Polinucleótido de Haemophilus parasuis, caracterizado porque codifica un polipéptido que presenta una identidad de al menos el 70%,

80% ó 90% con un polipéptido definido por la SEC ID NO: 2.

Polinucleótidos de Haemophilus parasuis y su uso

Campo de la técnica

La presente invención se encuadra en el campo del desarrollo de vacunas contra Haemophilus parasuis que comprenden polipéptidos obtenidos por tecnología recombinante.

Estado de la técnica anterior

La bacteria H. parasuis es el agente causante de la enfermedad de GlÃsser (poliserositis-artritis porcina) que tiene repercusiones económicas importantes en la industria porcina.

Se considera que la inmunidad materna aportada por el calostro es un factor determinante para la prevención de la enfermedad. La práctica del destete precoz de los lechones ha incrementado la frecuencia de esta enfermedad y ha aumentado la utilización de vacunas.

H. parasuis es una bacteria comensal del tracto respiratorio superior que sólo causa enfermedad cuando llega a colonizar el tracto respiratorio inferior y en particular los pulmones, provocando neumonías.

Ciertas cepas de alta virulencia cruzan la barrera pulmonar y colonizan tejidos séricos provocando serositis, pericarditis, artritis y en ciertas circunstancias meningitis. Consecuentemente, ciertas cepas de H. parasuis tienen el poder de colonizar e invadir eficazmente numerosos tejidos contrariamente a las cepas avirulentas que se quedan localizadas en el tracto respiratorio superior.

Una de las características primordiales de H. parasuis es su variabilidad antigénica, que reduce en gran medida la eficacia de las vacunas.

Existen por lo menos 15 serotipos, ya que un número importante de cepas no son tipificables, y cuando se procede a infecciones experimentales en cerdos el grado de virulencia es variable según la cepa.

Kielstein et al., J. Clin. Micro. 30: 4: 862 (1992) describe que existe una correlación entre serotipos y el grado de virulencia de la cepa. Se considera que las cepas de serotipo 1, 5, 10 y 12 son de gran virulencia mientras que las de serotipo 2, 4 y 15 son moderadamente virulentas y las de serotipo 3, 6, 7, 9 y 11 son avirulentas. Sin embargo, esta clasificación serológica no es absoluta y en la práctica se observan numerosas excepciones a esta regla.

No se conoce un método de diagnóstico comercial para clasificar las cepas de H. parasuis en virulentas y avirulentas, por lo que sería deseable disponer de un método que permitiera determinar si una cepa de H. parasuis es virulenta o no, sin tener que esperar a que se pusieran de manifiesto los síntomas de la enfermedad, y poder proceder al eventual tratamiento de la misma sin demora.

Para proteger cerdos contra H. parasuis se emplean vacunas que comprenden bacterias inactivadas (bacterinas) , pero la eficacia es limitada porque inducen una respuesta inmune humoral dirigida esencialmente contra lipopolisacáridos que pueden variar de una cepa a otra.

En la solicitud de patente WO-A-00/01408 se describen vacunas contra las infecciones causadas por H.parasuis que utilizan un extracto celular de bacterias que tiene una actividad tóxica cuando se administra a cerdos por vía intraperitoneal, pero que ejerce una acción protectora cuando se administra por vía intramuscular en presencia de un adyuvante.

Por el momento no se ha caracterizado la naturaleza molecular de los antígenos responsables de la respuesta inmune y de la protección. Solamente se conoce que la actividad tóxica del extracto celular reside en una fracción proteica de alto peso molecular.

Esto se ha observado también en el caso de otra especie como es Haemophilus influenzae, ya que Hendrixson et al., Mol. Cell. 2: 841 (1998) describe que las moléculas responsables de la colonización e invasión de tejidos son glicoproteínas de membrana con propiedades de autotransporte, denominadas adhesinas, invasinas o hemaglutininas.

Para dicha especie H.influenzae, en la solicitud de patente WO-A-96/30519 se describen vacunas contra las infecciones causadas por dicha bacteria que contienen proteínas de adhesión obtenidas mediante tecnología recombinante.

No obstante, el principal inconveniente para desarrollar vacunas que confieran una buena protección inmunológica, reside en el desconocimiento existente sobre el genoma de H.parasuis, y en particular sobre los polinucleótidos que codifican las adhesinas, invasinas o hemaglutininas de H.parasuis.

Subsiste pues la necesidad de disponer de vacunas eficaces contra las infecciones causadas por H. parasuis.

Los autores de esta invención han desarrollado una vacuna contra las infecciones causadas por H.parasuis que incluye polipéptidos obtenidos mediante tecnología recombinante.

Objeto de la invención

El objeto de la presente invención es proporcionar polinucleótidos de H. parasuis.

En un segundo aspecto la invención tiene también por objeto los polipéptidos expresados por los polinucleótidos de la invención.

En un tercer aspecto la invención tiene también por objeto un vector de expresión que comprende al menos un polinucleótido de H. parasuis de la invención.

En un cuarto aspecto la invención tiene también por objeto una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende al menos un polinucleótido de H. parasuis de la invención.

En un quinto aspecto la invención tiene también por objeto un procedimiento para la preparación de los polipéptidos recombinantes de H. parasuis.

En un sexto aspecto, la invención tiene también por objeto el uso de los polipéptidos de la invención para la preparación de vacunas y/o composiciones inmunogénicas.

