Polipéptido VKORC1 de reciclaje de la vitamina K-epóxido, una diana terapéutica de la cumarina y sus derivados.

Método para la gamma-carboxilación de un polipéptido dependiente de la vitamina K en una célula huésped que comprende introducir en dicha célula huésped un ácido nucleico que codifica VKORC1 de manera que el ácido nucleico que codifica VKORC1 se expresa recombinantemente en dicha célula

, donde el ácido nucleico que codifica VKORC1 codifica para:

a) una secuencia polipeptídica de VKORC1;

b) una secuencia polipeptídica de un alelo de la secuencia polipeptídica definida en a);

c) una secuencia polipeptídica de que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia polipeptídica definida en a) o b) donde la secuencia polipeptídica tiene actividad de VKORC1;

d) una secuencia polipeptídica de un fragmento de la secuencia polipeptídica definida en a), b) o c) que tiene actividad de VKORC1,

donde la expresión de dicho VKORC1 en dicha célula huésped aumenta la actividad basal de VKORC1 de dicha célula, donde el ácido nucleico comprende una secuencia de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, o una secuencia que tiene al menos una identidad del 90% con éstas y que codifica para una proteína de VKORC1 activa, y donde dicho método no es un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10011278.

Solicitante: BAXTER INTERNATIONAL INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: ONE BAXTER PARKWAY DEERFIELD, IL 60015 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: OLDENBURG,JOHANNES, MULLER-REIBLE,CLEMENS,R, FREGIN,ANDREAS, ROST,SIMONE, STROM,TIM-MATHHIAS.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/10 (Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/50 (Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre, de orina; Investigación o análisis por métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Investigación o análisis inmunológico (procedimientos de medida, de investigación o análisis diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto; procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS;... > Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido... > C07H21/04 (con desoxirribosilo como radical sacárido)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA > CRIA; AVICULTURA, PISCICULTURA, APICULTURA; PESCA;... > Cría u obtención de animales, no prevista en otro... > A01K67/027 (Nuevas razas de vertebrados)
  • C12N5/06
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales > C07K16/40 (contra enzimas)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/52 (Genes que codifican enzimas o proenzimas)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/02 (Oxidorreductasas (1.), p. ej. luciferasa)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/04 (actúan sobre grupos CHOH como dadores, p. ej. glucosa oxidasa de glucosa, deshidrogenasa láctica (1.1))
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA > CONSERVACION DE CUERPOS HUMANOS O ANIMALES O DE VEGETALES... > Biocidas, productos que atraen o repelen a los animales... > A01N43/16 (con oxígeno como heteroátomo del ciclo)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen péptidos... > A61K38/44 (Oxidoreductasas (1))

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Ilustración 1 de Polipéptido VKORC1 de reciclaje de la vitamina K-epóxido, una diana terapéutica de la cumarina y sus derivados.
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Polipéptido VKORC1 de reciclaje de la vitamina K-epóxido, una diana terapéutica de la cumarina y sus derivados.

Fragmento de la descripción:

Polipéptido VKORC1 de reciclaje de la vitamina K-epóxido, una diana terapéutica de la cumarina y sus derivados

Campo de la Invención La invención se refiere a un método para la gamma-carboxilación de un polipéptido dependiente de la vitamina K en una célula huésped, el cual comprende introducir en dicha célula huésped un ácido nucleico que codifica VKORC1 de manera que tal ácido nucleico que codifica VKORC1 se expresa de forma recombinante en dicha célula. Además, la presente invención se refiere al uso de una ácido nucleico recombinante de VKORC1 para la gamma-carboxilación de un polipéptido dependiente de la vitamina K en una célula huésped.

Antecedentes de la Invención La represión de la coagulación sanguínea prematura es la opción terapéutica seleccionada para el tratamiento agudo y la prevención a largo plazo de eventos trombóticos. De entre los anticoagulantes, las cumarinas se utilizan ampliamente para la prevención de la trombosis, por ejemplo en pacientes inmovilizados después de una cirugía, en pacientes con insuficiencia cardíaca crónica, en pacientes con enfermedad vascular ateroesclerótica, en pacientes con tumores malignos y en mujeres embarazadas. Además, las cumarinas son los anticoagulantes orales más utilizados para el tratamiento y la profilaxis de la trombosis [Suttie, 1987]. Las cumarinas son derivados típicos de 6-hidroxicumarina, por ejemplo 3- (actonilbencil) -4-hidroxicumarina (COUMADIN®) .

