIIIa, ambos cofactores en otro proceso que lleva a la explosión de trombina completa. Este proceso incluye generación de factor Xa por factor IXa (en el complejo con factor VIIIa) y ocurre en la superficie de plaquetas activadas. La trombina convierte finalmente fibrinógeno en fibrina dando como resultado la formación de un coágulo de fibrina. En los últimos años se ha encontrado que el factor VII y el factor tisular son los iniciadores principales de la coagulación sanguínea.
El factor VII es una glicoproteína plasmática de trazo que circula en la sangre como un zimógeno monocatenario. El zimógeno es catalíticamente inactivo. El factor VII monocatenario se puede convertir en factor VIIa bicatenario por factor Xa, factor XIIa, factor IXa, factor VIIa o trombina in vitro. Se cree que el factor Xa es el activador fisiológico de factor VII más importante. Como otras proteínas plasmáticas diferentes implicadas en la hemostasis, el factor VII depende de la vitamina K para su actividad, que se requiere para la gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico múltiples que son agrupados cerca del amino terminal de la proteína. Estos ácidos glutámicos gamma-carboxilados se requieren para la interacción inducida por iones de metal del factor VII con fosfolípidos. La conversión del factor VII zimógeno en la molécula bicatenaria activada ocurre por escisión de un enlace peptídico Arg152 -Ile153 interno. En presencia de factor tisular, fosfolípidos e iones de calcio, el factor VIIa bicatenario rápidamente activa el factor X o factor IX por proteólisis limitada.
Es deseable frecuentemente estimular o mejorar la coagulación en cascada de un sujeto. El factor VIIa ha sido usado para controlar trastornos de sangrado que tienen diferentes causas, como deficiencias de factor de coagulación (p. ej. hemofilia A y B o deficiencia de factores XI o VII de coagulación) o inhibidores de factor de coagulación. El factor VIIa ha sido usado también para controlar sangrado excesivo que ocurre en sujetos con un funcionamiento normal de la coagulación en cascada de la sangre (sin deficiencias de factor de coagulación o inhibidores contra cualquiera de los factores de coagulación) . Este sangrado puede, por ejemplo, ser provocado por una función plaquetaria defectuosa, trombocitopenia o enfermedad de von \/Villebrand. El sangrado es también un problema importante en relación con la cirugía y otras formas de daño tisular.
La patente europea nº . 200, 421 (ZymoGenetics) se refiere al factor VII humano de codificación de secuencia de nucleótidos y la expresión recombinante del factor VII en células de mamíferos.
Dickinson et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 14379-14384) se refiere a una variante del factor VII en la que Leu305 ha sido sustituido por Ala (FVII (Ala305) ) .
Iwanaga et al. (Thromb. Haemost. (supplement August 1999) , 466, abstract 1474) se refiere a variantes del factor VIIa en las que los residuos 316-320 son eliminados o residuos 311-322 se sustituyen con los residuos correspondientes de tripsina "WO0158935 se refiere a los nuevos conjugados polipeptídicos del factor VII (FVII) o del factor VIIa (FVIIa) que comprenden al menos una molécula no peptídica, al igual que una o más sustituciones de aminoácido, y que puede demostrar una o más de las siguientes características deseables: vida media in vivo funcional aumentada, vida media de plasma aumentada, biodisponibilidad aumentada y/o sensibilidad a degradación proteolítica reducida. Person et al. (Jour. Biol. Chem. (2001) 276: 29195- 29199) se refiere a variantes polipeptídicas del factor VIIa que contienen sustituciones de aminoácido dentro y en proximidad espacial de la -hélice (residuos 305, 307-312 y 374) . Person et al. (2001) encontraron que la sustitución de valina para leucina 305 en el factor VIIa aumenta la actividad enzimática intrínseca".
Hay una necesidad de variantes del factor VIIa con actividad coagulante, variantes con actividad alta que se pueden administrar en dosis relativamente bajas y variantes que no producen los efectos secundarios indeseables, como activación sistémica del sistema de coagulación y sangrado, respectivamente, asociados a terapias convencionales.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
"Se ha descubierto que las variantes polipeptídicas del factor VIIa de la SEQ ID nº 1, donde al menos el aminoácido Leu305 ha sido sustituido con otro aminoácido y donde el aminoácido Lys337 ha sido sustituido con otro aminoácido, han aumentado la actividad coagulante en comparación con el factor VIIa de coagulación humano de tipo salvaje".
El término "un aminoácido diferente", como se utiliza en este caso, significa un aminoácido que es diferente de aquel aminoácido naturalmente presente en esa posición. Este incluye, pero de forma no limitativa, aminoácidos que se pueden codificar por un polinucleótido. Preferiblemente, el aminoácido diferente está en forma de L natural y se puede codificar por un polinucleótido. Un ejemplo específico es L-cisteína (Cys) .
El término "actividad", como se utiliza en este caso, significa la capacidad de un polipéptido del factor VII para convertir su sustrato de factor X en el facto Xa activo. La actividad de un polipéptido del factor VII se puede medir con el "Ensayo de proteólisis in vitro" (véase ejemplo 6) .
