Plasmina modificada de forma recombinante.

Polipéptido para la utilización como medicamento, en el que el polipéptido se selecciona de

a) un polipéptido que tiene un único dominio kringle N-terminal que es,

como mínimo, el 90% idéntico al dominio kringle 1 del plasminógeno humano nativo, y un dominio C-terminal que comprende un sitio de activación y un dominio serina proteasa, dicho dominio C-terminal es, como mínimo, el 90% idéntico al sitio de activación y al dominio serina proteasa del plasminógeno humano; en el que el polipéptido se une a lisina inmovilizada, o

b) un polipéptido que tiene un único dominio kringle N-terminal homólogo al dominio kringle1 del plasminógenonativo; y un dominio C-terminal que comprende un sitio de activación y un dominio serina proteasa, dicho dominio C-terminal es homólogo al sitio de activación y al dominio serina proteasa del plasminógeno humano; en el que el polipéptido se une a lisina inmovilizada y en el que el polipéptido es SEQ ID NO: 2 con no más de 30 sustituciones de aminoácidos, o

c) un polipéptido que tiene un único dominio kringleN-terminal homólogo al dominio kringle 1 del plasminógeno nativo; y un dominio C-terminal que comprende un sitio de activación y un dominio serina proteasa, dicho dominio C-terminal es homólogo al sitio de activación y al dominio serina proteasa del plasminógeno humano; en el que el polipéptido se une a lisina inmovilizada, y en el que el polipéptido es, como mínimo, el 90%, 95%, o 98% idéntico a la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 2.

Plasmina modificada de forma recombinante Antecedentes de la invención

El plasminógeno humano es una proteína de cadena sencilla que contiene 791 residuos de aminoácido. La activación del plasminógeno a plasmita es el resultado de una digestión singular del enlace peptídico de Arg561-Val562 en el zimógeno. La molécula de plasmina resultante, es una serina proteasa de doble cadena enlazada por puentes disulfuro con carácter específico tipo tripsina (digiere después de Lys y Arg).

La cadena pesada amino-terminal de la plasmina (residuos 1-561, ~60 kDa) comprende cinco dominios kringle, cada uno conteniendo aproximadamente 80 residuos de aminoácido. Los dominios kringle son responsables de las propiedades reguladoras del plasminógeno, tales como interacción con inhibidores de activación, por ejemplo, iones CI'1; con estimuladores de activación, por ejemplo, ácido £-aminocaproico; con células bacterianas y de mamífero; y con otras proteínas, tales como el substrato fisiológico de la plasmina fibrina, y el inhibidor de la plasmina a2-antiplasmina. De los cinco kringles, el kringle 1 es uno de los más multifuncionales: se ha demostrado que su actividad de unión a lisina es responsable de la interacción de la plasmina con la a2-antiplasmina y la fibrina. Véase Wiman, B., y otros, Biochima. Blophys. Acta 579: 142-154 (1979); y Lucas, M. A., y otros, J. Blol. Chem. 258: 4249-4256 (1983).

La cadena ligera C-terminal de la plasmina (residuos 562-791, -25 kDa) es una serina proteasa típica, homologa a la tripsina, y contiene la tríada catalítica clásica de serina proteasa: His603, Asp646 y Ser741. El plasminógeno contiene 24 puentes disulfuro y dos sitios de glucosilación, en Asn289 y Thr346.

Se ha mostrado que la proteólisis limitada del plasminógeno por elastasa da como resultado tres fragmentos (Sottrup-Jensen, L., y otros., Prog. Chem. Fibrinol. Thrombol., 3: 191-209 (1978)). El primer fragmento, K1-3, incluye los tres primeros kringles, y puede aislarse en dos versiones, Tyr79-Val338 y Tyr79-Val354. El segundo fragmento, K4, corresponde al cuarto kringle e incluye los residuos Val355-Ala440. El último fragmento C-terminal (llamado también mlnlplasmlnógeno), Incluye los residuos Val443-Asn791, y comprende el quinto kringle y el dominio de serina proteasa. El miniplasmlnógeno puede ser activado de la misma forma que el plasminógeno, formando miniplasmina.