Las cumarinas tienen como objetivo la cascada de coagulación sanguínea indirectamente mediante la inhibición del ciclo de la vitamina K.

La vitamina K es un cofactor esencial para la activación post-traducción por la gamma-carboxilación de un grupo de proteínas reguladoras, las proteínas Gla. En diversas vías metabólicas, algunas proteínas clave necesitan una carboxilación para funcionar adecuadamente. La cascada de coagulación sanguínea es el ejemplo mejor estudiado. Aquí, los factores procoagulantes II, VII, IX y X, así como los factores anticoagulantes proteína C, proteína S, proteína Z, dependen de la gamma-carboxilación. Esta modificación post-traducción permite la fijación de las proteínas modificadas, en presencia de calcio, a las membranas fosfolipídicas bicapa, lo que representa una etapa esencial en la activación de la coagulación sanguínea [Sperling y col., 1978; Esmon y col., 1975]. Otras proteínas que requieren de la gamma-carboxilación son la proteína de matriz gla y la osteocalcina, ambas reguladoras del metabolismo óseo [Price, 1988] y "el gen específico de la inhibición del crecimiento", una proteína señal de transducción del ciclo celular [Manfioletti y col., 1993; Stitt y col., 1995].

Durante la gamma-carboxilación se introduce un grupo carboxilo en los residuos glutamato de las proteínas diana mediante la enzima gamma-glutamil carboxilasa (GGCX) en los microsomas del hígado [Furie & Furie, 1988; Suttie, 1987]. La reacción requiere como cofactor cantidades estequiométricas de vitamina K1hidroquinona reducida (vitamina K1H2) , que se oxida a vitamina K-2, 3-epóxido [Cain y col., 1997]. La regeneración del cofactor activo es mediada por un complejo multiproteína denominado vitamina K-2, 3-epóxido reductasa (VKOR) [Wallin & Martin, 1985]. El mismo complejo es el objetivo de los venenos de tipo cumarina utilizados en el control plaguicida de roedores. Este "ciclo de la vitamina K" se ha caracterizado bioquímicamente de forma detallada, pero los componentes moleculares no han sido purificados todavía hasta homogeneidad [Guenthner y col., 1981]. Además, la naturaleza molecular de la actividad de la cumarina y las moléculas que interactúan con las cumarinas siguen siendo imprecisas.

En general se aprecia en la técnica que, a pesar de su gran eficacia, existe diversas limitaciones al uso de las cumarinas. En primer lugar, algunos seres humanos son insensibles al tratamiento con cumarina. El término resistencia a la warfarina (WR) se utiliza para individuos que mantienen actividades normales del factor de coagulación a pesar de la anticoagulación oral con cumarinas (Acceso OMIM Nº 122700) . Se ha observado una transmisión autosómica dominante en varios linajes [O'Reilly y col., 1964; O'Reilly, 1970]. La deficiencia combinada de todos los factores de coagulación dependientes de la vitamina K (VKCFD) es un trastorno de sangrado muy raro en humanos con herencia autosómica recesiva, 14 casos descritos hasta la fecha [McMillan & Roberts, 1966; Fischer, 1966; Johnson y col., 1980; Goldsmith y col., 1982; Vicente y col., 1984; Ekelund y col., 1986; Pauli y col., 1987; Leonard, 1988; Pechlaner y col., 1992; Boneh & Bar-Ziv, 1996; Brenner y col., 1998; Spronk y col., 2000; Oldenburg y col, 2000]. Los síntomas clínicos de la enfermedad incluyen episodios de hemorragias intracerebrales perinatales, a veces con resultado fatal. Habitualmente, la tendencia al sangrado se invierte por completo mediante la administración oral de vitamina K. Los síntomas adicionales en recién nacidos se asemejan a la embriopatía por warfarina con hipoplasia falangiana basal y distal y calcificación prematura de la epífisis [Pauli y col., 1987]. La enfermedad puede resultar de una resorción/transporte defectuoso de la vitamina K al hígado [Prentice, 1985] o de mutaciones en uno de los genes implicados en la gammacarboxilación. En el subtipo 1 (VKCFD1, OMIM # 277450) , las mutaciones en el gen GGCX sobre el cromosoma 2p12 resultan en una carboxilación insuficiente de los factores de coagulación [Brenner y col., 1998; Spronk y col., 2000]. Se ha descrito una conexión de dos familias con la deficiencia múltiple familiar del factor de coagulación (FMFD, ahora renombrado: VKCFD2, OMIM # 607473) a un intervalo de 20 Mb de la región pericéntrica del cromosoma 16p12-q21 [Fregin y col., 2002]. Los pacientes con VKCFD2 mostraron niveles de suero con un notable aumento de vitamina K-epóxido, sugiriendo así un defecto en una de las subunidades del complejo VKOR. En su conjunto, es evidente que existen pacientes que presentan resistencia a la warfarina. Como consecuencia, existe la necesidad de identificar nuevos derivados de cumarinas que sean anticoagulantes eficaces para tratar a estos pacientes, así como métodos para identificar estos derivados de la cumarina.

