Péptidos y moléculas relacionadas que se unen a TALL-1.

Una composición objeto del presente que tiene la fórmula (%'_V1_(X2h

y multímeros de la misma,

donde:

V1 es una molécula que evita la degradación y/o aumenta la vida media, reduce la toxicidad, reduce la inmunogenicidad,o aumenta la actividad biológica de una proteína terapéutica;

X' y X2 comprenden, cada uno de ellos independientemente, la ¡órmula -(L' )c _P1_(L2)d_ p2 o p2_(L2)d_P' _(L ')c-,donde X'y X2 están unidos a V1 mediante (L 1)c;

a,b,c y d son, cada uno de ellos independientemente, O 01, siempre que al menos uno de a o b sea 1;P1 Y P2 comprenden, cada uno de ellos independientemente, la secuencia de aminoácidos recogida en SECo ID. N°: 109(¡1¡2¡3 K¡5 D¡7 Lf9¡' 0Q¡12¡13¡14);

f1 es un residuo de aminoácido o está ausente;

f2 Y f3 son residuos de aminoácidos;

¡ es W, Y, o F;

f7 es un residuo de aminoácido;

¡1O es K, R, o H;

f12 es e, un residuo hidrófobo neutro, o un residuo básico (preferiblemente W, C o R);

f13 es C, un residuo hidrófobo neutro o está ausente;

f14 es cualquier residuo de aminoácido o está ausente;

siempre que solamente uno de f1, f2, o f3, pueda ser C, y solamente uno de f12, f13 Y f14 pueda ser C; yL 1 Y L 2 son, cada uno de ellos independientemente, enlazadores.

Péptidos y moléculas relacionadas que se unen a TALL-1

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

Tras años de estudio de la necrosis de los tumores, los factores de necrosis tumoral (TNF) a y ~ fueron finalmente clonados en 1984. En los años siguientes presenciamos la aparición de una superfamilia de citoquinas TNGF, incluyendo el ligando de Fas (FasL) , ligando de CD27 (CD27L) , ligando de CD30 (CD30L) , ligando de CD40 (CD40L) , ligando inductor de la apoptosis relacionado con el TNF (TRAIL, también denominado AGP-1) , la proteína de enlace de la osteoprotegerina (OPG-BP o ligando de OPG) , ligando de 4-1 BB, LlGHT, APRIL, Y TALL-1. Smith et al. (1994) , Cell

76: 959-962; Lacey et al. (1998) , Cell 93:165-176; Chichepotiche et al. (1997) , J. Biol. Chem. 272: 32401-32410; Mauri et al. (1998) , Immunity 8:21-30; Hahne et al. (1998) , J. Exp. Med. 188:1185-90; Shu et al. (1999) , J. Leukocvte Bioloay 65:680-3. Esta familia está unificada por su estructura, particularmente en el extremo e-terminal. Por otra parte, la mayoría de los miembros conocidos hasta la fecha se expresan en compartimentos inmunológicos, aunque algunos miembros también se expresan en otros tejidos y órganos. Smith et al. (1994) , Cell 76:959-62. Todos los miembros de los ligandos, con excepción de LT-a, son proteínas transmembrana de tipo 11, que se caracterizan por una región de 150 aminoácidos conservada dentro del dominio extracelular del extremo c-terminal. Aunque está limitado a una identidad de tan solo el 20-25%, el dominio conservado de 150 aminoácidos se pliega en un característico beta sándwich de hoja plegada y se tri me riza. Esta región conservada puede ser liberada proteolíticamente, generando así una forma funcional soluble. Banner et al. (1993) , CeIl73:431-445.

Muchos miembros de esta familia de ligandos se expresan en tejidos enriquecidos en linfoides y desempeñan papeles importantes en el desarrollo y la modulación del sistema inmunológico. Smith et al. (1994) . Por ejemplo, el TNFa se sintetiza principalmente por macrófagos y es un mediador importante de respuestas inflamatorias y defensas inmunológicas. Tracey & Cerami (1994) , Ann. Rev. Med. 45:491-503. El Fas-L, expresado predominantemente en células T activadas, modula la apoptosis mediada por TCR de timocitos. Nagata, S. & Suda, T. (1995) ImmunoloaY Today 16:39-43; Castrim et al. (1996) , Immunity 5:617-27. El CD40L, también expresado en células T activadas, proporciona una señal esencial para la supervivencia, la proliferación y el cambio de isotipo de inmunoglobulina de las células B. Noelle (1996) , Immunity 4:415-9.

Se han identificado los receptores cognados de la mayoría de los miembros de la familia del ligando TNF. Estos receptores comparten múltiples repeticiones ricas en castina características dentro de sus dominios extracelulares y no poseen motivos catalíticos dentro de las regiones citoplásmicas. Smith et al. (1994) . Los receptores envían señales mediante interacciones directas con proteínas con dominio de muerte (p. ej. TRADD, FADO Y RIP) o con proteínas TRAP (p. ej., TRAF2, TRAF3, TRAF5 Y TRAF6) , desencadenando rutas de señalización divergentes y superpuestas, p. ej., apoptosis, activación de NF-kB o activación de JNK. Wallach et al. (1999) , Annual Review 01 ImmunoloaY 17:331

67. Estos eventos de señalización conducen a la muerte, proliferación, activación o diferenciación celular. El perfil de expresión de cada miembro receptor varía. Por ejemplo, TNFR1 se expresa en un amplio espectro de tejidos y células, mientras que el receptor de superficie celular de OPGL se limita principalmente a los osteoclastos. Hsu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 96:3540-5.

Varios grupos de investigación han identificado recientemente ligandos de la familia del TNF con una secuencia igualo sustancialmente similar. El ligando ha recibido varios nombres: neutrocina a CNO 98/18921, publicado el 7 de mayo de 1998) , 63954 (WO 98/27114, publicado el 25 de junio de 1998) , TL5 (EP869180, publicado el7 de octubre de 1998) , NTN-2 r y vO 98/55620 y WO 98/55621, publicados el 10 de diciembre de 1998) , TNRL 1-alla (WO 9911791, publicado el 11 de marzo de 1999) , ligando kay r y v099/12964, publicado el18 de marzo de 1999) , y AGP-3 (Solicitud prov. EE.UU. N° 60/119.906, presentada el 12 de lebrero 1999 y 60/166.271, presentada el 18 de noviembre de 1999, respectivamente) ; y TALL-1 (WOOO/68378, publicado el 16 de noviembre de 2000) . En adelante, los ligandos mencionados en el presente se denominan colectivamente TALL-1.

TALL-1 es un miembro de la superfamilia de ligandos del TNF que está funcionalmente implicado en la supervivencia y proliferación de células B. Los ratones transgénicos con una sobreexpresión de TALL-1 experimentaron una severa hiperplasia de células B y una enlermedad autoinmune similar al lupus. Khare et al. (2000) PNAS 97 (7) :3370-3375) . Tanto TACI como BCMA sirven como receptores de la superlicie celular de TALL-1. Gross et al. (2000) , Nature 404:995999; Ware (2000) , J. Exp. Med. 192 (11) : F35-F37; Ware (2000) , Nature 404: 949-950; Xia et al. (2000) , J. Exp. Med. 192 (1) :137-143; Yu et al. (2000) , Nature ImmunoloaY 1 (3) :252-256; Marsters et al. (2000) , Current Bioloay 10:785-788; Hatzoglou et al. (2000) J 01 ImmunoloaY 165:1322-1330; Shu et al. (2000) PNAS 97 (16) :9156-9161; Thompson et al.

(2000) J Exp. Med. 192 (1) :129-135; Mukhopadhyay et al. (1999) J. Biol. Chem. 274 (23) : 15978-81; Shu et al. (1999) 1, . Leukocyte Biol. 65:680-683; Grass et al. (1995) Blood 85 (12) : 3378-3404; Smith et al. (1994) , CeIl76:959-962; Patente estadounidense N' 5.969.102, publicada el19 de octubre de 1999; WO 00/67034, publicado el 9 de noviembre de 2000; WC 00/40716, publicado el 13 de julio de 2000; WO 99/35170, publicado el 15 de julio de 1999. Ambos receptores se

expresan en células B y envían señales mediante interacción con las proteínas TRAF. Por otra parte, tanto TACI como

BCMA también se unen a otro miembro de la familia de los ligandos del TNF: APRIL. Yu et al. (2000) , Nature Immunology 1 (3) 252-256. También se ha demostrado que APRIL induce la proliferación de células B.

Hasta la fecha no se ha divulgado ninguna proteína recombinante o modificada que emplee péptidos moduladores de TALL-1. Las proteínas recombinantes y modificadas son una clase emergente de agentes terapéuticos. Las modificaciones útiles de agentes terapéuticos de proteína incluyen la combinación con el dominio "Fe" de un anticuerpo y el enlace a polímeros como el glicol de polietileno (PEG) y el dextrano. Estas modificaciones se debaten detalladamente en una solicitud de patente titulada "Péptidos modificados como agentes terapéuticos", publicada como

WC 00/24782.

Un planteamiento muy diferente al desarrollo de agentes terapéuticos es la investigación de la biblioteca de péptidos. La interacción del ligando de una proteína como su receptor a menudo se produce en una interfaz relativamente grande. No obstante, como se ha demostrado en el caso de la hormona de crecimiento humana y su receptor, solamente unos pocos residuos principales de la interfaz contribuyen de forma importante a la energía del enlace. Clackson et al. (1995) , Science 267:383-6. La mayor parte del ligando de la proteína solamente presenta los epitopes de unión en la topología correcta o está al servicio de funciones no relacionadas con la unión. Por tanto, las moléculas que solamente tienen una longitud de "péptido" (2 a 40 aminoácidos) se pueden unir a la proteína receptora de un determinado ligando de proteína

grande. Estos péptidos pueden imitar la bioactividad del ligando de proteina grande ("agonistas del péptido") o, mediante una unión competitiva, inhibir la bioactividad del ligando de la proteína grande ("antagonistas del péptido") .