El término "actividad inherente" también incluye la capacidad para generar trombina en la superficie de plaquetas activadas en ausencia de factor tisular.
El Leu305 se localiza al final de una -hélice encontrada en la forma compleja de factor tisular del factor VIIa, que se cree que es importante para la actividad. En el Factor VIIa libre (factor VIIa no vinculado al factor tisular) la hélice se distorsiona y así posiblemente se vuelve inestable. Las variantes de polipéptido según la presente invención logran la conformación activa, que normalmente tiene que ser inducida por factor tisular. La actividad aumentada de las variantes polipeptídicas en comparación con factor VIIa de tipo salvaje se puede deber a una estabilización de la -hélice, una reorientación de la hélice o algún otro cambio en la conformación. Sustitución de Leu305 induce una reorientación y/o estabilización de la hélice.
Los aminoácidos comprendiendo Lys157; Lys337; Asp334; Ser336; Val158; Glu296 y Met298 se localizan en un área que se cree que afecta a la inserción del amino terminal del dominio de proteasa y así la formación de la conformación catalíticamente activa de factor VIIa que depende de un puente de sal entre el grupo amino terminal de Ile153 y la cadena lateral de Asp343. Las sustituciones pueden eliminar repulsiones electroestáticas, añadir enlaces de hidrógeno o de otra manera facilitar la inserción del amino terminal.
Debido a la actividad inherente más alta de las variantes polipeptídicas del factor VIIa descritas en comparación con FVIIa nativo,... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Polipéptido del factor VII que comprende al menos dos sustituciones en relación a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº : 1, donde L305 ha sido sustituido por cualquier otro aminoácido y K337 ha sido sustituido por cualquier otro aminoácido, y donde dicho polipéptido del factor VII tiene una actividad coagulante aumentada en comparación con el factor VIIa de coagulación humano de tipo salvaje.
2. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 1, donde al menos un aminoácido en las posiciones restantes en el dominio de proteasa ha sido sustituido por cualquier otro aminoácido.
3. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 2, donde como máximo 20 aminoácidos adicionales en las posiciones restantes en el dominio de proteasa han sido sustituidos por otros aminoácidos.
4. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 3, donde al menos un aminoácido correspondiente a un aminoácido en una posición seleccionada d.
15. 170 de la SEC ID nº : 1 ha sido sustituido por cualquier otro aminoácido.
5. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 2, donde al menos un aminoácido correspondiente a un aminoácido en una posición seleccionada d.
29. 304 de la SEC ID nº : 1 ha sido sustituido por cualquier otro aminoácido.
6. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 5, donde R304 ha sido sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo consistente en Tyr, Phe, Leu y Met.
7. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 2, donde al menos un aminoácido correspondiente a un aminoácido en una posición seleccionada d.
30. 312 de la SEC ID nº : 1 ha sido sustituido por cualquier otro aminoácido.
8. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 7, donde M306 ha sido sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo consistente en Asp y Asn.
9. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 7, donde D309 ha sido sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo consistente en Ser y Thr.
10. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 2, donde al menos un aminoácido correspondiente a un aminoácido en una posición seleccionada d.
33. 339 de la SEC ID nº : 1 ha sido sustituido por cualquier otro aminoácido.
11. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 2, donde A274 ha sido sustituido por cualquier otro aminoácido.
12. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 11, donde dicho A274 ha sido sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo consistente en Met, Leu, Lys y Arg.
13. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 1, donde dicho K337 ha sido sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo consistente en Ala, Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp y Glu.
14. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 1, donde dicho L305 ha sido sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo consistente en Val, Tyr y Ile.
15. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 14, donde dicho L305 ha sido sustituido por Val.
16. Polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1-15, que puede ser codificado por construcciones polinucleótidas.
17. Polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones de 1-15, donde la proporción entre la actividad de dicho polipéptido del factor VII y la actividad del polipéptido del factor VIIa nativo mostrados en la SEC ID nº : 1 es al menos aproximadamente 1, 25.
18. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 17, donde dicha proporción es al menos aproximadamente 2, 0, preferiblemente al menos aproximadamente 4, 0.
19. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 1, que es L305V/K337A-FVII.
20. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 1, que es L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII.
21. Construcción polinucleótida que codifica un polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1
20.
22. Célula huésped que comprende la construcción polinucleótida según la reivindicación 21. 5
23. Animal no humano transgénico que contiene y expresa la construcción polinucleótida según la reivindicación 21.
24. Composición farmacéutica de un polipéptido del factor VII que comprende al menos dos sustituciones en relación a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº : 1, donde L305 ha sido sustituido por cualquier otro aminoácido y
K337 ha sido sustituido por cualquier otro aminoácido y donde dicho polipéptido del factor VII tiene una actividad coagulante aumentada en comparación con el factor VIIa de coagulación humano de tipo salvaje; y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable.
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