Polipéptido ICBP90 y sus fragmentos, polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos y aplicaciones para el diagnóstico y el tratamiento del cáncer.

Polipéptido aislado denominado ICBP90 (inverted CCAAT box, binding protein 90) de secuencia aminoacídica SEQ ID Nº 2.

Polipéptido ICBP90 y sus fragmentos, polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos y aplicaciones para el diagnóstico y el tratamiento del cáncer La presente invención se refiere a un nuevo polipéptido ICBP90 y a sus fragmentos, a la clonación del ADNc y los polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos, a vectores de clonación y/o de expresión que incluyen dichos polinucleótidos, a células transformadas por dichos vectores y a anticuerpos específicos dirigidos contra dichos polipéptidos. La invención se refiere igualmente a procedimientos y a kits de diagnóstico de cánceres, a un procedimiento y un kit de cribado de ligandos del polipéptido de la invención y a compuestos utilizables a modo de medicamento para la prevención y/o el tratamiento de cánceres.

Las ADN topoisomerasas son proteínas nucleares altamente conservadas en el transcurso de la evolución cuyo papel principal es controlar la conformación y topología del ADN en el núcleo, que se alteran constantemente por los diferentes procesos biológicos que implican el ADN, tales como por ejemplo transcripción y replicación. Las topoisomerasas ejercen su acción cortando el ADN y religando estas lesiones después de realizar el cambio conformacional adecuado.

En los mamíferos, y en particular el hombre, existen actualmente al menos cinco genes diferentes que codifican una topoisomerasa y al menos dos seudogenes adicionales (para revisión, véase Nitiss 1998) . Así, la topoisomerasa I, codificada por el gen TOP1, retira los supergiros presentes en el ADN cortando solo una hebra. Las dos topoisomerasas de tipo II que existen en el hombre, denominadas TopIIa y TopIIº, alteran la topología del ADN al introducir escisiones bicatenarias transitorias (para revisión, véase Wang 1996) . Por último, existen dos topoisomerasas de tipo III codificadas por dos genes localizados en 17p 11.2-12 y 22q 11-12 y que actúan únicamente sobre los supergiros negativos del ADN.

En las células tumorales, las topoisomerasas de tipo II desempeñan un papel muy importante; en estas células en crecimiento y división rápida, existe una gran necesidad de mantener las moléculas de ADN en una conformación correcta, ya que son necesarias tasas de transcripción y replicación elevadas. Así, las tasas de topoisomerasas II son generalmente más elevadas en las células tumorales humanas que en los tejidos normales del mismo origen. Sin embargo, la tasa de expresión elevada de la topoisomerasa IIa en las células tumorales puede variar entre dos tumores de naturaleza diferente que afectan al mismo tejido. Por ejemplo, el núcleo de células de carcinoma pulmonar microcítico presenta una tasa más elevada de topoisomerasa IIa que el núcleo de células de carcinomas pulmonares no microcíticos (Guinee et al., 1996) . De la misma manera, la tasa de topoisomerasa IIa en células A549 es tres veces más elevada en que células PC3, procediendo estas dos líneas celulares de adenocarcinoma de epitelio pulmonar (Yamasaki et al., 1996) .

Estas comprobaciones hacen pensar que la topoisomerasa IIa puede considerarse como un marcador de proliferación celular para ciertos tipos de cáncer. El proceso canceroso se caracteriza por una proliferación celular anormal debida en parte a la pérdida de la inhibición por contacto, así pues, la topoisomerasa IIa parece una diana privilegiada de fármacos quimioterapéuticos para el tratamiento del cáncer (Pommier et al. 1994) , y los tratamientos anticancerosos actuales recurren en gran medida a inhibidores de topoisomerasas.

La mayoría de estos inhibidores ejercen sus efectos citotóxicos estabilizando el complejo de escisión de ADN. Los fármacos como las antraciclinas [doxorubicina (adriamicina) o epipodofilotoxinas (tal como etopósido (VP-16) o tenipósido (VM26) ) ], acridinas (tal como mAMSA) y antracenodionas (por ejemplo, mitoxantrona) son ejemplos de fármacos inhibidores de topoisomerasas II que estabilizan el complejo de escisión. Más recientemente, se ha desarrollado una nueva clase de inhibidores de topoisomerasas II; estos inhibidores actúan al nivel de la actividad catalítica y no estabilizan ya el complejo de escisión. El fármaco fostriecina es un ejemplo de ellos (Boritzki et al., 1988) . A día de hoy, se utilizan estos diferentes fármacos en tratamientos anticancerosos curativos y paliativos.

No obstante, uno de los mayores problemas encontrados en los tratamientos anticancerosos actuales que utilizan inhibidores de topoisomerasa es la emergencia de resistencia a fármacos (Kubo et al., 1995) . Estas resistencias son o bien por la sobreexpresión de las bombas que permite el flujo de salida de fármacos al exterior de las células antes de que alcancen su diana (por ejemplo, P-glucoproteína, proteína asociada a la multirresistencia de fármacos (MRP) ) , o bien por el cambio de la tasa de expresión de topoisomerasa IIa (Deffie et al., 1989; Fr y et al., 1991) , o bien por los dos (para revisión, véase Isaacs et al., 1998) .