Las bibliotecas de péptidos que presentan fagos se han revelado como un potente método para identificar estos

agonistas y antagonistas de los péptidos. Véase, por ejemplo, Scott et al. (1990) , Science 249:386; Devlin et al. (1990) , Science 249:404; Patente estadounidense N' 5.223.409, publicada el 29 de junio de 1993; Patente estadounidense N' 5.733.731, publicada el31 de marzo de 1998; Patente estadounidense n' 5.498.530, publicada el12 de marzo de 1996; Patente estadounidense n' 5.432.018, publicada el 11 de julio de 1995; Patente estadounidense n' 5.338.665, publicada el 16 de agosto de 1994; Patente estadounidense n' 5.922.545, publicada el 13 de julio de 1999; WO 96/40987, publicado el 19 de... [Seguir leyendo]

1. Una composición objeto del presente que tiene la fórmula (%'_V1_ (X2h y multímeros de la misma, donde: V1 es una molécula que evita la degradación y/o aumenta la vida media, reduce la toxicidad, reduce la inmunogenicidad,

o aumenta la actividad biológica de una proteína terapéutica;

X' y X2 comprenden, cada uno de ellos independientemente, la ¡órmula - (L') c _P1_ (L2) d_ p2º p2_ (L2) d_P'_ (L') c-, donde X' y X2 están unidos a V1 mediante (L1) c; a, b, c y d son, cada uno de ellos independientemente, O 01, siempre que al menos uno de a o b sea 1; P1 Y P2 comprenden, cada uno de ellos independientemente, la secuencia de aminoácidos recogida en SECo ID. N°: 109

(¡1¡2¡3 K¡5 D¡7Lf9¡' 0Q¡12¡13¡14) ;

f1 es un residuo de aminoácido o está ausente; f2 Yf3 son residuos de aminoácidos; ¡5 es W, Y, o F; f7 es un residuo de aminoácido;

¡1O es K, R, o H; f12 es e, un residuo hidrófobo neutro, o un residuo básico (preferiblemente W, C o R) ; f13 es C, un residuo hidrófobo neutro o está ausente; f14 es cualquier residuo de aminoácido o está ausente; siempre que solamente uno de f1, f2, o f3, pueda ser C, y solamente uno de f12, f13 Yf1 4 pueda ser C; y L1 Y L 2son, cada uno de ellos independientemente, enlazadores.

2. La composición objeto de la reivindicación 1, donde p1 y p2 comprenden, cada uno de ellos independientemente, la secuencia de aminoácidos recogida en SEC. ID. N': 125 (¡1f¡3KWO¡7Lf9KQ¡12¡13¡14) .

3. La composición objeto de la reivindicación 2, donde:f2 es G;

¡7 es L; ¡9 1; Y f12 es W.

4. La composición objeto de la reivindicación 3, donde p1 comprende la secuencia de aminoácidos recogida en SECo ID. N': 33 (LPGCKWDLLlKQWVCDPL) .

5. La composición objeto de la reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácidos recogida en SECo ID. N°:

44.

6. La composición objeto de la reivindicación 1, donde uno de X1 o X2 comprende la secuencia de aminoácidos recogida en SEC. ID. N': 12.

7. La composición objeto de la reivindicación 1, donde L 2 comprende la secuencia de aminoácidos recogida en SECo ID. N': 193 (GSGSATGGSGSTASSGSGSATX' X2) , donde X1 es un residuo hidrófobo o básico y X2 es un residuo hidrófobo; opcionalmente, donde L2 comprende la secuencia de aminoácidos recogida en SECo ID. N°: 59 (GSGSATGGSGSTASSGSGSATHM) .

8. La composición objeto de la reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácidos recogida en SECo ID. N°:

115.

9. La composición objeto de la reivindicación 1, donde dicha composición comprende un residuo de metionina en el extremo N-terminal.

1

10. La composición objeto de la reivindicación 1, donde Ves un dominio Fc, preferiblemente un dominio Fc de IgG.

11. La composición objeto de la reivindicación 1, donde: P' comprende la secuencia de aminoácidos recogida en SEC. ID. N': 33 (LPGCKWDLLlKQWVCDPL) ; p2 comprende la secuencia de aminoácidos recogida en SEC. ID. N': 125 (f1f2f3KWDf7Lf9KQf12f13f14) ; f1 es M o está ausente;

f3 es C;

f 12 es W;

f13 es un residuo hidrófobo neutro; f14 es C;

L comprende un enlazador peptídico que tiene la secuencia GGGGGV; 2

Lcomprende la secuencia de aminoácidos recogida en SEC. ID. N': 59 (GSGSATGGSGSTASSGSGSATHM) ; y V1

es un dominio Fc; donde dicha composición comprende opcionalmente un residuo de metionina en el extremo N-terminal.

12. La composición objeto de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para el uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune mediada por células B.

13. La composición para el uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune mediada por células B de conformidad con la reivindicación 12, que se caracteriza porque dicha enfermedad autoinmune mediada por células B es el lupus.

14. La composición objeto de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para el uso en el tratamiento del cáncer mediado por células B.

15. La composición objeto del presente para el uso en el tratamiento de un cáncer mediado por células B, de acuerdo con la reivindicación 14, que se caracteriza porque dicho cáncer mediado por células B es un linfoma de células B.

FIG.1

- s-s

- s-s

- S-S-

Fe

Fe

A B e

x' {~ ~

- S-S-S-S

- S-S

fe

FeF

F

D E

FIG. 2

FIG •

Fe

r~------A--

A

Fe

r Á ______

B

Fe

r Á--

I I

s S

I I

S S

I I

FIG. 3

ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGTCCAGCTCCGGAACTCCTGGGGGGACCGTCA

1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

TACCTGTTTTGAGTGTGTACAGGTGGAACAGGTCGAGGCCTTGAGGAOOCC~TGOCAG~ a M D K ~ H T C P P C P A P E L L G G P S GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC

61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

CAGAAGGAGAAGGGGGGTTTTGGG'l'TCCTGTGGGAGTACTAGAGGGCCTGOOGACTCCAG a V P L F P P K P K D T L M 1 S R T P E V ACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCC'roAGOTCAAGT'l'CAAC'l'GGTACGTG

121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180

TGTACGCACCACCACCTGCACTCGGTGCTTCTGGGAC'l'CCAGTTCAAGT'l'GACCA'l'GCAC A T C V V V D V S H B D P B V K P N W y V

GACGGCGTGGAGGTGCATAAroCCAAGACAAAOCCOCOOGAOOAGCAGTAC}I~G

181 ---------+--------=+---------+---------+---------+---------+ 240

cTGC<;GCACC'l'CCACGTATTACOOTTCTGTTTCGGCGCCCTCC'l'CG'l'CATG'rl'G'DCG'l'GC a D G ~ E V H N ~ K T K P R E E Q y N S T TACCGTG'l'GGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGAC'OOGTGAA'l'GGCJl.~TAC

241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300

ATGGCACACCAGTCGCAGGAGTOOCAGGACGTGGTCCTGACCGACTTACCGT'l'CC'l'CATG a Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K B Y

AAGTGCAAGGTC'l'CCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCA~AAACCA~

301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360

TTCACGTTCCAGAGGTTGTTTCGGGAGGG'l'CGGGGGTAGCTC'l'i f iOOTAGACGl U' (X¡G a K C K V S N K A L P A P 1 B K T 1 S K A AAAGGGCAGCCC-CGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCC-CA'OOCCOOOATCaGe'l'GACC

361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420

T'l"l'C-CCGTCGGGGCTCTTGGTGTCCACATGTGGGACGGGGGTAGGGCCCTACTCGACTGG a K G Q P R B P Q V Y T L P P S R O E L T AAGAACCAGG'l'CAGCCTG1ICCTGCC'l'GGTCAAAGGCTTCTATC-CCAGCGACA'1'CGCCGTG

421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480

TTCTTGGTCCAGTCGGACTGGAC-GGACCAG'l"l"lICCGAAGTAGGG'l'CGCTGTAGCGGCAC a K N Q V S L T C L V K G P Y P S O 1 A V

GAG'I'GGGAGAGCAATGGGCAGCC~~IICTACAAGACCACGCCTCCCG'l'GC'l'GGAC

481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 540

C'l'CACCCTCTCGTTACCCGTCGGCCTCTTGT'llGATGT'l'C'lIGG'1'GCGGAGG<JCAC a B W B S N G Q P B N N Y K T T P P V L D

TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGC'l'C}\C'1'GGAO~TGGCAGCAG

541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600

AGGCTGCCGAGGAAGAAGGAGATGTCGT'l1CGAGTGGCACC'1'G'l'TTOGTCCAeCG'l'CC'l'C

a S O G S F F L Y S K L T V O K S R W Q Q

·GGGAACGTCTTCTCATGCTC-CGTGATGCATGAGGC'1'CTGCACAACCACTACAC.QCAG1I~

601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ ~60

·CCCTTGCAGAAGAGTACGAOOCACTACGTAC1'CCGAGACGTGT'roGTGATG'roCG'1!C'1'TC a G N V P S C S V M H B A L H N H Y T Q K AGCCTCTCCCTGTC'l'CCOOGTAAA

661 ---------+---------+----~84

~GAOOGACAGAGOC.'CCA~

a S L S L S P G K

208

FIG.4A

1) A~P3-8-1-a NdeI

TATGCCGGGTACTTGTTTCCCGTTCCCGTGGGAATGCACTCACGCTGGTGGAGGCGGT

1 ---------+---------+---------+---------+---------+-~-______+60

GGCCCATGAACAAAGGGCAAGGGCACCCTTACGTGAGTGCGACCACCTCCGCCA

a M PG T C F P F P W E C T HA G G G G SalI

GGGG 61 ---------69

CCCCAGCT

a G V O

2j AGP3-S-2-a NdeI TATGTGGGGTGCTTGTTGGCC-GTTCCCG'I'GGGAATG'l"l"rCAAAGGGTGGAGGCGGT

1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

ACACCCCACGAACAACCGGCAAGGGCACCCTTACAAAGTT'N:'l"l'CCACC'OCCGCCA a M W G A C W P F P W E C P K E G G G G SalI

.. I

GGGG

61 ---------69 CCC-cAGCT

a G V D

FIG.48

3) AGP3-8-4-a

NdeI

TATGGTTCCGTTCTGTGACCTGCTGACTAAACACTGTTTCGAAGCTGGTGGAGGCGGT

1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

ACCAAGGCAAGACACTGGACGACTGATTTGTGACAAAGCTTCGACCAC~CGOCA

a M V P F COL L T K H C F E A G G ~ G

SalI:

G~

61 ---------69 CCCCAGCT

a G V O

4) AGP3-12-4-a November 6, 2000 12:53 NdeI TATGGGTTCTCGTTGTAAATACAAATGGGACGT'l1CTGACTAAACAGTGTT'lICCACCAC

1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

a M G S R C K y K W O V L T K Q C F H H

SalI GGTGGAGGCGG'l'GOOG

61 ---------+---------+-81

- CCACCTCCGCCAC<:C-CAGCT

a G G G G G V D

FIG.4C

S) AGP3-12-3-a NdeI

I .