El uso de cumarinas se asocia con un riesgo de sangrado espontáneo, con un índice de mortalidad significativo. Además, la predicción de la dosis exacta de mantenimiento de la cumarina es difícil. En ausencia de la molécula diana sobre la que la cumarina ejerce un efecto, el régimen de tratamiento debe establecerse en base a cada paciente. Mientras el régimen óptimo no se ha establecido todavía, el paciente tiene un mayor riesgo de trombogénesis o de sangrado. Por tanto, es necesario un método para determinar el régimen óptimo de tratamiento lo más rápido y seguro posible. Además, el establecimiento de un régimen de tratamiento óptimo se complica por el hecho de que existe un retraso considerable entre la administración de las cumarinas y el desencadenamiento de su actividad anticoagulante. Dada la acción retardada de la cumarina y considerando el hecho de que la cumarina tiende a acumularse con el tiempo, existe la necesidad de derivados de cumarina que permitan la coagulación sanguínea de forma más rápida que las cumarinas conocidas en la técnica. De la misma manera, existe también la necesidad de cumarinas que se metabolicen más rápidamente, de forma que se pueda impedir o mejorar la acumulación de cumarina y, consecuentemente, reducir o suprimir el riesgo de sobredosis.

Se entenderá que cuando el tratamiento con cumarina se inicia durante un estado trombótico, los niveles de proteína C y S disminuyen, creando así temporalmente un potencial trombogénico que normalmente... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para la gamma-carboxilación de un polipéptido dependiente de la vitamina K en una célula huésped que comprende introducir en dicha célula huésped un ácido nucleico que codifica VKORC1 de manera que el ácido nucleico que codifica VKORC1 se expresa recombinantemente en dicha célula, donde el ácido nucleico que codifica VKORC1 codifica para:

a) una secuencia polipeptídica de VKORC1; b) una secuencia polipeptídica de un alelo de la secuencia polipeptídica definida en a) ; c) una secuencia polipeptídica de que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia polipeptídica

definida en a) o b) donde la secuencia polipeptídica tiene actividad de VKORC1;

d) una secuencia polipeptídica de un fragmento de la secuencia polipeptídica definida en a) , b) o c) que tiene actividad de VKORC1,

donde la expresión de dicho VKORC1 en dicha célula huésped aumenta la actividad basal de VKORC1 de dicha célula, donde el ácido nucleico comprende una secuencia de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, o una secuencia que tiene al menos una identidad del 90% con éstas y que codifica para una proteína de VKORC1 activa, y donde dicho método no es un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la citada proteína dependiente de la vitamina K se selecciona de entre el grupo consistente en factores de coagulación sanguínea II, VII, IX, X, proteína C, proteína S, proteína Z, proteína de matriz gla y osteocalcina.

3. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho ácido nucleico que codifica VKORC1 se expresa en combinación con un ácido nucleico que codifica para la gamma-glutamil-carboxilasa.

4. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque las células que expresan dicho VKORC1 tienen una actividad basal incrementada en aproximadamente un 15% o más en comparación con la actividad basal de VKORC1 de dicha célula en ausencia de la expresión recombinante del VKORC1 en la célula huésped.

5. Uso de un ácido nucleico recombinante de VKORC1 que codifica una secuencia polipeptídica seleccionada de entre el grupo consistente en:

a) una secuencia polipeptídica de VKORC1; b) una secuencia polipeptídica de un alelo de la secuencia polipeptídica definida en a) ; c) una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia polipeptídica

definida en a) o b) , donde la secuencia polipeptídica tiene actividad de VKORC1;

d) una secuencia polipeptídica de un fragmento de la secuencia polipeptídica definida en a) , b) o c) que tiene actividad de VKORC1,

para la gamma-carboxilación de un polipéptido dependiente de la vitamina K en una célula huésped, donde la expresión de dicho VKORC1 en dicha célula huésped aumenta la actividad basal de VKORC1, donde el ácido nucleico comprende una secuencia de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, o una secuencia que tiene al menos una identidad del 90% con éstas y que codifica una proteína de VKORC1 activa, y donde dicho uso no es un uso para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia.

6. Uso según la reivindicación 5, caracterizado porque el citado polipéptido dependiente de la vitamina K se selecciona de entre el grupo consistente en factores de coagulación sanguínea II, VII, IX, X, proteína C, proteína S, proteína Z, proteína de matriz gla y osteocalcina.

7. Uso según la reivindicación 5, caracterizado porque dicho ácido nucleico de VKORC1 se utiliza en combinación con un ácido nucleico que codifica para la gamma-glutamil-carboxilasa.

8. Uso según la reivindicación 5, caracterizado porque dichas células que expresan dicho VKORC1 tienen una actividad basal incrementada en aproximadamente un 15% o más en comparación con la actividad basal de VKORC1 de dicha célula en ausencia de la expresión recombinante del VKORC1 en la célula huésped.

FIGURA 1

Posición genética Promedio por sexo Intervalo candidato por

mapeo de homocigotidad

MMU cromosoma 8 (parcial) MMU cromosoma 7 (parcial)

RNO cromosoma 19 (parcial)

RNO cromosoma 1 (parcial)

Posición en el mapa genético de los locus de resistencia a la warfarina en ratones (War) y ratas (Rw)

FIGURA 2 FIGURA 3 FIGURA 4

CorazónCerebroPlacentaPulmónHígadoMúsculo esqueletalRiñónPáncreas

CerebroCorazónRiñónHígadoPulmón FIGURA 5

superpuesto superpuesto superpuesto FIGURA 6

FIGURA 7

Localizaciones de las dianas de ARNsi en la secuencias de codificación de la subunidad 1 del complejo vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1)

FIGURA 9

TABLA DE SECUENCIAS

SEQ ID NO: Nombre Especie

1 Secuencia proteica de la subunidad 1 del complejo vitamina K-epóxido reductasa (Hs_VKORC1) Homo sapiens

2 Secuencia de codificación de la subunidad 1 del complejo vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1) Homo sapiens

3 Factor de coagulación dependiente de la vitamina K, de tipo 2 (VKCFD2) -mutación (292C>T; R98W) de la secuencia Hs_VKORC1 Homo sapiens

4 Resistencia a warfarina (WR) -secuencia 1 de mutación (85G>T; V29L) de la secuencia de Hs_VKORC1 Homo sapiens

5 Resistencia a warfarina (WR) -secuencia 2 de mutación (134T>C; V45A) de la secuencia de Hs_VKORC1 Homo sapiens

6 Resistencia a warfarina (WR) -secuencia 3 de mutación (172A>G; R58G) de la secuencia de Hs_VKORC1 Homo sapiens

7 Resistencia a warfarina (WR) -secuencia 4 de mutación (383T>G; L128R) de la secuencia de Hs_VKORC1 Homo sapiens

8 Polimorfismo de nucleótido único (SNP) 1 (129C>T, C43C) de la secuencia de la subunidad 1 del complejo vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1) Homo sapiens

