PEPTIDO SECRETADO POR LACTOBACILLUS PLANTARUM CON FUNCIÓN INMUNOMODULADORA.

Peptido secretado por Lactobacillus plantarum con función inmunomoduladora.

La presente invención se refiere a un péptido aislado de Lactobacillus plantarum, con propiedades inmunomoduladoras y/o antiinflamatorias, cuya secuencia tiene al menos un 80% de homología con la SEQ ID NO: 1. La invención, también se refiere al uso de dicho péptido en la fabricación de un medicamento o composición farmacéutica para tratamiento y/o prevención de una afección intestinal, o en la preparación de un alimento funcional y/o en la preparación de un cosmético.

Péptido secretado por Lactobacillus plantarum con función inmunomoduladora.

La presente invención, que describe el uso de un péptido secretado por un lactobacilo en inmunoterapia humana, puede encuadrarse tanto en el sector de la tecnología de los alimentos como en el de la medicina. Se trata de la secuencia de aminoácidos (péptido ST) , que podría ser utilizado en la inmunoterapia de ciertas enfermedades inflamatorias, como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII; dividida en Enfermedad de Chron, Colitis Ulcerosa y Pouchitis) y en otras patologías donde la tolerancia oral se encuentra comprometida (como en el caso de la enfermedad celiaca frente al gluten de la dieta) . La vía de administración podría ser su inclusión en un alimento funcional o vía maduración dirigida de células dendríticas del donante (vacunas de células dendríticas) .

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

El tracto gastrointestinal humano es el hogar de una amplia variedad de bacterias comensales, mutualistas y patógenas y donde precisamente, se encuentra una de los principales puntos de contacto entre bacterias y sistema inmune. Este conjunto de bacterias contribuye, en gran medida, al conjunto de antígenos o sustancias extrañas junto con los antígenos de la dieta contra las que, en condiciones normales, el sistema inmune reaccionaría con el fin de eliminarlas como así ocurre en la inmunidad sistémica. Sin embargo, en el compartimento intestinal esto no transcurre ni mucho menos así, y en su lugar se despliega un mecanismo de tolerancia inmunológica frente a dichos antígenos denominado tolerancia oral, destinado a mantener la homeostasis de la mucosa (Feng y Elson (2010) Adaptive immunity in the host – microbiota dialog. Muc. Immunol. 4, 15-21) . En determinadas ocasiones, esta homeostasis se pierde y el sistema inmune reacciona de forma anómala contra la microbiota intestinal, desarrollándose procesos inflamatorios más o menos severos como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) o frente a algunos antígenos de la dieta (como es el caso del gluten en la enfermedad celiaca) . Además, también se conoce la relación existente entre determinadas enfermedades autoinmunes y des-regulaciones en la composición de la microbiota intestinal (Adams y cols. (2008) IgG antibodies against common gut bacteria are more diagnostic for Crohn's Disease than IgG against mannan or flagellin. Am. J. Gastroenterol. 103, 386-396) .

El proceso de tolerancia frente a la microbiota intestinal está mediado, en gran parte, por dos tipos celulares que, embebidos en la mucosa intestinal, están encargados del correcto procesamiento y reconocimiento de los antígenos procedentes de la microbiota intestinal. Estos los linfocitos T y las células dendríticas (CDs) . Las CDs son células fagocíticas especializadas en el procesamiento y la presentación de antígenos; en el caso de las CDs intestinales juegan un papel imprescindible en el reconocimiento de los microorganismos allí presentes, emitiendo pseudópodos entre los enterocitos del epitelio intestinal hacia el lumen (Rescigno y cols. (2001) Dendritic cells express tight junction proteins and penetrate gut epithelial monolayers to sample bacteria. Nat Immunol. 2, 361-367) . Las CDs fagocitan las partículas bacterianas y las procesan, sufriendo una serie de cambios denominados maduración y mostrando esos antígenos bacterianos en su superficie, para que puedan ser reconocidos por otras células del sistema inmune. Este cambio, además, va acompañado de una serie de alteraciones fenotípicas en las CDs, como la producción de ciertas citoquinas. Las CDs son, a su vez, claves para la proliferación y diferenciación de los linfocitos T hacia células efectoras de tipo Th1 (inducen respuesta pro-inflamatoria) , Th2 (inducen respuesta anti-inflamatoria) ó Th17 (intervienen en la protección de los tejidos superficiales contra las infecciones) , o bien hacia células reguladoras (Treg) (Zhu y Pau (2008) CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood 112, 1557–1569) . En complementación a las CDs, los linfocitos T son las células responsables de la respuesta inmune celular.