TATGCTGCCGGGTTGTAAATGGGACCTGCTGATCAAACAGTGGGTTTGTGACCCGCTG

1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

ACGACGGCCCAACATTTACCCTGGACGACTAG~ACCCAAACACTGGGCGAC

a M L P G C K W D L L X K Q W v C D P L

SalI

GGroGAGGCGG'I'GGGG

61 ---------+---------+-81

CCACC'roCGCCACCCCAGCT a G G G G G V D

6) AGP3-12-S-a .

NdeI

TATGTCTGCTGACTGTTACTTCGACATCCTGACTAAATCTGACGTT'OOTAC'M'CT'l'C'l'

1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

ACAGACGACTGACAATGAAGCTGTAGGACTGATTTAGAC'OOCAAACA~

a M S A D e y F D I L T K S D V e T s S Sal!

GGTGGAGGCGGTGGGG 61 ---------~---------+-81

CCACCTCCGCCACCC-CAOCT

a G G G G G V D

FIG.40

7) AGP3-12-8-a NdeI

l'

TATGTCTGACGACTGTATGTACGACCAGCTGACTCGTATGTTCATCTGTTCTAACCTG 1 ---------+---------+---------+--~------+---------+--------_+ 60 ACAGACTGCTGACATACATGCTGGTCGACTGAGCATACAAGTAGACAAGATTGGAC a M S D D C M y D Q L T R M F 1 C S N L Sal1 GG'l'GGAGGC-GG'l'GGG.

61. --------+--------~+-81 CCACCTCCGCCACCCCAGCT a G G G G G V D 8) AGP3-12-9-a NdeI TATGGACCTGAACTGTAAATACGACGAACTGACTTACJ1Z1IU;AATGGTGTCAG'l'TCAAC 1 ---------+---------+---------+---------+--------~+---------+ 60 ACCTGGACTTGACATTTATGCTGCTTGACTGAA1Gli rel"lACCACAG'l1CAAGT'1'G a M D L N e K y DEL T Y K E W C Q F N Sal1 GGTGGAGGCGGTGGGG

6L ---------+---------+-81

CCACCTCC~CACCCCAGCT

a G G G G G V D

FIG. 4E

9) AGP3-12-10-a NdeI

, .

TATGTTCCACGACTGTAAATACGACCTGCTGACTCGTCAGATGGTTTGTCACGGTCTG

1 ---------+---------+---------+---------+---------+--__ ---__ +60

ACAAGGTGCTGACATTTATGCTGGACGACTGAGCAGTCTACCAAACAGTGCCAGAC a M F H D C K y D L L T R Q M V C H G L SalI GGTGGAGGCGG'l'GGGG

61 ---------+---------+-Bl

CCACCTC<:OCCACCCCAGCT a G G G G G V D 10) AGP3-12-11-a

NdeI TATGCGTAACCACTGTTTCTGGGACCACCTGCTGAAACAGGACATCTG'l'CCGTCTCCG 1 ---------+---------+---------+-~-------+---------+---------+ 60 ACGCATTGGTGACAAAGACCCTGGTGGACGACTl'TGTCCTGTAGACAGGCAGAGGC a M R N H C F W D H L L K Q D I C P S P Sal:t GGTGGAGGCOO'I'GGGG

61 ---------+---------+-81

CCACCTCCGCCACCCCAGCT a G G G G G V D

FIG.4F

11) AGP3-12-14-a

NdeI

I

TATGGCTAACCAGTGTTGGTGGGACTCTCTGCTGA~~~aAA-CG'M'TGTGAAT'ICrTC

1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

ACCGATTGGTCACAACCACCCTGAGAGACGACTTTlrr~AAACACTTAAGAAG

M A N Q ~ W W D S L L K K N V e E F F SalI

I

OOT"~GGTOOGG

61 --r------+--~------+-81

CCAa:'roCGC-cACCCCAGCT

a G G G G G V D

12) AGP3 Consensus

NdeI

I

TATG'l"OCX:ACGACTGCAAATGGGACCTGCTGACCAAACAGTGGG'rrl'GCCACGG'l'C'l'G

1 ---------+--~------+---------+---------+---------+---------+ 60

gtATACAAGG'I'GCTGACGTTTAC-CCTGGACGACTGG'l'TTG'l'CACCGGTGC!CAGAC a M P H D e K W D L L T K Q W v e H G L SalI

I

GGTGGAGGGGGTGGGG

61 ---------+---------+-81

:CCA'CC'lICCGCCACCCCAGCT

a G G ~ G G V D

FIG. 5A

P

f

O 8

GATCAGCAGTCCCCGGAACATCGTAGCTGACGCCTTCGCGTTGCTCAGTTGT-CCAACCCC

1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ ~O

CTAGTCGTCAGGGGCCT'l'GTAGCATCGACTGCGGAAGCGCAACGAGTCAACAGGTTGGGG

GGAAACGGGAAAAAGCAAGTTTTCCCCGCTCCCGGCGTTTCAATAAC'1'GAAAACCATAC.

61. --------+---------+---------+---------+---------+--~------+ 120

CCTTTGCCCTTTTTCGTTCAAAAGGGGCGAOOGeCGCAAA'G'l"l'AT'l'GACTTTroGTATGA

121 --~------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180

TAAAGTGTCAAATTTAGTG'l'AAT'l'TGCTGTCATTAt;GGC-cAACTAAAC..~CGCGt~TWl'Gi!

- 35 -10

------ Prometer (PcopB) ---------------------------~

GATCTTCGTCACAATTCTCAAGTCGCTGATTTCAAAAAACTGTAGTATCCTC'l'GCGAAAC

181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240

CTAGAAGCAGTGTTAAGAG'l'TCAGCGACTAAAGll11TTGACATCATAGGAGACGC'M'TG

1. ->

mRNA st:art

GATCCCTGTTTGAGTAT'!'GAGGAGGCGAGATGTCGCAGACAGAAAATGCAGTGAC'I'TCCT

241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300

"CTAGGGACAAAC'l'CATAACTCCTCCGcTCTACAGCGTCTG'l'CTTT'l'ACGTCACTGAAGGA e MSQTENAVTSS---copB protein --->

CATTGAGTCAAAAGCGGTT'1'G'1'GCGCAGAGGTAAGCCTATGACTGACTCTGAGAAACAAA

301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360

GTAACTCAGTTTTCGCCAAACACGCGTCTCCATTCGGATACTGAC'l'GAGAC'l'C 1 t 1'CT'1"1' e L S O K R F V R R G K P M T D S B K Q M-

TGGCCGTTGTTGCAAGAAAACGTCTTACACACAAAGAGA'l'~TC

361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420

AC.cGGCAACAAC<iTTC111 'lOCAGAATGTGTGTT'l'CTCTA'M'TTCAAAAACAG'l"l'TTTAG

c AVVARKRLTHKEIKVPVKNP-

s

c

a

I

CTCTGAAGGATCTCATGGT'I'GAGTACTGCGAGAGAGAGGGGA'I'AM:ACA~AGTTCG

421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480

GAGACTTCCTAGAGTACCAAC'l'CATGA'CGCTCTCTCTCCCCTAT'I'GTGTCCGAGTCAAGC c L K D L M V E Y e E R E G I T Q A Q 11' v

FIG.58

- 35

---- Promoter (PrepA) -------> . l. --copB binding site --1

TTGAGAAAATCATCAAAGATGAACTGCAAAGACTGGATATACTAAAGTAAAGACTTTACT

481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 540

AACTCT.TTTAGTAGTTTCTACTTGACGTTTCTGACCTATATGA'l'TTCATT'11CTGAAATGA c E K I 1 K DEL Q R L D 1 L K *

- 10

TTGTGGCGTAGCATGCTAGATTACTGATCGTTTAAGGAAT1'T'llG'1'GGCroGeCACGCCG'l' 541 ---------+---------+---------+---------+---------+--~------+ 600

AACACCGCATCGTACGATCTAATGACTAGCAAATTCCTTAAAACACCGAC~GGCA

. 1--mRNA -->

D

B r

md

n 1 1<--------------

1 1

AAGGTGGCAAGGAACT.GGTTCTGATGTGGATTTACAGGAGC-<:AGAAAAGCAAAAACCCCG

601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 660

TTCCACCG'l'TCCTTGA"CCAAGACTACACCTAAATGTCC'l'CGGTCTTT'l1CG'lTl'TT e M W 1 y R S Q K S K N P D---~opT (ORF) --->

<-------copA ~-----------------------------------------

ATAATCTTCTTCAACTTTTGCGAGTACGAAAAGA'l'TACCGGGGCCCACTTAAACCGTATA

661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 720

TATTAGAAGAAGTTGAAAACGCTCATGCTl'TTCTAATGGOCCCGGGTGAATT'l'GGCATAT e N L L Q [, L R V R K D Y R G P L K P Y S

<------promoter (RNAI) ----------

- 10 -35

<---------------1 ------------

GCCAACAA'l'TCAGCTATGCGGGGAGTATAGTTATATGC~~AGTTCAAGA<::TTCTl'