En un séptimo aspecto, la invención tiene también por objeto una vacuna contra las infecciones causadas por H.parasuis.

En un octavo aspecto, la invención tiene también por objeto el uso de los polinucleótidos para determinar si una cepa de H. parasuis es virulenta o avirulenta.

En un noveno aspecto, la invención tiene también por objeto un kit para determinar si una cepa de H. parasuis es virulenta o avirulenta.

Descripción de las figuras

Figura 1

En la Figura 1 se muestra un diagrama de las diferentes etapas técnicas que conducen a la secuenciación y anotación de los genes y proteínas codificante para polipéptidos considerados autotransportadores, adhesinas, invasinas o hemaglutininas de H. parasuis.

Figura 2

En la Figura 2 se muestra la alineación múltiple de las partes 3' terminales de los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de H. parasuis. Los polinucleótidos se pueden agrupar en tres grupos estructurales denominados grupo 1, grupo 2, y grupo 3. El grupo 1 comprende los nucleótidos SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, y SEC ID NO: 25. El grupo 2 comprende los nucleótidos SEC ID NO: 5, y SEC ID NO: 11. El grupo 3 comprende los nucleótidos SEC ID NO: 13, y SEC ID NO: 17. El polinucleótido definido por la secuencia SEC ID NO: 15 se considera que pertenece al grupo1, pero no se puede introducir en la alineación múltiple de todos los polinucleótidos porque le falta un fragmento de la parte 3' terminal. Las alineaciones múltiples se consiguen aplicando el programa CLUSTALX descrito en Thompson et al., Nucleic Acids Res. 25: 4876 (1997) .

Figura 3

En la Figura 3 se muestra la alineación múltiple de los polinucleótidos que codifican las partes 5' terminales de los polipéptidos de H. parasuis. Se observa una buena conservación en los 206 nucleótidos, y la identidad es completa para los 36 primeros nucleótidos.

Figura 4

En la Figura 4 se muestra la alineación múltiple de los aminoácidos de los polipéptidos de H. parasuis. Los polipéptidos pueden agruparse en tres grupos estructurales denominados grupo1, grupo 2, y grupo 3. El grupo 1 comprende los polipéptidos SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24 y SEC ID NO: 26. El grupo 2 comprende los polipéptidos SEC ID NO: 6, y SEC ID NO: 12. El grupo 3 comprende los polipéptidos SEC ID NO: 14, y SEC ID NO: 18.

Figura 5

En la Figura 5 se muestra la electroforesis por gel de agarosa de los productos de amplificación de los polinucleótidos de la invención de varias cepas virulentas y no virulentas de H. parasuis.

En la Figura 5A se presentan los productos de amplificación... [Seguir leyendo]

1. Polinucleótido de Haemophilus parasuis, caracterizado porque codifica un polipéptido que presenta una identidad de al menos el 70%, 80% ó 90% con un polipéptido definido por la SEC ID NO: 2.

2. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado porque tiene una secuencia capaz de hibridarse, en condiciones de alta astringencia, a la secuencia SEC ID NO: 1.

3. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado porque tiene la secuencia SEC ID NO: 1.

4. Polipéptido de Haemophilus parasuis, caracterizado porque presenta una identidad de al menos el 70%, 80% ó 90% con un polipéptido definido por la SEC ID NO: 2.

5. Polipéptido según la reivindicación 4, caracterizado porque tiene la secuencia SEC ID NO: 2.

6. Vector de expresión caracterizado porque comprende un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

7. Célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

8. Procedimiento para la preparación de los polipéptidos de las reivindicaciones 4-5, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión de la reivindicación 7, y b) expresar dicho polinucleótido para producir dicho polipéptido.

9. Uso de los polipéptidos de las reivindicaciones 4-5 para la preparación de vacunas y/o composiciones inmunogénicas para el tratamiento profiláctico o terapéutico de la infección causada por H. parasuis en un animal.

10. Vacuna contra H. parasuis, caracterizada porque comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un polipéptido de las reivindicaciones 4-5, y un agente auxiliar.

11. Uso de los polinucleótidos de las reivindicaciones 1 a 3 para determinar si una cepa de H. parasuis es virulenta o avirulenta, en el que dicha determinación se lleva a cabo mediante una amplificación in vitro.

12. Kit para determinar si una cepa de H. parasuis es virulenta o avirulenta, caracterizado porque comprende:

a) los productos de amplificación de los polinucleótidos con la SEC ID NO: 1, b) el oligonucleótido pADH-F (SEC ID NO: 27) , c) los oligonucleótidos pADH-R1 (SEC ID NO: 28) , pADH-R2 (SEC ID NO: 29) , y pADH-R3 (SEC ID NO: 30) , y d) los reactivos necesarios para llevar a cabo la amplificación mediante la técnica de PCR.

FIGURA 1

1. Cultivo de Haemophilus parasuis sobre agar chocolate 4. Purificación de fragmentos de 300 a 1.500 pb

5. Clonación en pUC19

6. Selección de clones recombinantes 7. Purificación del plásmido recombinante 8. Secuenciación de los insertos 10. Anotación de los contigs por comparación en el GenBank

FIGURA 2

- : Indica una deleción, .: Indica una identidad

FIGURA 3 FIGURA 4

- : Indica una deleción, .: Indica una identidad

FIGURA 5A

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Kb 10

FIGURA 5B

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FIGURA 5C

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FIGURA 6