Debido a la estructura compleja de la molécula de plasminógeno de longitud completa, los sistemas de expresión bacterianos no han demostrado ser útiles para la producción de plasminógeno recombinante. El plasminógeno es producido en la forma de cuerpos de inclusión insolubles, y no es replegable a partir de ese estado. Además, la expresión del plasminógeno en células de mamífero es complicada por la activación ¡ntracelular de plasminógeno en plasmina y la citotoxicidad resultante. Es posible la producción de plasminógeno completamente activo utilizando células de insecto; sin embargo, este sistema no es adecuado para producción a gran escala debido al bajo rendimiento.

Por consiguiente, es deseable una proteína recombinante modificada que posea las características deseables de la plasmina y el plasminógeno, mientras que carezca de ciertas características negativas y que sea capaz de ser producida en células bacterianas en cantidades sustanciales.

Características de la invención

La presente invención proporciona un polipéptido para su utilización como medicamento, en el que el polipéptido se selecciona de:

a) un polipéptido que tiene un único dominio kringle N-terminal que es, como mínimo, el 90% idéntico al dominio de kringle 1 del plasminógeno humano nativo; y un dominio C-terminal que comprende un sitio de activación y un dominio serina proteasa, siendo el dominio C-terminal, como mínimo, el 90% idéntico al sitio de activación y al dominio serina proteasa del plasminógeno humano; en el que el polipéptido se une a lisina inmovilizada.

b) un polipéptido que tiene un único dominio kringle N-terminal homólogo al dominio kringle 1 del plasminógeno nativo; y un dominio C-terminal que comprende un sitio de activación y un dominio serina proteasa, siendo el dominio C-terminal homólogo al sitio de activación y al dominio serina proteasa del plasminógeno humano; en el que el polipéptido se une a lisina inmovilizada, y en el que el polipéptido es SEQ ID NO: 2 con no más de 30 sustituciones de aminoácidos, o

c) un polipéptido que tiene un único dominio kringle N-terminal homólogo al dominio kringle 1 del plasminógeno nativo;un dominio C-terminal que comprende un sitio de activación y un dominio serina proteasa, siendo el dominio C-terminal homólogo al sitio de activación y al dominio serina proteasa del plasminógeno humano; en el que el polipéptido se une a

lisina inmovilizada, y en el que el polipéptido es, como mínimo, el 90%, 95% o 98% idéntico a la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 2.

En algunas realizaciones, el polipéptido codificado es, como mínimo, el 90%, 95% o 98% idéntico a la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2. Además, el polipéptido codificado puede ser la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2.

La secuencia de nucleótidos del polinucleótido puede ser la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1, o variaciones degeneradas de la misma. La secuencia de nucleótidos puede codificar un polipéptido que tenga un dominio kringle N-terminal homólogo al dominio kringle 1 del plasminógeno humano nativo; y un sitio de activación del dominio C-terminal y dominio de serina proteasa homólogos a los dominios correspondientes en el plasminógeno humano. La secuencia de nucleótidos puede codificar también un polipéptido que tenga un único dominio kringle N-terminal como mínimo 90% idéntico al dominio kringle 1 del plasminógeno humano nativo; y un dominio C-terminal como mínimo 90% idéntico al sitio de activación y dominio de serina proteasa del plasminógeno humano. Los polipéptidos codificados pueden unirse a lisina inmovilizada.

En algunas realizaciones, los polipéptidos pueden mostrar una actividad fibrinolítica que es inhibida por os-antiplasmina a una velocidad que es como mínimo aproximadamente 5 veces más rápida, que la velocidad de inhibición de la actividad fibrinolítica de miniplasmina por os-antiplasmina. La velocidad de inhibición por os-antiplasmina puede ser también como mínimo aproximadamente 10 veces, 20 veces, 30 veces o 40 veces más rápida, que la velocidad de inhibición de miniplasmina.

En algunas realizaciones, los polipéptidos pueden unirse a lisina inmovilizada. La lisina inmovilizada puede ser lisina unida a una matriz de soporte sólida seleccionada del grupo que comprende lisina-agarosa, lisina-BIOGEL (BioRad, Hercules, CA), Ilslna-HYPERD (Pall Ufe Sciences, East Hills, NY, una lisina-hidrogel) y lisina-SEPHAROSA (SEPHAROSA es agarosa entrelazada). La lisina inmovilizada puede ser lisina-SEPHAROSA.