721 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 780

CGGT'roTTAAGTCGATACGCCCCTCATA'K:AA'l'ATACGGGCC'l'TTTCAAG'rl'CTGAAGAA

e Q ~ F S Y A -G S IVI <:: P E K F K T S F-

TCTGTGCTCGCTCCTTCTGCGCATTGTAAGTGCAGGATGG'OO'PGACTGATCTTCA<:lCAAA

781 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 840

AGACACGAGCGAGGAAGAC-GCGTAACA~CG~CTACCACAC'1'GACTAGAAGTGGTT'l'

CARSFCAL* MTDLHQT-

c ---repAl protein --->

D r

a I

I

1 OGTATTACCGCCAGGTAAAGAACCCGAATCCGG'llGTTTACACCCCG'l'GAAGGTGCAGGAA

841 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900

GCATAATGGCGGTCCATTTCTTGGGCTTAGGCCACAAATG'l'GGGGCAC'rl'CCAOGTCCT'l' e y Y R Q V K N P N P V F T P R E G A. G T-

CGCTGAAGTTCTGCGAAAAACTGATGGAAAAGGCGGTGGGCT'OCAC'l"1'CCCGT'l'TTGATT

901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 960

GCGACTTCAAGACGCTTTTTGACTAC<::TT'I'TCCGCCACCCGAAGTGAAGGGCAAAACTAA

e LKFCEKLMEKAVGFTSRFDP

FIG.5e

e

e

e

c:

e

e

c:

e

e

s t B

TCGCCATTCATGTGGCGCACGCCCGTTCGCGTGATCTGCGTCGCCGTATGCCACCAGTGC

961 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1020

AGCGGTAAGTACACCGCGTGCGGGCAAGCGCACTAGACGCAGCGGCATACGGTGGTCACG AIHVAHARSRDLRRRMPPVL_

TGCGTCGTCGGGCTATTGATGCGCTCTTGCAGGGGC'l'GTG'l"I'TCCACTATGACC-cGC'l'CG

1021 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1080

ACGCAGCAGCCCGATAACTACGCGAGAACGTCCCCGACACAAAGGTGATACTGGGCGACC RRRAIOALLQGLCFHYDPLA

CCAACCGCGTCCAG'llGCTCCATCACCACGCTGGCCATTGAGTGCGGAC'llGGCGACGGAGT

1081 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1140

GGTTGGCGCAGGTCACGAGGTAGTGGTGCGACCOOTAACTCACGCC'l'GACCGCTGCC'l'CA NRVQCSITTLAIECGLATES

A e e 1 1 1

CTGC'roCCGGAAAACTCTCCATCACCCGTGCCACCCGTGCCCTGACGTTCCTGTCAGAGC

1141 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200'

GACGACGGCCTTTTGAGAOOTAGTGGGCACGGTGOOcACGGGACTGCAAGGACAGTCTCG A A G K L S I T R A T R A L T F L S· E L

TGGGACTGATTACCTACCAGACGGAATATGACCCGCTTATCGGGTGCTACA'l'TCCGACCG

1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1260

ACCCTGACTAATGGATGGTCTGCCTTATACTGGGCGAATAGCCCACGATGTAAGGCTGGC G LIT Y O T E Y O P L 1 G C y 1 P T D-

ATATCACGTTCACATCTGCACTGTTTGCTGCCCTCGATGTA'l'CAGAGGAGGCAG'l'GGC-cG

1261 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1320

TATAGTGCAAGTGTAGACGTGACAAACGACGGGAGCTACATAGTCTCCTCCGTCACC-GGC 1 T F T 'S A L F ·A A L O V S E E A V A A-

CCGCGCGCCGCAGCCG'I'GTGGTlIO GCAGGGGCTGGATA

1321 --. ------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1380

GGCGCGC--GGCGTCGGCACACCATACCC'l'TTTGTTTGTTGCGTTTTTCGTCCC-cGACCTAT

A R R S R V V W B N K Q R K K Q G L O T-

CCCTGGGCA'1'GGA'I'GAACTGATAGCGAAAGCCTGGCG'l"I'T'l'GTTCGTGAGC-G'l'T'rl'CGCA

1381 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1440

GGGACCCGTACCTACTTGACTATC-GCTTTCGGACCGCAAAACAAGCACTCOCAAAAGCGT L G M DE L I A K A W R F V R B R F RS

A f 1

I

GTTATCAGACAGAGCTTAAGTCC-CGTGGAATAAAGCGTGCCCGTGCGCGTCGTGATGCGG

1441 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500

CAATAGTCTGTCTCGAATTCAGGGCACCTTATTTCGCACGGGCACGCGCAGCACTACGC-C y Q TE L K S R G I K R AR A R R D A D

FIG.50

ACAGGGAACGTCAGGATATTGTCACCCTGGTGAAACGGCAGCTGACGCGCGAAATC~GG

--------- +---~-----+---------+---------+---------+---------+ lS~O

TGTCCCTTGCAGTCCTATAACAGTGGGACCACTTTGCCGTCGACTGCGCGCTTTAGQGCC e R. E R Q D 1 V '1' L V K R Q L T R E 1 A E

AAGGGCGCTTCACTGCCAATCGTGAGGCGGTAAAACGCGAAGTTGAGCGTCGTGTGAAGG

1561 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1620

TTCCCGCGAAGTGACGGTTAGCACTCCGCCATTTTGCGC'l'TCAACTCGCAGCACACTTCC e G R F T A Ñ R E A V K R E V E R R V K E

AGCGCATGATTCTGTCACGTAACCGTAATTACAGCCGGCTOOCCACAOC'M'CCCCCTGAA 1621

--------- +---------+---------+---------+---------+-~-------+ 1680

TCGCGTACTAAGACAGTGCATTGGCATTAATGTCGGCCGACCGGTGTCGAAGGGGGACTT e R MIL S R N R N Y S R L A '1' A S.P •

AGTGACCTCCTCTGAATAATCCGGCCTGCGCCGGAGGCT'l'CCGCACGTCTGAAGCCt::GAC

1681 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1740

TCACTGGAGGAGACTTAT'l'AGGCCGGACGCGGCCTCCGAAGGCG'OOCAGAC'I"l"CGGGCTG

p

f 1 M

:r

AGCGCACA.AJI.1\AATCAGCACCACATACAAAAAACAACC'l'CA'l'CATCCAGC'l"OCTGGTGCA

1741 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800

TCGCGTGTTTTTTAGTCG'l'GGTG'1'ATGT7T'1'TTG'1'TGGAG'l'AG'l'AGG~G'l'

TCC~CCCCC'l'G'I1"11~GATACAAAACACGCCTCACAGACGGGGAAlllWC'l"1'ATCC

. 1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1860

AGGCCGGGGGGGACAAAAGC'l'A'l'GTTTTGTGCGGAGTG'rCTGCCCCT'l'A.J1_J1.ACGM'l'AGG

1. -------------------ori ---------------------------

ACA'1"l'AAACTGCAAGGGACTTCCCCATAAGG'1"l'ACAA'CCG'l'TCA'l'GTCA'1'AAA:GCGCCA'1'

1861 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1920

TGTAATT'OOACGTTC<:CTGAAGGGGTA'l'TCCAATG'1'TGGCAAG'1'ACAGTAT'l'TCGCGGTA

- --------------------------ori -----------------~---------

CCGCCAGCG'l'TA{:AGGGTGCAATGTATCTTT'l'AAACAC<:'PGT'1"l'ATA'l'CTCCTTTAAACT

1921 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1980

GGCGGTCGCAATG'l'CCCACGTTACA'1'AGAAAATT'l'GTGGACAAA'l'ATAGAGGAAAT'l"1'GA

----------------------- ~----------I

ACTTAATTACATTCATTTAAAAAGAAAACCTA'l'TCACTGCCTG'l'CC'M'GGACAG.M:AGAT

1981 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2040

TGAATTAATGTAAGTAAATTTTTCTTTTGGATAAG'1'GACGGACAGGAACCTG'l'C'rGTC'l'A

ATGCACCTCCCACCGCAAGCGGCGGGCCCCTACCGGAGCCGCT'l"l'AG'I'TACAACAC'K:AG

2041 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100

TACGTGGAGGGTGGCGTTCGCCGCCCGGGGATGGCcTcGGCGAAATCAA'l'GT'l'G'l'GAGTC a M H L P P Q A A ~ P y R.S R F S Y N T Q ---repA4 protein ---> 1-------->

