El plásmido pRTP801-VEGF, que consiste de los nucleótidos 1-4425 de SEQ ID NO: 13

Plásmido VEGF inducible por la hipoxia para una enfermedad isquémica.

Antecedentes de la invención

Esta invención se relaciona con plásmidos y con las composiciones para utilizar en terapia génica. Más particularmente, esta invención se relaciona con un plásmido sistema para incrementar la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), bajo condiciones de hipoxia. El plásmido sistema se puede utilizar para tratar una enfermedad isquémica en una persona con necesidad de dicho tratamiento, tal como una persona con necesidad de tratamiento para una enfermedad cardiaca isquémica.

La terapia génica con VEGF es un nuevo tratamiento de enfermedades isquémicas, tal como enfermedad cardiaca isquémica. La transferencia del gen del VEGF a un corazón isquémico, se ha logrado utilizando una inyección de ADN desnudo, portadores poliméricos, y portadores de retrovirus, adenovirus, o virus adeno-asociados. M. Azrin, Angiogenesis, protein and gene delivery, 59 Br. Med. Bull. 211-215 (2001); J.M. Isner, Myocardial gene therapy, 415 Nature 234-239 (2002); J. Kastrup et al., Vascular growth factor and gene therapy to induce new vessels in the ischemic myocardium. Therapeutic angiogenesis, 35 Scand. Cardiovasc. J. 291-296 (2001). La inyección de ADN desnudo es segura, ya que no induce la citotoxicidad o respuesta severa inmune. Los reportes previos han demostrado que la transferencia del plásmido desnudo del gen del VEGF es efectiva en el tratamiento del miocardio isquémico. J.F. Symes et al., Gene therapy with vascular endothelial growth factor for inoperable coronary artery disease, 68 Ann. Thorac. Surg. 830-836, discussion 836-837 (1999); P.R. Vale et al., Left ventricular electromechanical mapping to assess efficacy of phVEGF(165) gen transfer for therapeutic angiogenesis in chronic myocardial ischemia, 102 Circulation 965-974 (2000); C. Sylven et al., Myocardial Doppler tissue velocity improves following myocardial gene therapy with VEGF-A165 plasmid in patients with inoperable angina pectoris, 12 Coron. Artery Dis. 239-243 (2001). Sin embargo, la inyección del plásmido desnudo adolece de baja eficiencia de la expresión génica. J.M. Isner, supra.

Para mejorar la eficiencia de la transferencia del plásmido, han sido desarrollados portadores poliméricos del gen. Estos portadores poliméricos del gen incluyen TerplexDNA y lipopolímero soluble en agua (WSLP). D.G. Affleck et al., Augmentation of myocardial transfection using TerplexDNA: a novel gene delivery system, 8 Gene Ther. 349-353 (2001); M. Lee et al., Hypoxiainducible VEGF gene delivery to ischemic myocardium using water-soluble lipopolymer, 10 Gene Ther. 1535-1542 (2003). Estos portadores poliméricos del gen incrementan la eficiencia de la transfección al miocardio hasta diez veces. Además, la duración de expresión génica se prolongó en comparación con ADN desnudo. La duración prolongada de expresión génica por portadores poliméricos puede ser debido a la capacidad de los portadores para proteger el ADN de las nucleasas. Sin embargo, estos portadores poliméricos pueden ser citotóxicos para las células y a pesar de todo tienen una baja eficacia de la transfección que los portadores virales.

Otro enfoque para la transferencia del gen es utilizar retrovirus, adenovirus, o virus adeno-asociados como una transferencia del vector del gen. La transferencia del gen mediada por el virus mostró alta transferencia del gen y actividades de expresión. Generalmente se acepta que un portador viral es la forma más eficiente para transferir genes terapéuticos. Sin embargo, la transferencia del gen mediada por el virus puede conducir a la inmunogenicidad o integración cromosomal huésped, lo que sugiere una posible mutagénesis. M. Azrin, supra. Además, la producción de partículas virales para encapsular el ADN no es tan rentable como la de portadores poliméricos o de ADN desnudo.

Por consiguiente, cada método de transferencia tiene sus propias ventajas y desventajas, y la selección de un portador de gen depende en gran medida de su disponibilidad y la enfermedad diana.