Así pues, uno de los aspectos de la presente invención es comprender los mecanismos de regulación de la expresión del gen de topoisomerasa IIa con el fin de desarrollar una alternativa al fenómeno de resistencia a los fármacos observado para ciertos cánceres, y esto con el enfoque de mejorar el tratamiento preventivo y curativos de los cánceres.

Existen dos tipos de topoisomerasas de tipo II que difieren en su perfil de expresión: la topoisomerasa IIa (Top IIa) (170 kDa) , localizada esencialmente en el nucleoplasma al nivel de los centrómeros de los cromosomas mitóticos, interviene en procesos biológicos fundamentales como son replicación, condensación de cromosomas y transcripción. La topoisomerasa IIº (Top IIº) (180 kDa) parece estar más bien implicada en la transcripción de ARN ribosómicos dada la localización nucleolar de esta enzima. Las dos topoisomerasas de tipo II humanas están localizadas en dos cromosomas diferentes (17q21-22 para la topoisomerasa IIa y 3p24 para la topoisomerasa II ) (Tsai-Plugfelder et al., 1988; Drake et al., 1989; Chung et al., 1989; Jenkins et al., 1992; Austin et al., 1993) .

Al contrario que la topoisomerasa IIº, cuya expresión se caracteriza por una constancia relativa, la topoisomerasa IIa presenta una variación de la expresión en función del estado de proliferación de las células y de su posición en el ciclo celular. La expresión del ARN mensajero (ARNm) es más elevada en las células en proliferación que en las células detenidas en confluencia. La expresión de la topoisomerasa IIa aumenta en el transcurso de la fase S del ciclo celular, alcanzando un máximo al final de la fase G2/M (Goswami et al., 1996) , y siendo el nivel de ARN mensajero diez veces más elevado al final de la fase S que durante la fase G1. Igualmente, parece existir un acoplamiento entre la síntesis y la degradación de topoisomerasa IIa y la condensación/descondensación cromosómica (Heck et al., 1988) .

Los conocimientos actuales referentes a la regulación del gen de topoisomerasa IIa resultan en conjunto bastante escasos. Recientemente, se ha descrito una región promotora de aproximadamente 650 pares de bases por Hochhauser et al. (1992) , que presenta todas las características de un gen doméstico, siendo dos ejemplos la ausencia de la secuencia TATA y la riqueza moderada de sitios GC (presencia especialmente de una secuencia Sp1 que puede reemplazar a la secuencia TATA) . La presencia de 5 secuencias CCAAT invertidas o ICB (inverted CCAAT box en inglés) es otra particularidad de este tipo de promotor.

Se han descrito factores de transcripción que interaccionan con el promotor del gen de topoisomerasa IIa humana; se pueden citar c-myb (Brandt et al., 1997) , p53 (Sandri et al., 1996) , ATF (Lim et al., 1998) , Sp1 y Sp3 (Kubo et al., 1995) . Cualesquiera que sean, aparte de NF-Y (igualmente denominado CBF, ACF y CP1, referencia en Isaacs et al., 1996) , los factores de transcripción que actúan sobre las secuencias ICB del promotor del gen de topoisomerasa IIa humana no se han identificado y caracterizado todos todavía; sin embargo, Herzog y Zwelling (1997) han determinado dos proteínas de un peso molecular aparente de 90 kDa y 140 kDa que ligan ICB1 respectivamente con ICB4 e ICB5. Isaacs y sus colaboradores (1996) han propuesto que el NFY, así como otra proteína no identificada, reconocen una secuencia ICB de la región promotora del gen de topoisomerasa IIa; han mostrado igualmente que las mutaciones de ICB2 anulaban completamente la disminución de la actividad promotora observada normalmente en las células detenidas en confluencia (Isaac et al., 1996) . Han identificado... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido aislado denominado ICBP90 (inverted CCAAT box, binding protein 90) de secuencia aminoacídica SEQ ID Nº 2.

2. Polipéptido aislado caracterizado porque comprende un polipéptido elegido entre los polipéptidos de secuencias SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 4, SEQ ID Nº 6, SEQ ID Nº 8 o el fragmento C-terminal a partir del residuo D263 de la SEQ ID Nº 2.

3. Polipéptido según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la secuencia de ADN con la que se liga dicho polipéptido es una secuencia CCAAT, preferiblemente una secuencia CCAAT inversa (inverted ccaat box:icb ICB) .

4. Polinucleótido aislado caracterizado porque codifica un polipéptido según la reivindicación 1.

5. Polinucleótido según la reivindicación 4 de secuencia SEQ ID Nº 1.

6. Polinucleótido aislado caracterizado porque comprende un polinucleótido elegido entre un polinucleótido de secuencias SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 3, SEQ ID Nº 5, SEQ ID Nº 7 o que codifica el fragmento C-terminal a partir del residuo D263 de la SEQ ID Nº 2.