En algunas realizaciones, los polipéptidos pueden mostrar una afinidad de unión menor por el fibrinógeno, que la afinidad de unión por el fibrinógeno de la miniplasmina.

En algunas realizaciones, los polipéptidos pueden mostrar mayor afinidad de unión por la fibrina parcialmente digerida, que la afinidad de unión por la fibrina parcialmente digerida de la miniplasmina.

Los polipéptidos pueden tener un único dominio kringle localizado N-termlnal a un sitio de activación de plasminógeno y dominio de serina proteasa del plasminógeno, en el que el dominio kringle tiene identidad de secuencias de aminoácidos como mínimo un residuo más grande con kringle 1 del plasminógeno humano nativo, que con kringle 5 del plasminógeno humano nativo. Se entenderá que no se consideraría que las sustituciones conservadoras de las regiones kringle de los polipéptidos de la presente invención, respecto a las secuencias nativas de los kringles 1 del plasminógeno humano, difieren de las secuencias nativas para los propósitos de comparación de identidad con kringle 5.

En algunas realizaciones, los polipéptidos pueden tener la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 2, y sustituciones conservadoras de la misma. Los polipéptidos pueden tener un residuo en una posición relativa análoga a la de la posición 76 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, que es arginina.

En otro aspecto, la presente invención incluye vectores que comprenden los polinucleótidos de la presente invención, y células huésped cultivadas que comprenden los vectores.

Descripción breve de los dibujos

La figura 1 es una representación esquemática de la plasmina nativa después de la activación por digestión proteolítica. K1-K5 son las reglones kringle... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido para la utilización como medicamento, en el que el polipéptido se selecciona de

a) un polipéptido que tiene un único dominio kringle N-terminal que es, como mínimo, el 90% idéntico al dominio kringle 1 del plasminógeno humano nativo, y un dominio C-terminal que comprende un sitio de activación y un dominio serina proteasa, dicho dominio C-terminal es, como mínimo, el 90% idéntico al sitio de activación y al dominio serina proteasa del plasminógeno humano; en el que el polipéptido se une a lisina inmovilizada, o

b) un polipéptido que tiene un único dominio kringle N-terminal homólogo al dominio kringlel del plasminógenonativo; y un dominio C-terminal que comprende un sitio de activación y un dominio serina proteasa, dicho dominio C-terminal es homólogo al sitio de activación y al dominio serina proteasa del plasminógeno humano; en el que el polipéptido se une a lisina inmovilizada y en el que el polipéptido es SEQ ID NO: 2 con no más de 30 sustituciones de aminoácidos, o

c) un polipéptido que tiene un único dominio kringleN-terminal homólogo al dominio kringle 1 del plasminógeno nativo; y un dominio C-terminal que comprende un sitio de activación y un dominio serina proteasa, dicho dominio C-terminal es homólogo al sitio de activación y al dominio serina proteasa del plasminógeno humano; en el que el polipéptido se une a lisina inmovilizada, y en el que el polipéptido es, como mínimo, el 90%, 95%, o 98% idéntico a la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 2.

2. Polipéptido para la utilización, según reivindicación 1, que está codificado por la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 1 o una variante degenerada de la misma.

3. Polipéptido para la utilización, según la reivindicación 1 ó 2, en el que el polipéptido muestra una actividad fibrinolítica que está inhibida por la a2-antiplasmina a una velocidad de inhibición que es, como mínimo, 5 veces más rápida que la velocidad de inhibición de la actividad fibrinolítica de la miniplasmina por la a2-antiplasmina

4. Polipéptido para la utilización, según la reivindicación 3, en el que la velocidad de inhibición es, como mínimo, aproximadamente 10 veces, 20 veces 30 veces o 40 veces más rápida que la velocidad de inhibición de la miniplasmina.

5. Polipéptido para la utilización, según la reivindicación 1, en el que el polipéptido muestra una afinidad de unión por el fibrinógeno más baja que la afinidad de unión por el fibrinógeno de la miniplasmina.

6. Polipéptido para la utilización, según la reivindicación 1, en el que el polipéptido muestra una afinidad de unión por la fibrina parcialmente digerida superior que la afinidad de unión por la fibrina parcialmente digerida de la miniplasmina.

7. Polipéptido para la utilización, según la reivindicación 1,en el que el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos tal como la que se muestra en SEQ ID NO:2, y sustituciones conservadoras de la misma.