ACACAACCACCAGAAAAAC.cacOOTCCAGCGCAGAAC'l'GAAACCACAAAOCCCCTCCC'l'C

2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2160

TGTGTTGGTGGTCTTTTTGGGGCCAGGTCGCGT<:TTGAC~

a T Q P P E K P R S S A E L K P O S P S L

ATAACTGAAAAGCGGCCCC.ac-CCCGGTCCGAAGGGCCGGAACA'GAGTCGC'I"Z :I:'l'AA'rl'AT

2161 ---------+-________+_________+ _________ + _________+---------+ 2220

TATTGACTTTTCGCCGGGGCGGGGCCAGGCT'llCCCGGCCTTG'l'CTCAGCGAAAAT'l'AATA a 1 T E K R P R P G P K G R N R V A F N Y

FIG.5E

a

a

a

a

GAATGTTGTAACTACTTCATCATCGCTGTCAGTCTTCTCGCTGGAAGTTcTCAGTACACG

--------- +---------+---------+---------+---------+---------+ 2280

CTTACAACATTGATGAAGTAGTAGCGACAGTCAGAAGAGCGACCTTCAAGAGTCATGTGC E.~ e N y F Z 1 A V S L LAG S s Q y T

SS

gf li II

I

CTCGTAAGCGGCCCTGACGGCCCGCTAACGCGGAGATACGCCCCGACTTCGGGTAAACCC

--------- +---------+---------+---------+---------+---------+ 2340

GAGCATTCGCCGGGACTGCCGGGCGATTGCGCCTCTATGCGGGGCTGAAGCCCATTTGGG L V S G P O G P L T R R Y A P T S G. K P

TCGTCGGGACCACTCCGACC-GC-GCACAGAAGCTCTCTCATGGC'l'GAAAGCGGGTA'l'GGTC

--------- +---------+---------+---------+---------+---------+ 2400

AGCAGCCCTGGTGAGGCTGGCGCGTGTCTTCGAGAGAGTAC-cGACT'l'TCGCCCATACCAG S S G P L R P R T E A L S W L K A G M V

TGGCAGGGCTGGGGATGGGTAAGGTGAAATCTATCAA'I'CAG'l'ACCGGC'l'TACGCCGGGCT

--------- +---------+---------+---------+---------+---------+ 2460

ACCGTCCCGA'CCCCTACCCA'l"l'CCAC'l'TTAGATAGTTAGTCA'I'GGCCGAATGCGGCCCGA W Q G W G W V R •

B

s

t

E 1 1

TCGGCGG'M"l"I'ACTCCTGT'1'TCATATATGAAACAACAGG'l'CACCGCCT'llCCATGC-cGC'l'G

--------- +---------+---------+---------+---------+---------+ 2520

AGCCGCCAAAATGAGGACAAAGTATATACTT'I'G'1'TG'OCCAG'l'GGCGGAA'GGTACGGCGAC

B

9 P

L U 1 1

1 ATGC-GGCATATCCTGGTAACGATATCTGAATTGTTATACA'l'GTGTATAcrAC.QTGG'l'AA'l'G

--------- +---------+---------+---------+---------+---------+ 2580

TACGCCGTATAGGACCATTGCTATAGACTTAACAATA'l'GTACACATATATGCAOCA'l"!'AC

-

ACAAAAATAGGACAAGT'l'AAAAAT'M'ACAGGCGATGCAA'roAT'l'CAAACACGTAA'llCAAT

--------- +-------~-+---------+---------+---------+---------+ 2640

TGTTTTTATCC'l'GTTCAA'l'TTTTAAATG'PCCGCTACGTTACTAAGT'l'TGTGCA'1"l'AG'rl'A

ATCGGGGGTGGGCGAAGAACTCCAGCATGAGATCCCCGCGCTGGAGGA'l'CA'l'CCAGCCGG

--------- +---------+---------+---------+---------+---------+ 2700

TAOCC{:CCACCCGCTTCTTGAGGTCGTACTCTAGGGGCGCGACC'l'CCT1cGTAGGTCGGCC

'CGTCCCGGAAAA<:GATTCCGAAGC-<:CAACCTT'l'GATAGAAGGCGGCGGt'OOAA'OOGAAAT

--------- +---------+---------+---------+---------+---------+ 2760

GCAGGGCCTT'i"lIGCTAAGGCTTCGGGTTGGAAAGTATCT'1'CGGCCGCCACCTTAGC<l"l'TA

FIG.5F

N B

s P

P 1

V 1

CTCGTGATGGCAGGTTGGGCGTCGCTTGGTCGGTCATTTCGAACCCCAGAGTCCCGCTCA

2761 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2820

GAGCACTACCGTCCAACCCGCAGCGAACCAGCCAGTAAAGCTTGGGGTCTCAGGGQGAGT

GAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACC

2821 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2880

CTTCTTGAGCAGTTCTTCCGCTATCTTCCGCTACGCGACCCTTAGCCCTCGCCGCTATGG f • F F B D L L R Y F Al R Q S D P A A 1 G<---APHII protein [kan~cin resistance gene) --

GTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATA:I'CACGGGT

2881 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2940

CATT'l'CGTGCTCCTTCGCCAGTCGGGTAAGCGGCGGTTCGAGAA~GTTATAGTGCCCA f y ~ V L F R DA W E G G L E E Al D R T

AGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCOOCCACAG'OCGATGAA'l'CC 2941 --~------+---------+---------+------~--+---------+---------+ 3000

TCGGTTGCGATACAGGACTATCGCCAGGCGGTGTGGGTCGGCCGGTGTCAGCTACTTAGG f A L A 1 D Q y R D A V G L R G C DI P G

AC-!._1\AAGCGGCCATTTTCCACCATGATA'l'TCGGCAAGCACGCATCGCCA'l'GAG'l'CACGAC

3001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3060

TCTTTTCGCCGGTAAAAGGTGGTACTATAAGCCGTTCG'I'CCGTAGCGG'l'AC'l'CAGTGC'l'G f s F R G N E V M I N P L CAD G H T V V-

GAGATCCTCGCCGTCGGGCA'1!GCGCGCC'l'TGAGCCTGGCGAACAGTTCGGC'rOOCOCGAG

3061 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3120

CTCTAGGAGCGGCAGCCCGTACGCGCCGAACTCGGACCGCTTG'l'CAAGCCGAC<:GCGCTC f LDEGDPMRAKLRAFLBAPAL-

CCCCTGATGCTCTTCGTCCAGA'I'CA'l'CCTGA'l'CGACAAGACCGGCT'l'CCATCCGAGTACG

3121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3180

GGGGACTACGAGAAGCAGGTCTAGTAGGACTAGCTG'l'TC'1'GGCCGAAGGTAGGC'l'CATGC f G Q H E E D L D D Q D V L G A B M R T R

TGCTCGCTCGA'l'GCGATGTTTCGC'I"I'GGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGA'1'CAAGCGT 3181 ---------+-------~-+---------+---------+---------+---------+ 3240

ACGAGCGAGCTAC{;CTACAAAGCGAACCACCAGC'l'TACCCGTCCA'l'CGGCCTAGTTCGCA f A R E 1 R H K A Q H D F.P C T A P D L T-

ATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACT'l"l'C'l'COOcAGGAGCAAGGTGAGA

3241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3300

TACGTCGGCGGCGTAACGTAGTCGGTACTACCTATGAAAGAGCC-G'l'CCroGTTCCACTCT f HLRRMADAMISVKEAPALHS-

TGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTC~CCAATAGCAGCCAG'rCCCTTCCC~

3301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3360

ACTGTCCTCTAGGACGGGGCCGTGAAGCGGGTTATCGTCGG'lICAGGGAAGGGCGAAG'1'CA f SLLDQGPVEGLLLWDRGAET

GACAA~GTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCC<;'l'CGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGC

3361 ---------+---------+---------+-----____+_________+ ____ -----+ 3420

CTGTTGCAGCTCGTGTCGAC.ccCTTCCTTGCGGGCAGCACQGGTCGGTGCTA'rCGGCGCG f V V D L V A A C P V G T TAL W S L R A-

TGCCTCGTCCTGCAATTCATTCAGGACACCGGACAGGTCOO'l'C'l"l'GACAAGG

3421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3480

ACGGAGCAGGACGTTAAGTAA'GTCCTGTGGCCTGTCCAGCCAGAACTG'l'TTTTC'1'TGGCC

FIG.5G

f A -E D O ~ E N L V G S L D T K V F L V P

GCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGC~GATTGTCTGTTGTGC

3481 ---------+---------+---------+---------+--_______ +_________+ 3540

CGCGGGGACGCGACTGTCGGCCTTGTGCCGCCGTAGTCTCGTCGGCTAACAGACAACACG'

f

R G O A S L R F V A A D S C G 1 T O Q A

B

a g

CCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATC

3541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3600

GGTCAGTATCGGCTTATCGGAGAGGTGGGTTCGCCGGCCTCTTGGACGCACGTTAGGTAG f W D y G F L R E V W A A P S G A H -L G D

TTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCTGATC'I'TGATCCCCTGCG

3601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3660

AACAAGTTAGTACGCTTTGCTAGGAGTAGGACAGAGAACTAGACTAGAACTAGGGGACGC f O E 1 M <--APHXI (kanamycin resistance) protein --) -10. <---mRNA APHII ---1 -----