Algunas cepas pertenecientes al grupo de bacterias del ácido láctico son consideradas como probióticos, ya que son capaces de modular favorablemente la composición de la microbiota intestinal, afectando favorablemente a la salud humana (Rijkers, G.T. y cols. (2010) Guidance for substantiating the evidence for beneficial effects of probiotics: current status and recommendations for future research. J. Nutr. 140, 671S-676S) . En los últimos años, diversos grupos de investigación han ido acumulando evidencia científica que sugiere que ciertos componentes extracelulares podrían ser responsables de algunos de los efectos beneficiosos atribuidos a los probióticos. Esto cobra más sentido si se tiene en cuenta que en condiciones normales, en los individuos sanos la microbiota no se encuentra en contacto directo con la capa de enterocitos y/o las CDs. Por el contrario la microbiota se encuentra embebida en la capa de mucus protectora que recubre la capa epitelial del intestino. Es por tanto factible que dichos efectos beneficiosos de los probióticos no se deban a la interacción directa de las bacterias con las CDs. Por el contrario los probióticos podrían ejercer su función produciendo ciertos componentes que sí puedan atravesar la capa de mucus facilitando su captación por las CDs. Entre estos componentes extracelulares podemos mencionar los exopolisacáridos, los ácidos teicoicos, los indoles y las proteínas de superficie y extracelulares (Lebeer y cols. (2010) Host interactions of probiotic bacterial surface molecules: comparison with commensals and pathogens. Nat. Rev. Microbiol. 8, 171-84) . Estas últimas se definen como el grupo de proteínas que son secretadas durante el crecimiento bacteriano y que son liberadas al medio que las rodea (Sánchez y cols. (2008) Exported proteins in probiotic bacteria: adhesion to intestinal surfaces, host immunomodulation and molecular cross-talking with the host. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 54, 1-17) . Actualmente, las proteínas extracelulares constituyen un campo de investigación activa para la identificación y caracterización de los mecanismos moleculares de acción de los probióticos.

Las proteínas extracelulares pueden ser divididas en dos grupos principales. El primero está compuesto por aquellas proteínas que tienen un péptido señal, localizado en su parte N-terminal, y que dirige a la pre-proteína a la maquinaria de secreción, a través de la cuál es secretada al medio. El segundo grupo comprende aquellas proteínas que, además de un péptido señal, tienen dominios de unión a la superficie celular, siendo liberadas al medio durante el proceso de renovación de la pared bacteriana. Por último, algunos autores identifican un tercer grupo de proteínas extracelulares, compuesto por proteínas del metabolismo central, sin dominios de secreción, y para las cuales se desconoce el mecanismo responsable de su secreción al exterior celular.

Los sistemas de secreción de proteínas están altamente conservados dentro de la división Eubacteria. Dichos sistemas están particularmente bien caracterizados en bacterias Gram negativas, donde al menos se distinguen siete sistemas (tipos 1-6 y el sistema de las “argininas gemelas”) (Sibbald y van Dijl (2009) Bacterial secreted proteins: secretor y mechanisms and role in pathogenesis. Ed. Wooldridge, Caister Academic Press) . En bacterias Gram positivas, grupo taxonómico que comprende a la mayor parte de cepas probióticas, las proteínas extracelulares serían exportadas por sistemas análogos.

