Polipéptido que tiene actividad de D-lactato deshidrogenasa, un polinucleótido que codifica el polipéptido y procedimiento de preparación de ácido D-láctico.

Polipéptido que es cualquiera de los siguientes (A) a (C):

(A) polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO:

1 ó 2;

(B) polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 1 ó 2, exceptoque de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, eliminado, insertado y/o añadido, cuyo polipéptido tiene actividad de Dlactatodeshidrogenasa; y

(C) polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de no menos del80% con respecto a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO: 1 ó 2, cuyo polipéptido tiene unaactividad de D-lactato deshidrogenasa.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP2010/059306.

Solicitante: TORAY INDUSTRIES, INC..

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 1-1, NIHONBASHI-MUROMACHI 2-CHOME CHUO-KU TOKYO 103-8666 JAPON.

Inventor/es: YAMADA, KATSUSHIGE, SAWAI,HIDEKI, SAWAI,KENJI, SUDA,KAZUMI, YAMAGISHI,JUNYA.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N1/15 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N1/19 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N1/21 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/09 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
  • C12N9/00 C12N […] › Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas.
  • C12N9/04 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre grupos CHOH como dadores, p. ej. glucosa oxidasa de glucosa, deshidrogenasa láctica (1.1).
  • C12P7/56 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 7/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen oxígeno. › Acido láctico.

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Fragmento de la descripción:

Polipéptido que tiene actividad de D-lactato deshidrogenasa, un polinucleótido que codifica el polipéptido y procedimiento de preparación de ácido D-láctico.

SECTOR TÉCNICO

La presente invención se refiere a un nuevo polipéptido para la preparación de ácido D-láctico, cuyo polipéptido tiene actividad de D-lactato deshidrogenasa; un polinucleótido que codifica el polipéptido, y un transformante en el que se introduce el polinucleótido. La presente invención también se refiere a un procedimiento de preparación de ácido Dláctico, que comprende cultivar el transformante.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

A partir de la idea de la neutralidad del carbono, se le ha prestado mucha atención a los ácidos polilácticos (PLA) , que utilizan un recurso renovable, la biomasa, como material de partida. Los PLA son relativamente baratos y resistentes al calor, teniendo un punto de fusión aproximadamente de 170ºC; por lo tanto, se espera que sean polímeros biodegradables que pueden ser moldeados en fusión. Además, se conoce que un ácido poliláctico estereocomplejo se puede obtener mediante la mezcla de ácido poli-L-láctico y ácido poli-D-láctico (documentos de patente 1 a 3) . Se sabe que el ácido poliláctico estereocomplejo presenta un punto de fusión más elevado y mayor cristalizabilidad en comparación con los polímeros individuales y proporciona artículos moldeados útiles tales como artículos moldeados de fibras, de películas y de resina. Para ambos materiales de partida del mismo, ácido L-láctico y ácido D-láctico, existe una demanda de disponer de un procedimiento de preparación de los mismos con alta pureza y alta eficiencia.

En la naturaleza, existen bacterias que producen ácidos lácticos de manera eficiente, tales como las bacterias del ácido láctico, y algunos de los procedimientos de preparación de ácido láctico que utilizan dichas bacterias ya han sido objetivo de una utilización práctica. Se incluye entre los ejemplos de bacterias que producen de forma eficiente ácido L-láctico Lactobacillus delbrueckii. Además, como bacterias que producen de manera eficiente ácido D-láctico, son conocidos microorganismos tales como Sporolactobacillus laevolacticus (documento de patente 4) . En cualquiera de estos casos, la cantidad del ácido láctico acumulado alcanzó un alto nivel en el cultivo anaerobio; sin embargo, dado que el ácido D-láctico y el ácido L-láctico se producen como subproductos en la fermentación del ácido L-láctico y en la fermentación del ácido D-láctico, respectivamente, la pureza óptica disminuye. Además, es extremadamente difícil separar estos ácidos lácticos.

Por lo tanto, como procedimiento de preparación de ácido láctico que tiene una pureza óptica elevada, se ha examinado introducir un gen que codifica la L-lactato deshidrogenasa o la D-lactato deshidrogenasa en una levadura que no tiene de forma intrínseca capacidad de producción de ácidos lácticos y someter la levadura a fermentación de ácido L-láctico y de ácido D-láctico (documentos de patente 4 a 6 y documento no de patente 1) . Con respecto a la fermentación de ácido L-láctico por la levadura modificada genéticamente, mediante la introducción de un gen muy activo originado a partir de Xenopus laevis que codifica la L-lactato deshidrogenasa, la fermentación de ácido láctico puede llevarse a cabo de manera eficiente con alta pureza óptica (documento de patente 4) . Por otro lado, con respecto a la fermentación de ácido D-láctico por la levadura modificada genéticamente, aunque se puede obtener ácido D-láctico que tiene una alta pureza óptica de la misma manera como en el caso de la fermentación de ácido L-láctico, el rendimiento de la misma es un problema (documentos de patente 5 y 6 y documento no de patente 1) .