9 SNP 2 (358C>T, L120L) de la secuencia de la subunidad 1 del complejo vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1) Homo sapiens

10 Secuencia proteica de la proteína 1 de tipo VKORC1 de Homo sapiens (Hs_VKORC1L1) Homo sapiens

11 Secuencia de codificación de la proteína 1 de tipo VKORC1 de Homo sapiens (Hs_VKORC1L1) Homo sapiens

12 Secuencia proteica de la subunidad 1 del complejo vitamina K-epóxido reductasa de Rattus norvegicus (Rn_VKORC1) Rattus norvegicus

13 Secuencia de codificación de la subunidad 1 del complejo vitamina K-epóxido reductasa de Rattus norvegicus (Rn_VKORC1) Rattus norvegicus

14 Resistencia a warfarina de la rata (Rw) -secuencia de mutación (416A>G; Y139C) de la secuencia de Rn_VKORC1 Rattus norvegicus

15 Secuencia proteica de la proteína 1 de tipo VKORC1 de Rattus norvegicus (Rn_VKORC1L1) Rattus norvegicus

16 Secuencia de codificación de la proteína 1 de tipo VKORC1 de Rattus norvegicus (Rn_VKORC1L1) Rattus norvegicus

17 Secuencia proteica de la subunidad 1 del complejo vitamina K-epóxido reductasa de Mus musculus (Mm_VKORC1) Mus musculus

18 Secuencia de codificación de la subunidad 1 del complejo vitamina K-epóxido reductasa de Mus musculus (Mm_VKORC1) Mus musculus

19 Secuencia proteica de la proteína 1 de tipo VKORC1 de Mus musculus (Mm_VKORC1L1) Mus musculus

20 Secuencia de codificación de la proteína 1 de tipo VKORC1 de Mus musculus (Mm_VKORC1L1) Mus musculus

21 Secuencia proteica de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Fugu rubripes (Fr_VKORC1) Fugu rubripes

22 Secuencia de codificación de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Fugu rubripes (Fr_VKORC1) Fugu rubripes

23 Secuencia proteica de la proteína 1 de tipo VKORC1 de Fugu rubripes (Fr_VKORC1L1) Fugu rubripes

24 Secuencia de codificación de la proteína 1 de tipo VKORC1 de Fugu rubripes (Fr_VKORC1L1) Fugu rubripes

25 Secuencia proteica de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Xenopus laevis (XI_VKORC1) Xenopus laevis

26 Secuencia de codificación de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Xenopus laevis (XI_VKORC1) Xenopus laevis

27 Secuencia proteica de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Anopheles gambiae (Ag_VKORC1L1) Anopheles gambiae

28 Secuencia de codificación de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Anopheles gambiae (Ag_VKORC1L1) Anopheles gambiae

29 Secuencia 1 de ARNsi de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1)

30 Secuencia 2 de ARNsi de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1)

31 Cebador 1 aguas abajo para la secuencia de ARNsi de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1)

32 Cebador 2 aguas abajo para la secuencia de ARNsi de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1)

33 Secuencia 3 de ARNsi de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1)

34 Secuencia 4 de ARNsi de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1)

35 Cebador 3 aguas abajo para la secuencia de ARNsi de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1)

36 Cebador 4 aguas abajo para la secuencia de ARNsi de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1)

37 Secuencia 5 de ARNsi de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1)

38 Secuencia 6 de ARNsi de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1)

39 Cebador 5 aguas abajo para la secuencia de ARNsi de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1)

40 Cebador 6 aguas abajo para la secuencia de ARNsi de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1)

41 Secuencia 7 de ARNsi de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1)

42 Secuencia 8 de ARNsi de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1)

43 Cebador 7 aguas abajo para la secuencia de ARNsi de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1)

44 Cebador 8 aguas abajo para la secuencia de ARNsi de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1)

45 Secuencia 9 de ARNsi de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1)

46 Secuencia 10 de ARNsi de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1)

47 Cebador 9 aguas abajo para la secuencia de ARNsi de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1)

48 Cebador 10 aguas abajo para la secuencia de ARNsi de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1)

49 Secuencia 11 de ARNsi de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1)

50 Secuencia 12 de ARNsi de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1)

51 Cebador 11 aguas abajo para la secuencia de ARNsi de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1)

52 Cebador 12 aguas abajo para la secuencia de ARNsi de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (Hs_VKORC1)

53 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de codificación completa de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (VKORC1-HindIII-F)