Hasta la fecha, la bioinformática ha sido el útil de identificación de proteínas extracelulares en probióticos, y sólo una pequeña parte ha sido bien identificada o caracterizada experimentalmente. Entre las proteínas extracelulares producidas por las bifidobacterias, podemos mencionar el inhibidor de serín-proteasas (serpina) , producido por distintas especies de bifidobacterias (Turroni y cols. (2010) Characterization of the serpin-encoding gene of Bifidobacterium breve 210B. Appl. Environ. Microbiol. 76, 3206-3219) . Esta proteína inhibe eficientemente tanto las elastasas secretadas por el páncreas exocrino como por los neutrófilos, células inmunitarias implicadas en procesos inflamatorios. Por esta razón, se ha postulado que la serpina podría ser la responsable de alguno de los efectos anti-inflamatorios de las bifidobacterias. También se ha sugerido que proteínas secretadas por una cepa de Bifidobacterium breve sería capaz de producir factores solubles, muy probablemente pequeños péptidos, que tras interaccionar con las CDs reducirían los procesos inflamatorios a nivel del epitelio intestinal (Heuvelin... [Seguir leyendo]

1. Un péptido ST con propiedades inmunomoduladoras y/o antiinflamatorias, caracterizado porque: a) es segregado por una bacteria Lactobacillus, b) su secuencia aminoacídica tiene un contenido de al menos el 50% de los aminoácidos serina y treonina, y c) comprende un fragmento de al menos 30 kDa sin puntos de corte para al menos una proteasa intestinal.

2. El péptido según la reivindicación 1, caracterizado porque la bacteria Lactobacillus es Lactobacillus plantarum.

3. El péptido según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la cepa de Lactobacillus plantarum se selecciona de entre el siguiente grupo: Lb. plantarum NCIMB 8826, Lb. plantarum 299V, y Lb. plantarum BMCM12.

4. El péptido según las reivindicaciones 1 y 3, caracterizado porque su secuencia aminoacídica tiene al menos entre u.

80. 100% de homología con SEQ ID No: 1.

5. El péptido según las reivindicaciones 1 - 4, caracterizado porque su secuencia aminoacídica es SEQ ID No: 1,

o su ortólogo.

6. El péptido según las reivindicaciones 1 - 5, caracterizado porque la proteasa intestinal se selecciona de entre el siguiente grupo: pepsina, tripsina, quimiotripsina, y combinaciones de las mismas.

7. Un método de tratamiento y/o prevención de una afección intestinal, caracterizado por comprender la administración a un paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido ST definido en las reivindicaciones 1 - 6, para activar el proceso de tolerancia inmunológica hacia las bacterias comensales del intestino de dicho paciente.

8. El método de tratamiento y/o prevención según la reivindicación 7, caracterizado porque la afección intestinal es una enfermedad inflamatoria seleccionada entre una enfermedad inflamatoria intestinal, o una inflamación celiaca.

9. El método de tratamiento y/o prevención según la reivindicación 8, caracterizado porque la enfermedad inflamatoria intestinal se selecciona entre el siguiente grupo: la enfermedad de Chron, la colitis ulcerosa y la pouchitis.

10. El método de tratamiento y/o prevención según la reivindicación 7, caracterizado porque la afección intestinal está provocada por una enfermedad autoinmune o una enfermedad causada por la des-regulación en la composición de la microbiota intestinal.

11. El método de tratamiento y/o prevención según las reivindicaciones 7 – 10, caracterizado porque la administración a un paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido ST comprende:

a) inducir en las células dendríticas de dicho paciente la producción de una citoquina anti-inflamatoria y homeostática, y/o b) bloquear en las células dendríticas de dicho paciente la producción de una citoquina pro-inflamatoria.

12. El método de tratamiento y/o prevención según la reivindicación 11, caracterizado porque la citoquina antiinflamatoria y homeostática es la interleuquina 10.

13. El método de tratamiento y/o prevención según las reivindicaciones 11 – 12, caracterizado porque la citoquina pro-inflamatoria es la interleuquina 12.

14. El método de tratamiento y/o prevención según las reivindicaciones 11 – 13, caracterizado porque dichas células dendríticas inducen a su vez la maduración de linfocitos T los cuales:

a) adquieren un perfil de migración a piel, y/o b) adquieren un perfil de producción de citoquinas no pro-inflamatorias.

15. El método de tratamiento y/o prevención según la reivindicación 14, caracterizado porque el perfil de migración a piel definido en a) comprende un descenso en la expresión del marcador de migración a mucosa intestinal integrina β7 y un aumento en la expresión del marcador de migración a piel CLA.