DOCUMENTOS DE LA TÉCNICA ANTERIOR

DOCUMENTOS DE PATENTE

Documento de patente 1: JP S61-36321A Documento de patente 2: JP S63-241024A Documento de patente 3: JP 2000-17163A Documento de patente 4: W02007/043253 Documento de patente 5: JP 2007-074939A Documento de patente 6: W02004/104202

DOCUMENTOS NO DE PATENTE

Documento no de patente 1: Ishida N, y otros, Journal of Bioscience and Bioengineering (2006) , 101, 172-7.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

PROBLEMAS A RESOLVER POR LA INVENCIÓN

Un objetivo de la presente invención es llevar a cabo una fermentación de ácido D-láctico altamente productiva utilizando un polipéptido que tiene una actividad de D-lactato deshidrogenasa mayor que la de los polipéptidos convencionales y un polinucleótido que codifica el polipéptido.

MEDIOS PARA RESOLVER LOS PROBLEMAS

Los presentes inventores estudiaron en profundidad una variedad de D-lactato deshidrogenasas para descubrir un polipéptido que aumenta la producción de ácido D-láctico y también tiene una actividad de D-lactato deshidrogenasa para producir sólo una pequeña cantidad de subproducto; y un polinucleótido que codifica el polipéptido, consiguiendo de este modo la presente invención.

Es decir, la presente invención está constituida, por los siguientes modos.

(1) Un polipéptido que es uno cualquiera de los siguientes (A) a (C) :

(A) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO: 1 ó 2;

(B) un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 1 ó 2, excepto que de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, eliminado, insertado y/o añadido, cuyo polipéptido tiene actividad de Dlactato deshidrogenasa; y

(C) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de no menos del 80% con repecto a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO: 1 ó 2, cuyo polipéptido tiene una actividad de D-lactato deshidrogenasa.

(2) Un polinucleótido que es uno cualquiera de los siguientes (a) a (e) :

(a) un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3 ó 4;

(b) un polinucleótido que tiene la misma secuencia de nucleótidos tal como se muestra en la SEC ID NO: 3 ó 4, excepto que de 1 a 10 nucleótidos se han sustituido, eliminado, insertado y/o añadido, cuyo polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de D-lactato deshidrogenasa;

(c) un polinucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas con la totalidad o una parte del polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3 ó 4 o una cadena complementaria del mismo, cuyo polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de D-LDH;

(d) un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de no menos del 80% con respecto a la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3 ó 4, cuyo polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de D-lactato deshidrogenasa; y

(e) un polinucleótido que codifica el polipéptido según el punto (1) .

(3) Un constructo de ADN en el que están unidos el polinucleótido, según el punto (2) , y un promotor capaz de expresar el polinucleótido.

(4) El constructo de ADN, según el punto (3) , caracterizado porque el promotor descrito anteriormente es un promotor del gen de la piruvato descarboxilasa 1 (gen PDC1) , del gen de la supresión del defecto exponencial 1 (gen SED1) o del gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa 3 (gen TDH3) .

(5) El constructo de ADN, según el punto (3) o (4) , en el que el promotor descrito anteriormente se selecciona entre cualquiera de los siguientes (I) a (III) :

(I) un promotor que tiene con respecto a la secuencia de nucleótidos que se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOs: 5 a 7;

(II) un promotor que tiene una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas con con respecto a la secuencia de nucleótidos que se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOs: 5 a 7 o una secuencia de nucleótidos que comprende una parte de las mismas; y

(III) un promotor que tiene la misma secuencia de nucleótidos tal como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOs: 5 a 7, excepto que uno o varios nucleótidos se han eliminado, sustituido y/o añadido.

(6) Un transformante, en el que se introduce el polinucleótido, según el punto (2) o el constructo de ADN, según cualquiera de los puntos (3) a (5) .

(7) Una levadura transformada, en la que se introduce el polinucleótido, según el punto (2) o el constructo de ADN, según cualquiera de los puntos (3) a (5) .