54 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de codificación completa de la subunidad 1 del complejo de vitamina K-epóxido reductasa de Homo sapiens (VKORC1-HindIII-F)

55 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Homo sapiens Hs_VKORC1-Ex1-F

56 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Homo sapiens Hs_VKORC1-Ex1-R

57 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Homo sapiens Hs_VKORC1-Ex2-F

58 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Homo sapiens Hs_VKORC1-Ex2-R

59 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Homo sapiens Hs_VKORC1-Ex3-F

60 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Homo sapiens Hs_VKORC1-Ex3-R

61 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Homo sapiens Hs_VKORC1-ADNc-F

62 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Homo sapiens Hs_VKORC1-ADNc-R

63 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Rattus norvegicus Rn_VKORC1-ADNc-F

64 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Rattus norvegicus Rn_VKORC1-ADNc-R

65 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Rattus norvegicus Rn_VKORC1-ADNc-F-nes

66 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Rattus norvegicus Rn_VKORC1-ADNc-R-nes

67 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Fugu rubripes Fr_VKORC1-ADNc-F

68 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Fugu rubripes Fr_VKORC1-ADNc-R

69 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Fugu rubripes Fr_VKORC1-ADNc-F-nes

70 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Fugu rubripes Fr_VKORC1-ADNc-R-nes

71 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Homo sapiens Hs_VKORC1L1-ADNc-F

72 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Homo sapiens Hs_VKORC1L1-ADNc-R

73 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Homo sapiens Hs_VKORC1L1-ADNc-F-nes

74 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Homo sapiens Hs_VKORC1L1-ADNc-R-nes

75 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Fugu rubripes Fr_VKORC1L1-ADNc-F

76 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Fugu rubripes Fr_VKORC1L1-ADNc-R

77 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Fugu rubripes Fr_VKORC1L1-ADNc-F-nes

78 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Fugu rubripes Fr_VKORC1L1-ADNc-R-nes

79 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Rattus norvegicus Rn_VKORC1L1-ADNc-F

80 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Rattus norvegicus Rn_VKORC1L1-ADNc-R

81 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Rattus norvegicus Rn_VKORC1L1-ADNc-F-nes

82 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Rattus norvegicus Rn_VKORC1L1-ADNc-R-nes

83 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Rattus norvegicus Rn_VKORC1L1-ADNc-R-corto

84 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Mus musculus Mm_VKORC1L1-ADNc-F

85 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Mus musculus Mm_VKORC1L1-ADNc-R

86 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Mus musculus Mm_VKORC1L1-ADNc-F-nes

87 Cebador para PCR para la amplificación de la secuencia de Mus musculus Mm_VKORC1L1-ADNc-R-nes

88 Cebador para PCR para rVKORC1-outerF

89 Cebador para PCR para rVKORC1-outerR

90 Cebador para PCR para rVKORC1-innerF

91 Cebador para PCR para rVKORC1-innerR

92 Cebador para PCR para VKORC1-pcdna3-F

93 Cebador para PCR para VKORC1-pcdna3-R

94 VKORC1 de Homo sapiens con mutación 416A>G de resistencia a warfarina en rata

FIGURA 10

Actividades1de VKOR de células HEK293 transfectadas con constructos de ADNc de VKORC1

Warfarina [μM] FIGURA 11

Secuencia de aminoácidos del polipéptido de reciclaje de vitamina K-epóxido de Homo sapiens

(HS_VKORC1; SEQ ID NO:1) FIGURA 12

Secuencia de codificación de ácido nucleico del polipéptido de reciclaje de vitamina K-epóxido de Homo sapiens (HS_VKORC1; SEQ ID NO:2) FIGURA 13

Detección de la mutación Y139C (416A>G) de resistencia a warfarina del gen VKORC1 en el genoma de Rattus norvegicus por ARMS-PCR