CCATCAGATCCTTGGCGGCAAGAAAGCCATCCAGTTTACTTTGCAGGGC'l'TCCCAACCTT

3661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3720

GGTAGTCTAGGAACCGCCGTTCTTTC~TAGGTCAAA'roAAACGTCCCGAAGGGTTGGAA

- 35

<---------Promoter (APHII) ----------------

ACCAGAGGGCGCCCCAGCTGGCAAT'I'CCGGTTCGCTTGCTGTCCATAAAAC-CGCCCAG'l'C

3721 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3780

T-GGTCTCCCGCGGGGTCGACCG'M'AAGGCCAAGCGAACGACAGGTATTTTGGCGGG'l'CAG·

TAGCTATCGCCATGTAAGCCCACTGCAAGCTACCTGCTT'l'CTCT'i'TGCGCTl'GCGT'l'TTC

3781 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3840

ATCGATAGCGGTACATTCGGGTGACGTTCGATGGACGAAAGAGAAAC-GCGAACGCAAAAG

CCTTGTCCAGATAGCCCAGTAGCTGACATTCATCCGGGGTCAGCACCG'l'TTCT.GCOOACT

3841 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3900

GGAACAGGTCTATCGGGTCATCGACTGTAAGTAGGCCCCAGTCGTGGCAAAGACGCCTGA

GGCTTTCTACGTGTTCCGCTTCCTT'I'AGCAGCCCTTGCGCCCTGAGTGC'l'TGCGGCAGCG

3901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3960

CCGAAAGATGCACAAGGCGAAGGAAATCGTCGGGAACOOGGGAC'l'CACGAACGOOGTCGC

1. -----par locus -----------------------~-

TGAAGCTACATATATG'mATCCGGGCAAATCGCTGAATATTCCTTTTGTC'llCCGACCATC

3961 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4020

ACTTCGATGTATATACACTAGGCCCGTTTAGCGACTTATAAGGAAAACAGAGGC'roGTAG

B

.c g

I

------------------------ par locus -------------------------

AGGCACCTGAGTCGCTGTCTTTTTCGTGACATTCAGT'K:GC'l'GCGCTCACGGCTCTGGCA

4021 ---------+---------+_________+_________ + _________ + ____-----+ &080

TCCGTGGACTCA~GA'CAGAAAAAGCACTGTAAGTCAAGCGACGCGAGTGCCGAGACCGT

------------------------ par locus ------------------------

FIG.5H

GTGAATGGGGGTAAATGGCACTACAGGCGCCTTTTATGGATTCATGCAAGGAAACTAC~

4081 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4140

CACTTACCCCCATTTACCGTGATGTCCGCGGAAAATACCTAAGTAOGTTCCTTTGATGGG

--- ~--------------------par locua --------------__________ _

ATAATACAAGAAAAGCCCGTCACGGGCTTCTCAGGGCGTTTTATGGCGGGTCTGCTATGT

4141 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4200

TATTATGTTCTTTTCGGGCAGTGCCCGAAGAGTCCCGCAAAATACCGCCCAGACGATACA

------------------------ par locua ------------------------

GGTGCTA'l'CTGACTTTTTGCTGTTCAGCAGTTCCTGCCC'l'CTGAT'I"I'TCCAGTC'roACCA

4201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4260

CCACGATAGACTGAAAAACGACAAGTCGTCAAGGACGGGAGACTAAAAGGTCAGACTGGT

------------------------ par locua -----------------~------

CTTCGGATTA'l'CCCGTGACAGGTCATTCAGACTGGCTAATGCACCCAGTAAGGCAGCGGT

4261 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4320

GAAGC<:TAATAGGGCACTGTCCAGTAAGTCTGACCGATTACGTGGGTCATTCCGTCGCCA

N B

s s

i a

--------------------------------- 1

I I

ATCATCAACAGGCTTACCCGTCTTACTGTCGAAGAC-GTGCG'l'AACGTA'1'GCA~C

4321 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4380

TAGTAGTTGTCCGAATGGGCAGAATGACAGC'l'TCTGCA"CGCATTGCATACG'l'ACC1IGAGG

TI haixpin

-------------------- > <--

CCATGCGAGAGTAG-GGAAC'roCCAGGCATCAAATAAAAC-GAAAGGC'1'CAGTCGAAAGACT

4381 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4440

GGTACGCTCTCATCCCTTGACGGTCCGTAGTTTAT'M'TGC'l"l'TCCGAG'l'CAGC'lTl'CTGA

--------------- 1

GGGCCTTTCGTTTTATCTG'l"I'GTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAA'l'CCGC

4441 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4500

CCCGGAAAGCAAAATAGACAACAAACAGCCACTTGCGAGAGGACTCATCC'roTTTAGGCG

-- '1'1 stop -->1

p

s

P

4 O 6

I

CGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGG'l'GGCGGGCAGGAGGCC~

4501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4560

GCCCTCGCCTAAACTTGCAACGCTTCGTTGCCGGGCC'1'CCCACCGCCCG'reC'1'GCGGGCG

'1'2 hairpin

----------- > <----------

CATAAAC'!X;CCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCA'l'CCTGACGGATGOOCTT'1'T'l'GCGT

4561 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4620

GTATTTGACGGTCCGTAGTTTAATTCGTCTTCCGGTAGGAC'l'GOC'l'ACCGGAAAAA!=GCA ----'1'2 stop ---->\

FIG.51

A

a t

I I TTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGGACGTCGTACTTAAC

4621 ---------~---------+---------+---------+---------+~--------~ 4680

AAGATGTTTGAGAAAACAAATAAAAAGATTTATGTAAGTTTATACCTGCAGCATGAATTG

*

TTTTAAAGTATGGGCAATCAATTGCTCCTGTTAAAATTGCTTTAGAAATACT'I'TGGCAGC

4681 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4740

AAAATTTCATACCCGTTAGTTAACGAGGACAATTTTAACGAAATCTTTATGAAACCGTCG d· SKFYPCDIAGTLIAKSISQC

1<---luxR p~otein ---.

GGTTTGTTGTATTGAGTTTCATTTGCGCATTGGTTAAATGGAAAGTGACCGTGC«'r.I'AC

4741 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4800

CCAAACAACATAACTCAAAGTAAACGC-GTAACCAATTTACC'l'TTCACTGGCA<!GCGAA'l'G d R N T T N L K M Q A N T L H F T V T R K

TACAGCCTAATATTTTTGAAATATCCCAAGAGCT M 1 I'C-CTTCGCATGCCCACGCTAAAC

4801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4860

ATGTCGGATTATAAAAACTTl'ATAGGGTTCTCGAAAAAGGAAGCGTACGGGTGC-GA'l"l'TG

d S C G L 1 K S 1 O W S S K G E C A W A L

ATTCTTTT'I'CTCTTTTGGTTAAATCGT'l'GTTTGA'I'TTATTATTTGCTATATTTATTTTTC

4861 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4920

TAAGAAAAAGAGAAAACCAATTTAGCAACAAACTAAATAATAAACGATATAAATAAAAAG

d C E K e R K T L .0 N N S K N N A 1 N I K

GATAATTATCAACTAGAGAAGGAACAA'l"l'AATGGTATG'l'TCATACACGCATGTAAAAATA

4921 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4980

CTATTAATAGTTGATCTCTTCCTTGTTAATTACCATACAAGTATGTGCGTACA'l"I"l"I"l'AT d R Y N o V L S P VIL P I N M C A H L F

B

s m

I AACTATCTATATAGTTGTCTTTCTCTGAATGTGCAAAACTAAGCATTCCGAAGCCATTAT

4981 ---------+---------+-----~---+---------+---------+---------+ S040

TTGATAGATATATCAACAGAAAGA"GACTTACACGTTTTGA'l'TCGTAAGGCTTCGGTAATA

·d L S D I Y N O K E S H A P S L M G F G N

TA"GCAGTATGAATAGGGAAACTAAACCCAGTGATAAGACC'l'GATGAT'I'TCGCT'r.CTTTAA

5041 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5100

ATCGTCATACTTATCCCTT'I'GATTTGGGTCAC!I'ATTCTGGACTACTAAAGCGAA"GAAATT

d N A T H I P F S F G T I L G S S K A E K

TTACATTTGGAGATTTTTTATTTACAGCATTGTTTTCAAATATA'I"l'CCAATTAATOOO'l'G

5101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 516~

AATGTAAACCTCTAAAAAATAAATGTC-GTAACAAAAGTTTATATAAGGTTAATTAGCCAC d 1 V N P S K K N V A N N E FIN W N I P

AATGATTGGAGTTAGAATAATCTACTATAGGATCATAT'l'TTATTAAA'l"I'AOC--G'l!CATCAT

5161 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5220

TTACTAACCTCAATCTTATTAGATGATATCCTAGTATAAAATAATTTAATCGCAGTAGTA

d S H N S N S Y O V I P O Y K 1 L N A O O

FIG. 5J

d

b

b

AATATTGCCTCCATTTTTTAGGGTAATTATCCAGAATTGAAATATCAGATTTAACCATAG

5221 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5280

TTATAACGGAGGTAAAAAATCCCATTAATAGGTCTTAACTTTATAGTCTAAATTGGTATC

y Y O R W K K P Y N D LIS 1 D S K V M

N

r

u

I

AATGAGGATAAATGATCGCGAGTAAATAATATTCACAATGTACCATTTTAGTCATATCAG

5281 ---------+---------+---------+---------+---------+--------_+ 5340

TTACTCCTATTTACTAGCGCTCATTTATTATAAGTGTTACATGGTAAAATCACTATAGTC S H P Y 1 1 A L L Y Y E C H V M K T M D

ATAAGCATTGATTAATATCATTATTGCTTCTACAGGCTTTAATTTTATTAAT'l'ATTC'OOT

5341 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5400

TATTCGTAACTAATTATAGTAATAACGAAGATG1'CCGAAATTAAAATAATTAATAAGACA S L C O N I D N N S R e A K 1 K N X I R

AAGTGTCGTCGGCATTTATGTCTTTCATACCCATCTCTTTATCCTTAC.cTA'l'TG'lf'OOTC

5401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 54~O

TTCACAGCAGCCGTAAATACAGAAAGTATGGGTAGAGAAATAGGAATGGATAACAAACAG y T D o A N 1 D ~ M <----luxR protein ---1

GCAAGTTTTGCGTGTTATATATCATTAAAACGGTAATAGAT'I'GACA'l'TTGATTCTAATAA

5461 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5520

CGTTCAAAACOCACAATATATAGTAATTTTGCCATTATCTAACTGTAAACTAAGATTATT <-----1 <----1 <----1 <----Promoter (luxPL) -------

luxR mRNA start sites

CRP Binding Site

ATTGGATTT'I'TGTCACACTATTATATCGCTTGAAATACAATTG'rrI'AACATAAGTACC'l'G

5521 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ ~580

TAACCTAAAAACAGTGTGATAATATAGCGAACTTTATGTTAACAAATTGTA'l"lCATGGAC

C B -----Promoter (luxPR) -------> 1 b

lux operator site -35 . -10 a a

- ----------------1----1 1----1 1 1

TAGGATCGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGGTTTG'l'TATAG'1'CGATTAATCGA'lTOOATT 5581 ---------+---------+---------+------~--+---------+---------+ 5640

ATCCTAGCATGTCCAAA'l'GCG'I"R:TTTTACCAAACAATATCACCTAA'l'TAGCTAAACTAA

1. ---1209-85 ----------> . 1--maNA start -->

NdeI

I

CTAGATTTGTTTTAACTAATTAAAGGAGGAATAACATATGATC-GC'1'CCACCATGCAC-cAG

5~41 ---------+-----. ---+---------+---------+--------:..+---------+ 5700

GATCTAAACAAAATTGATTAATTTC.cTCCTTATTGTATACTAGCGAGGTGGTACGroGTC

M 1 A P P C T S 1--RANK -->

TGAGAAGCATTATGAGCATCTGGGACGGTGCTGTAACAAATGTGAACCAOOAAAGTAcAT

5701 ---------+-------__ + _________+_________+ _________ +____-----+

'57~0

ACTCTTCGTAATACTCGTAGACCCTGCCACGACATTGTTTACACTTGGTCCTTTCATGTA

E K H Y E H L G R C C N K C E P G K Y M

FIG.5K

GTCTTCTAAATGCACTACTACCTCTGACAGTGTATGTCTGCCCTGTGGCCCGGATGAATA

57~1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5820

CAGAAGATTTACGTGATGATGGAGACTGTCACATACAGACGGGACACCGGGCCTACTTAT b S·S K e T T T S o s v e L p e G P o E y CTTGGATAGCTGGAATGAAGAAGATAAATGCTTGCTGCATAAAGTTTGTGATACAGGCAA

5821 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5880

GAACCTATCGACCTTACTTCTTCTATTTACGAACGACGTATTTCAAACACTATGTCCGTT

b ú D S W N E E D K C ú L H K V C D T G K -

ApaLI

1.