(8) La levadura transformada, según el punto (7) , en la que, como mínimo, uno entre el gen de la piruvato descarboxilasa 1... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Polipéptido que es cualquiera de los siguientes (A) a (C) :

(A) polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO: 1 ó 2;

(B) polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 1 ó 2, excepto que de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, eliminado, insertado y/o añadido, cuyo polipéptido tiene actividad de Dlactato deshidrogenasa; y

(C) polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de no menos del

80% con respecto a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO: 1 ó 2, cuyo polipéptido tiene una actividad de D-lactato deshidrogenasa.

2. Polinucleótido que es cualquiera de los siguientes (a) a (e) :

(a) polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3 ó 4;

(b) polinucleótido que tiene la misma secuencia de nucleótidos tal como se muestra en la SEC ID No: 3 ó 4, excepto que de 1 a 40 nucleótidos se han sustituido, eliminado, insertado y/o añadido, cuyo polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de D-lactato deshidrogenasa;

(c) polinucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas con la totalidad o una parte del polinucleótido que tiene la

secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3 ó 4 o una cadena complementaria del mismo, cuyo polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una actividad de D-LDH;

(d) polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de no menos del 80% con respecto a la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3 ó 4, cuyo polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una actividad de D-lactato deshidrogenasa; y

(e) polinucleótido que codifica el polipéptido, según la reivindicación 1.

3. Constructo de ADN en el que están relacionados el polinucleótido, según la reivindicación 2, y un promotor capaz de expresar dicho polinucleótido.

4. Constructo de ADN, según la reivindicación 3, caracterizado porque dicho promotor es un promotor del gen de la piruvato descarboxilasa 1 (gen PDC1) , del gen supresor del defecto exponencial 1 (gen SED1) o del gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa 3 (gen TDH3) .

5. Constructo de ADN, según la reivindicación 3 ó 4, en el que dicho promotor se selecciona entre cualquiera de 35 los siguientes (I) a (III) :

(I) promotor que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOs: 5 a 7;

(II) promotor que tiene una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas con respecto a la

secuencia de nucleótidos que se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOs: 5 a 7 o una secuencia de nucleótidos 40 que comprende una parte de las mismas; y

(III) promotor que tiene la misma secuencia de nucleótidos tal como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOs: 5 a 7, excepto que uno o varios nucleótidos se han eliminado, sustituido y/o añadido.

6. Transformante en el que se introduce el polinucleótido, según la reivindicación 2, o el constructo de ADN, según 45 cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

7. Levadura transformada, en la que se introduce el polinucleótido, según la reivindicación 2, o el constructo de ADN, según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

8. Levadura transformada, según la reivindicación 7, en la que, como mínimo, uno entre el gen de la piruvato descarboxilasa 1 (gen PDC1) , el gen de la supresión del defecto exponencial 1 (gen SED1) y el gen gliceraldehído3-fosfato deshidrogenasa 3 (gen TDH3) de dicha levadura transformada se sustituye con el polinucleótido, según la reivindicación 2, o el constructo de ADN, según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

9. Levadura transformada, según la reivindicación 8, en la que, como mínimo, uno de dichos genes es el gen PDC1.

10. Procedimiento de preparación de ácido D-láctico, que comprende la etapa de cultivar el transformante, según la reivindicación 6, o la levadura transformada, según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9. 60

11. Transformante en el que se introduce un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3 ó 4, o el homólogo del polinucleótido mostrado en la SEQ ID NO: 3 ó 4 que codifica la D-lactato deshidrogenasa originada de la familia Limulidae o un constructo de ADN en el que dicho polinucleótido y un promotor capaz de expresar dicho polinucleótido están unidos.

12. Levadura transformada, en la que se introduce el polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3 ó 4, o el homólogo del polinucleótido mostrado en la SEQ ID NO: 3 ó 4 que codifica la D-lactato deshidrogenasa originada de la familia Limulidae o un constructo de ADN en el que dicho polinucleótido y un promotor capaz de expresar dicho polinucleótido están unidos.

13. Levadura transformada, según la reivindicación 12, en la que, como mínimo, uno entre el gen de la piruvato descarboxilasa 1 (gen PDC1) , el gen de la supresión del defecto exponencial 1 (gen SED1) y el gen gliceraldehído3-fosfato deshidrogenasa 3 (gen TDH3) de dicha levadura transformada se sustituye con el polinucleótido que codifica dicha D-lactato deshidrogenasa originada de la familia Limulidae o se introduce dicho constructo de ADN, en el que dicho polinucleótido y un promotor capaz de expresar dicho polinucleótido están unidos.

14. Procedimiento de preparación de ácido D-láctico, que comprende la etapa de cultivar el transformante, según la reivindicación 11, o la levadura transformada, según la reivindicación 12 ó 13.


 

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