7. Vector recombinante de clonación de un polinucleótido según una de las reivindicaciones 4 a 6 y/o de expresión de un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque contiene un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

8. Vector según la reivindicación 7 caracterizado porque incluye los elementos que permiten la expresión y eventualmente la secreción de dicho polipéptido en una célula hospedadora.

9. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, caracterizado porque los elementos que permiten la expresión de dicho polipéptido se eligen entre: a) el polinucleótido aislado de secuencia SED ID Nº 12;

b) un polinucleótido cuya secuencia es complementaria de la secuencia del polinucleótido definido en a) ; c) un polinucleótido cuya secuencia comprende al menos un 80% de identidad con un polinucleótido definido en a) o b) ;

d) un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con una secuencia del polinucleótido definido en a) , b) o c) .

10. Célula hospedadora caracterizada porque comprende un vector según una de las reivindicaciones 7, 8 y 9.

11. Procedimiento de preparación de un polipéptido recombinante caracterizado porque se cultiva una célula hospedadora según la reivindicación 10 en condiciones que permiten la expresión y eventualmente la secreción de dicho polipéptido recombinante y porque se recupera dicho polipéptido recombinante.

12. Polipéptido recombinante susceptible de obtenerse mediante un procedimiento según la reivindicación 11.

13. Anticuerpo monoclonal o policlonal y sus fragmentos, caracterizado porque se liga específicamente con un polipéptido elegido entre: SEQ ID NO: 2, 4, 6 o 8.

14. Procedimiento de detección y/o valoración de un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3 en una muestra biológica, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a) puesta en contacto de la muestra biológica con un anticuerpo según la reivindicación 13; b) determinación del complejo antígeno-anticuerpo formado.

15. Estuche para la aplicación de un procedimiento según la reivindicación 14 en una muestra biológica mediante reacción inmunológica, caracterizado porque comprende los elementos siguientes: a) un anticuerpo monoclonal o policlonal según la reivindicación 13;

b) llegado el caso, los reactivos para la constitución del medio propicio a la reacción inmunológica; c) los reactivos que permiten la detección del complejo antígeno-anticuerpo producido por la reacción inmunológica.

16. Procedimiento según la reivindicación 14 para el diagnóstico de proliferación celular.

17. Procedimiento de cribado de ligando susceptible de afectar a la actividad transcripcional de un gen cuyo promotor comprende las secuencias CCAAT y/o CCAAT inversa (ICB) susceptibles de ligarse con un polipéptido según las reivindicaciones 1 a 8 y que incluye las etapas siguientes:

a) puesta en contacto de dicho polipéptido y de uno o varios ligandos potenciales en presencia de los reactivos necesarios para la aplicación de una reacción de transcripción;

b) detección y/o medida de la actividad transcripcional.

18. Procedimiento de cribado de ligando susceptible de afectar a la función de "receptor nuclear" del polipéptido según las reivindicaciones 1 a 3 y que comprende las etapas siguientes:

a) puesta en contacto de dicho polipéptido y de uno o varios ligandos potenciales en presencia de los reactivos necesarios;

b) detección y/o medida de la actividad transcripcional de un gen cuyo promotor comprende las secuencias CCAAT y/o CCAAT inversa (ICB) susceptibles de ligarse con dicho polipéptido.

19. Estuche para llevar a cabo un procedimiento según las reivindicaciones 17 y 18 en una muestra biológica, caracterizado porque comprende los elementos siguientes: a) un polipéptido según las reivindicaciones 1 a 3;

b) un ligando; c) los reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción de transcripción.

20. Compuesto caracterizado porque se elige entre: a) un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3; b) un polinucleótido según una de las reivindicaciones 4 a 6; c) un vector según una de las reivindicaciones 7 a 9; d) una célula según la reivindicación 10; e) un anticuerpo según la reivindicación 13; a modo de medicamento.

21. Compuesto según la reivindicación 20 a modo de medicamento destinado a la prevención y/o el tratamiento del cáncer.

22. Utilización de un compuesto según las reivindicaciones 20 y 21 para la preparación de un medicamento destinado a modular, aumentar o disminuir la proliferación celular.

23. Composición farmacéutica para el tratamiento preventivo y curativo del cáncer, caracterizada porque contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto según una de las reivindicaciones 20 y 21 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

24. Composición farmacéutica caracterizada porque comprende un anticuerpo según la reivindicación 13 como agente orientador conjugado con al menos un agente seleccionado entre el grupo de agentes antiproliferativos, antineoplásicos o citotóxicos.

25. Producto que comprende al menos un compuesto según las reivindicaciones 20 y 21 y al menos otro agente anticanceroso como producto de combinación para una utilización simultánea, separada o extendida en el tiempo en terapia anticancerosa.

26. Composición para la detección, localización y formación de imágenes de cánceres, que comprende un anticuerpo según la reivindicación 13, estando el anticuerpo marcado directa o indirectamente con un marcador generador de señal seleccionado entre los isótopos radiactivos y las entidades no isotópicas.