GGCCCTGGTGGCCGTGGTCGCCGGCAACAGTACGACCCCCCGGCGCTGCGCGTGCACGGC 5881 ---------+-------~-+---------+---------+---------+---------+ 5940

CCGGGACCACCGGCACCAGCGGCCGTTGTCATGCTGGGGGGCCGCGACGCGCACGTGCCG b A ú V A V V A G N S T T P R R C A C T A -KpnIIACc6Sf

I I

TGGGTACCACTGGAGCCAGGACTGCGAGTGCTGCC' (;cCGO~CGAGTGCGCGCCGGG

5941 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 6000·

ACCCATGGTGACCTCGGTCCTGACGCTCACGACGGCGGCGTTGTGGC'l'CACGCGCGGCCC

b G y H W s Q D C E e C R R N T E e A , G -

CCTGGGCGCCCAGCACCC-GTTGCAGCTCAACAAGGACACAGTGTGCAAACCTTGCC'l'TGC

6001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 6060

GGACCCGCGGGTCGTGGGCAACGTCGAGTTGTTCCTGTGTCACACGTTTGGAACGGAACG

b L G A Q H P L Q L N K D T V C K P ·C L A AGGCTACTTCTCTGATGCCTTTTCCTCCACGGACAAATGCAGACCCTGGACCAACTGTAC

6061 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 6120

TCCGATGAAGAGACTACGGAAAAGGAGGTGCCTGT'l'TACGTCTGGGACCTGGTTGACA'l'G b G y F S D A F S S T D K C R P W T N e T

CT'OCCTTGGAAAGAGAGTAGAACATCATGGGACA"GAGAAATCCGA'l'GTGGT'l'TGCAGTTC

~121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 6180

GAAGGAACCTTTCTCTCATCTTGTAGTACCCTGTCTCTTTA~'l'ACACCAAA"CGTCAAG

b F L G K R V E H H G T E K S D V ves s AccI

salfl

TTCTCTGCCAGCTAGAAAACCACCAAATGAACCCCATGTTTACGTCGACAAAACTCACAC

6181 ---------+---------+-------~-+---------+---------+---------+ 6240

AAGAGACGGTCGATCTTTTGGmGTTTACTTGGGGTACAAATGeAGCTG'J.'T'M1GAGTGTG

b S L PAR K P P N E P H V Y V D K T H T <--end RANK --II--start Fc--->

FIG. 5L

b Q P E N N Y K T T P P V L D S O G S F F

CCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATG 6781 ---------~---------+---------+---------+---------+---------+ 6840

GGAGATGTCGTTCGAGTGGCACCTGTTCTCGTCCACCGTCGTCCCCTTGCAGAAGAGTAC b L Y S K L T V D K S R W. Q Q G N V P S e CTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCC

6841 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 6900

GAGGCACTACGTACTCCGAGACGTGTTGGTGATGTGCGTCTTCTCGGAGAGGGACAGAGG b S V M H E A L H N H Y T Q K S L 5 L S P BamHI

I

GGGTAAATAATGGATCCGCGGAAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAAGCCCGAAAOOAAGC'l'GA 6901 ---------+---------+--~------+---------+---------+---------+ 6960

CCCATTTA TTACCTAGGCGCC'M'TCTTCTTCTTCTTCTTC'l'TTCGGGC'l"I"OCCTTC-GACT

b

G K •

BlpI 1

T7 hai~in

-------------- > <--

GTTGGCTGCTGCCACCGC'I'GAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGT

6961 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 7020

CAACCGACGACGGTGGCGACTCGTTATTGATCGTATTGGGGAACCCCGGAGATTTGCCCA

--- >

<---------

CTTGAGGGG'I"¡ ITTTGCTGAAAGGAGGAACCGCTCTTCACGCTC'l"TCACGCGGATAAATA

7021 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 7080

GAACTCCCCAAAAAACGACTTTCCTCCTTGGCGAGAAGTGCGAGAAGTGCGCCTA'l'TTAT

- T7 stop ---->1 toop hairpin

--------- >

AGTAACGATCCGGTCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGA~A~GCTCG

7081 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 7140

TCATTGCTAGGCCAGGTCATTACTGGAGTCTTGAGGTAGACCTAAACAAGTeTTGCGAGC toop hairpin

<. --------------

GTTGCCGCCGGGCGTTT'l'T'IATroGTGAGAATCGCAGCAACTTG~CAATCGAGCC

7141 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 7200

CAACGGCGGCCCGCAAAAAATAACCACTCTTAGCGTCGTTGAACAGeGCGGTTAGC'1'CGG --toop stop -->j

ATG'OCGTCGTcAACGACCCCCCATTCAAGAACAGCAAGCAGCATTGAGAAC'l"rI'GGAATC

7201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 7260

TACAGCAGCAGTTGCTGGGGGGTAAGTTCTTGTCGT'l'OG'l'CGTAAC'l'CTTGAAACCTTAG

CAGTCCCTCTTCCACC'l'GCTGACCG

7261 ---------+---------+-----7285

GTCAOOGAGAAGGTGGACGAC'l'GGC

FIG.6A

(aatlI sticky end) 5' GCGTAACGTA'OOCA'l'GGTC'l'CC (position #4359 in pAMG21) 3' TGCACGCATTGCATACGTACCAGAGG

- CCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACT_ -GGTACGCTCTCATCCCTTGACGGTCCGTAGTTTATTTTGCTTTCCGAGTCAGCTTTCTGA

- GGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCCGTGAACGC'l'CTCCTGAG'l'AGGACAAA'l'OCGC-CCCGGAAAGCAAAATAGACAACAAACAGCCACTTGCGAGAGGACTCA'l'CCTGTTTAGGCG

- CGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACQCCCOC-GCCCTCGCCTAAACTTGCAACGCTTCGTTGCCGGGCC'l'CCCACCGCCCGTCCTGCGGGCG

- CATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCA'l'CCTGACOGA'l'GGCCTT'1"1".I'GCGT-GTATTTGACGGTCCGTAGTTTAATTCGTCTTCCGGTAOOAC'l'GCC'l'ACCOOAAAAACGCA

~II

- TTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAATACA'l"l'CAAATATGGACG'OOGTACTTAAC-AAGATGTTTGAGAAAACAAATAAAAAGAT'l'l'ATGTAAG'l"l'TATACC'1'GCAGCATGAATTG

- TTTTAAAGTATGGGCAATCAATTGCTCC'l'GTTAAAA'l'TGCTT'l'AGAAATAC'l'TTGGCAGC-AAAATTTCATACCCGTTAGTTAACGAGGACAATTTTAACGAAATCTTTAroAAAOCGTCG

- GGTTTGTTGTA'l'TGAGTTTCATTTGCGCAT1'GGTTAAA'l'GGAAAGTGACCG'l'GCGCT'l'AC-CCAAACAACATAAC'I.'!:AAAGTAAACGCG'l'AACCAATTTAl::cTTTCAC'l"GGCACGCGAATG

- TACAGCCTAATATTTTTGAAATATCCCAAGAGC'1"I"1'"lWPCC'l"l'CGCA'l'GCCCACGCTAAAC-ATGTCGGATTATAAAAACTTTATf¡.GGGTTCTCGlIfofoUGGAAQCGTACGGG'l'GCGATTTG

- ATTCTTTTTCTCTTTTGGTTAAATCGTTGTTTGAT'l'TATTAT'l"l'GCTATATTrATTT'l'TC-TAAGAAAAAGAGAAAAC<:AATT'l'AGCAACAAACTAAATAATAAACGATATAAATAA.1I._r._IW

- GATAATTATCAAC'l'AGAGAAGGAACAAT'l'M'OOGTATGT'OCATACACGCATGTAAAAATA-CTATTAATAGTTGATCTCT'llCCT'l'GTTAA'l'TACCATACAAGTA'l'G'1'GCGTACATT'lwr'l'AT

- AACTATCTATATAGTTGTCTTTCTCTGAA'l'GTGCAAAACTAAGCA'l"l'CCGAAGCCATTAT-TTGATAGATATATCAACAGAAAGAGAC'l'TACACGTTTTGA'1"1'CGTAAGGCT'l'CGGTAATA

- TAGCAGTATGAATAGGGAAACTAAACCCAGTGATAAGACC'l'GA'l'GATTTCGCTTCT'l'TAA-ATCGTCATACTTATCCCTTTGATTTGGG'l'CACTATTC'l'GGACTACTAAAGCGAAGAAATT

- TTACATTTGGAGATTTTTTATT'l'ACAGCA'l'TG'M'T'l'CAAATATATTCCAATTAATCGGTG-AATGTAAACCTCTAAAAAATAAATGTCGTAACAAAAGTTTATATAA"GGTTAATTAGCCAC

- AATGATTGGAGTTAGAATAATCTACTATAOGATCA'l'ATTTTATTAAATTAGOGTCATCAT-TTACTAACCTCAATCTTATTAGATGATATCCTAGTATAAAATAATT'l'AATCGCAGTAGTA