Otro motivo de preocupación, con respecto a la terapia génica utilizando VEGF es el sistema de regulación del gen. En la actualidad, VEGF es el más efectivo gen terapéutico para neo-vascularización. J.M. Isner, supra. Previamente, se reportó que tanto VEGF como sus receptores se sobre-regularon en tejidos isquémicos. E. Brogi et al., Hypoxia-induced paracrine regulation of vascular endothelial growth factor receptor expression, 97 J. Clin. Invest. 469-476 (1996). Por consiguiente, se sugirió que la isquemia es necesaria para que VEGF ejerza sus efectos. J.S. Lee & A.M. Feldman, Gene therapy for therapeutic myocardial angiogenesis: a promising synthesis of two emerging technologies, 4 Nature Med. 739-742 (1998). Sin embargo, Springer et al. demostraron que el VEGF transferido de manera exógena podría ejercer un efecto fisiológico en tejido normal, no-isquémico. M.L. Springer et al., VEGF gene delivery to muscle: potential role for vasculogenesis in adults, 2 Mol. Cell 549-558 (1998). Además, la expresión continua sin regular del VEGF se asocia con la formación de tumores vasculares intramurales derivados de las células endoteliales. R.J. Lee et al., VEGF gene delivery to myocardium: deleterious effects of unregulated expression, 102 Circulation 898-901 (2000). Este sugiere que expresión del VEGF se debe regular. Por consiguiente, un potenciador de la eritropoyetina (Epo) se utilizó para mejorar la expresión del gen de VEGF localmente en tejidos isquémicos. Se demostró que el potenciador de Epo y el promotor SV40 mejoraron la expresión del gen de VEGF bajo una condición de hipoxia en células 293 de riñón embrionario humano in vitro y en miocardio isquémico de conejo in vivo. M. Lee et al., supra. Además, Su et al. demostraron que un elemento sensible a la hipoxia (HRE) medió la expresión de VEGF en miocardio isquémico, utilizando virus adeno-asociados como un portador de gen. H. Su et al., Adeno-associated viral vector-mediated hypoxia response element-regulated gene expression in mouse ischemic heart model, 99 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 9480-9485 (2002). En este ensayo, el gen del VEGF se reguló por el elemento de respuesta a la hipoxia (HRE) y el promotor SV40. Este sistema de expresión regulada del VEGF debería ser útil para la terapia génica de VEGF más segura, minimizando los efectos secundarios indeseados.

En vista de lo anterior, será apreciado que se proporcione un plásmido para terapia génica de enfermedad isquémica, en donde el plásmido expresa VEGF bajo el control regulado y que se pueda entregar con un portador polimérico, sería un avance significante en el oficio.

Otro ejemplo de una publicación previa es SHOSHANI T. EL AL.: "Identification of a novel hypoxia-inducible factor 1-responsive gene, RTP801, involved in apoptosis" MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY vol. 22, No. 7, April 2002, pages 2283-2293, que describe la identificación y clonación de un novedoso gen sensible a HIF-1, denominado RTP801; esta transcripción de RTP801 se aumenta rápida y agudamente tanto in vitro como in vivo; y que la expresión inducible de RTP801 se media por la activación transcripcional.

Breve resumen de la invención

Una modalidad ilustrativa de la presente invención es el plásmido pRTP801-VEGF que se compone de los nucleótidos 1-4425 de SEQ ID NO: 13, que expresa VEGF bajo el control del promotor RTP801, que es sobre regulado bajo condiciones hipóxicas.

Otras modalidades ilustrativas de la invención incluyen los siguientes plásmidos: pRTP801-725, pRTP801-645, pRTP801-545 y pRTP801-495, como se definen en las reivindicaciones.

Otro aspecto de la invención se relaciona con un plásmido que comprende un elemento promotor RTP801 humano regulado por la hipoxia, que incluye el elemento de enlace SP1 configurado operacionalmente adyacente a un cassette de expresión que codifica el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), de manera que, la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular en una célula apropiada es mayor en la hipoxia en comparación con la normoxia.

Otros aspectos de la invención se detallan en las reivindicaciones.

Breve descripción de los diversos puntos de vista de los dibujos

Fig. 1A muestra las representaciones esquemáticas de las estructuras de vectores indicadores luciferasa de pRTP801 que contienen varias longitudes de las regiones Blanqueadoras 5' del promotor RTP801 humano.