- AATATTGCCTCCATTTTTTAGGGTAATTATCCAGAA'l'TGAAATA'l'CAGA'l'TTAACCA'l'AG-TTATAACGGAGGTAAAAAATCCCA'l'TAATAGGTC'l'TAAC'l'T'l'ATAGTC'l'AAAT'l'GGTATC

- AATGAGGATAAATGATCGCGAGTAAATAATATTCACAA'l'GTACCA'l'TTTAG'reATATCAG-TTACTCCTATTTACTAGCGCTCA'l'T'l'ATTATAAGTGTTACA1OOTAAAA'l'CAGTATAG'l'C

- ATAAGCA TTGATTAATATCATTA'l'TGCT'l'CTACAGGCTTTAA'l"l'TTATTAA'rl'A'l'TC'L'G'l'

- TATTCGTAACTAATTATAGTAATAACGAAGA'l'G'1'COGAAA+r.AAAATAA'1"l'AAT~A

- AAGTGTCGTCGGCATTTATGTCTTTCATACCCATCTCfl'TA'l"CCTTACC'l'ATl'GTTTGTC-TTCACAGCAGCCGTAAATACAGAAAGTA'l'GGGTAGAGAAATAGGAATGGATAACAAACAG

- GCAAGTTTTGCGTGTTATATA'l'CATTAAAACGGTAATAGATTGACA'l'TTGATTC'1'AA'1'AA-CGTTCAAAA<:GCACAATATATAGTAAT'l'T'IGCCATTATCTAACTGTAAACTAAGATTATT

FIG.68

- ATTGGATTTTTGTCACACTATTATATCGCTTGAAATACAATTGTTTAACATAAGTACCTG-TAACCTAAAAACAGTGTGATAATATAGCGAACTTTATGTTAACAAATTGTATTCATGGAC

- TAGGATCGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGGTTTGTTATAGTCGATTAAT~GATTTGATT

- ATCCTAGCATGTCCAAATGCGTTCTTTTACCAAACAATATCAGCTAATTAGCTAAACTAA

- CTAGATTTGTTTTAACTAATTAAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGA

- GATCTAAACAAAATTGATTAATTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGC~CTTAAGCT

~II.

- GCTCACTAGTGTCGACCTGCAGGGTACCATGGAAGCTTACTCGAGGATCCGCGGAAAGAA

- CGAGTGATCACAGCTGGACGTCCCATGGTACCTTCGAATGAGCTC~AGGCGCCTTTCTT

- GAAGAAGAAGAAGAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAG'rTGGC'roCTGCCACCGCTGAGCAATA-CTTCTTCTTCTTCTTTCGGGCTTTCCTTCGACTCAACCGACGACGGTGGCGACTCGTTAT

- ACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGA<;GGG'l"I"I''l'GAAAGGAGG

- TGATCGTATTGGGGAACCCCGGAGATrl'GCCCAGAACTCCCCA~~~~ACGACT'l'TCCTCC

- AACCGCTCT'l'CACGCTCTTCACGC 3' [SAcII sticky end] -TTGGCGAGAAGTGCGAGAAGTG 5' (position 15904 in pAMG21)

FIG.7

1~0~----------------------------~

O+-~~~~~~~~~~~~~~~

0.001 0.01 0.1 1 10 100 pepticuerpo TALL-1 (lJg/ml)

FIG. 8

o

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W [hAGP3]M

1. '

A. y 40 pM de pepticuerpo AGP3

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100 pM de pepticuerpo AGP3

FIG. 10A

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FIG. 10B

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el oeoticueroo AGP3 bloauea la unión de AGP3 en los receotores

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superficie BCMA superficie BAFFR

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el oeoticueroo AGP3 no bloauea la unión de Aoril en los receotores

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70%

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30% 10%

··c 10

- 10%

superficie TACI superficie BCMA superficie BAFFR

N

W V1

•

t::::::J control no tratado _ AGP3 (1 mg/kg)

tooo ~

FIG.12A

:::::

E 100

~

-

~.

4110 ZOO

O

Concentración (1 mg/kg) 5 5 o.s

N

w 0\ Peplipody Salino FC

t:::::::j control no tratado _ AGP3 (1 mg/kg)

.. 1

FIG.128

c::-ClO

-- &

::L

~

2D

O

Concentración (1 mg/kg) 5 5 0.5 Salino Fe Peplipody

TI

G) w

Peptlbody (5 mg/Kg)

control no tratado

AGP3 (1 mg/kg)

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....

c: 5

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4 r:¡:

Q)

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....

...

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3 3

ID

c..

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w

......¡

o

o 10 20 30 40 50 60

días tras la inmunización de refuerzo Tiemoo h

Nota: valor p basado en prueba de log-rank

"Tl

Nivel reducido de IgG2b anti-colágeno tras el Gi tratamiento con el pepticuerpo AGP3. .¡:, .

17~0

E 1250

e

o

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q 1000 Q

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O 750

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" ~

t::::::::l AGP3 F'b (S mgJkg)

t::::l AGP3 Pb (1.5mgJkg) ÉEHEI Fe (5mglkg) -PBS

IL e e

ti.

Se tomaron muestras de suero una semana después del tratamiento final del reactivo (día 35) . El gráfico anterior es representativo también de los isotipos IgGl, IgG3 e IgG2a.

"'Tl

G>

proteinuria aplazada con bloaueantes de la proteína AGP3 supervivencia prolon~ada con bloaueantes de AGP3

0'1

100

"'PBS

"C 100 .....

o

....AGP3 Pb (S I'nglkg) 90

~ 90

"C

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o

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S' 50

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3 20

~

9: 10

W

\.O O

N -O*~~------------------~--~

6 7 8 9 10 11 6 7 8 9 10 11

meses de edad

meses de edad

Pb

Pb

p-value vs psS

0.01108

0.3685

p-value vs PBS

0.0159

P-vs Fe

0.0573

I

p-value vs Fe

incidencia de proteinuria tiemoo hasta la muerte

FIG.16 A

BarnHI

,

ATGCTTCCAGGCTGCAAGTGGGATCTTCTTATTAAGCAATGGGTATGCGATCCACTTGGA

1 ---------+---------+---------+---------+---------+_________ +60

TACGAAGGTCCGACGTTCACCCTAGAAGAATAATTCGTTACCCATACGCTAGGTGAACCT

M Lo P G C K W D L L I K Q W V C O P L G

TCCGGTTCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGCGACT

61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

AGGCC~_~~~CGATGACCACCk~GC~CGAGGTGGCGTTCGAGACCAAGTC~~TCACGCTGA

S G S A T G G S G S T A S S G S G S A T

NdeI

I

CATATGCTGCCGGGTTGTAAATGGGACCTGCTGATCAAACAG'l'GGGTTTGTGACCC-GCTG 121 ---------+--~------+---------+---------+---------+---------+ 180

GTATACGACGGCCCAACATTTACCCTGGACGACTAGTTTGTCACCCA~~TGGGCGAC

H M L P G C K W O L L I K Q W V C D P L Sall:

I

GGTGGAGGCGGTGGGGTCGACAAAACTCACACATG'l1CCACCTTGTCCAGCTCCGGAACTC

181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240

CCACCTCCGCCACCCCAGCTGTTTTGAGTGTGTACAGGTGGAACAGG'OCGAGGCC'l'TGAG . G G G G G V D K T H T C P P e P A P E L CTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAAC-CCAAGGACACCCTCATGATC'rCC

241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300

L G G P S V .F L F P P K P K D T L M I S CGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAG

301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360

GCCTGGGGACTCCAGTGTACGCACCACCACCTGCACTCGGTGC'M'CTGGGACTCCAG'rl'C

R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAG

361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420

AAGTTGACCATGCACCTGCCGCACCTCCACGTATTACGGTTC'OO'1'TTCGGCGCCCTCCTC F N W y V o G V E V H N A K T K P R E E

421 CAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCT.GCACCAUGACTGGCTG

_________+_________+_________+_________ + _________ +____-----+ 480

GTCATGTTGTCGTGCATGGCACACCAGTCGCA<;GAGTGGCAGGA'CG'PGGTCC'lIGACC-GAC

Q y N S T Y R V V S V L T V L H Q o W L

FIG. 168

AATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAA

481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 540

TTACCGTTCCTCATGTTCACGTTCCAGAGGTTGTTTCGGGAGGGTCGGGGGTAGCTCTTT N G K E Y K C K V ·S N K A L P A PIE K ACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCC

541 ---------+---------+---------+---------+_________ +_________ +600

TGGTAGAGGTTTCGGTTTCCCGTCGGGGCTCTTGGTGTCCACATGTGGGACGGGGGTAGG

T 1 S K A K G Q P R E P Q v y T L P P S

CGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCC

601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 6~O

GCCCTACTCGACTGGTTCTTGGTCCAGTCGGACTGGACGGACCAGTTTCCGAAGATAGGG

R DEL T K N Q v S L T C L V K G F Y P

AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGJlJU:AACTACAAGACCACG

661 ---------+---------+----:----+---------+---------+---------+ 720

TCGCTGTAGCGGCACCTCACCCTCTCG:rTACCCGTCGGCCTCTTG'ITGA'1'GTTc'roGTGc S D I A'V E W E S N G Q P E N N y K T T CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGe'l'CACCGTGGACAAG

721 ---------+---------+---------+---------+---------+----~----+ 780

GGAGGGCACGACCTGAGGCTGCCGAGGAAGAAGGAGA'l'GTCGT'l'C-GAG'l'GGCACCTG'l'TC P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K

AGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCA'1'GAGGCTC~~

781 ---------+---------+---------+---------+---------+---~-----+ 840

TCGTCCACCGTCGTCCCCT'roCAGAAGAGTACGAGGCACTACGTACTC-<:GAGACGTGrl'G

S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N

CACTACACGCAGAAGAGCCTC1a:CTGTCTCCGGG'l'AAATAA

841 ---------+---------+---------+---------+--882

GTGATGTGCGTCT'OCTCGGAGAGGGACAGAGGCCCAT'1"l'A'l'T H Y T Q K S L S L S P G K •