16. El método de tratamiento y/o prevención según la reivindicación 14, caracterizado porque el perfil de producción de citoquinas no pro-inflamatorias definido en b) comprende un descenso en la expresión de citoquinas pro

inflamatorias IFNγ e interleuquina 17.

17. El método de tratamiento y/o prevención según las reivindicacione.

7. 16, caracterizado porque el péptido ST definido en las reivindicaciones 1 – 6 se encuentra contenido en un alimento funcional o en una composición farmacéutica.

18. Un alimento funcional caracterizado por comprender una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido ST definido en las reivindicaciones 1 – 6.

19. Una composición farmacéutica caracterizada por comprender una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido ST definido en las reivindicaciones 1 – 6.

20. Uso del péptido ST definido en las reivindicaciones 1 – 6 en una aplicación cosmética.

FIG. 1

FIG. 2

A.

SEQ ID NO: 2

B.

PéptidoST

GEVDGDSTTTTSTSTQTTQQTTTTQSSAQTSQTQAQPSQASQTQSSQTQTSKPAAQTTQTSSSTSNYHHHHHH

SEQ ID NO: 1

FIG. 3

A.

Ch_lo_Pn1.3_Pn2 Pn1.3_Pn2| Ch_lo_Pn1.3_Pn2 || Pn1.3_Pn2| ||

|||| || NLILVGQQLEVNGDSTTTTSTSTQTTQQTTTTQSSAQTSQTQAQPSQASQTQSSQTQTSK

---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

SEQ ID NO: 3

B.

Ch_hi_Ch_lo_Pn1.3 Pn1.3| Ch_lo_Pn1.3_Pn2 || Ch_hi_Ch_lo_Pn1.3_Pn2| || Pn1.3|| || Ch_lo_Pn1.3_Pn2 ||| || Ch_hi_Ch_lo_Pn1.3 | ||| || Pn1.3_Tr y ps| | ||| || Ch_hi_Ch_lo_Pn1.3 || | ||| || Pn1.3| || | ||| || Tr y ps || || | ||| || Ch_hi_Ch_lo_Pn1.3 | || || | ||| || Pn1.3| | || || | ||| || Tr y ps || | || || | ||| || Ch_hi_Ch_lo | || | || || | ||| || Ch_hi_Ch_lo_Pn1.3 Pn1.3| | || | || || | ||| || Pn1.3| Tr y ps|| | || | || || | ||| ||

|| ||| | || | || ||| ||| || PAAQTTQTSSSTSNYSNNGSDSAAKAWIAGKESGGSYSARNGQYIGKYQLSASYLNGDYS 121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180

SEQ ID NO: 4

ABREVIATURAS

* Ch-hi • Corte de la quimotripsina (alta especificidad) (C-terminal de la secuencia [FYW], excepto antes de P)

* Ch-lo • Corte de la quimotripsina (baja especificidad) (C-terminal de la secuencia [FYWML], excepto antes de P)

* Pn1.3 • Pepsina (pH1.3)

* Pn2 • Pepsina (pH>2)

* Tr y ps • Tripsina

FIG. 4

FIG. 5

a)

b)

FIG. 6

FIG. 7

FIG. 8

FIG. 9

Numbersers

Numb

c)

FIG. 10

Resting T-cells Basal LDC 10 μg/ml BP LDC 1 μg/ml BP LDC 0.1 μg/ml BP LDC

LPS LDC

IFNγ in T-cellsIFNγ in T cells IL-10 in T-cells

TGFβ in T-cells TGFβ in T cells Resting T-cells LPS LDC 10 μg/ml BP LDC 1 μg/ml BP LDC 0.1 μg/ml BP LDC

Basal LDC

IL-17 in T-cells

IL17i T ll

FIG. 11

FIG. 12

IL10 IL17 IFNg

TGFb

Resting T-cells

Number 0 200 400 600 800 1000 1200 140

Number Number

Number

Number Number

100 101 102 103 104 IL17 FL2-H

100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 IFNg FL4-H IL10 FL4-H

3% Basal gut DC

Number

Number

2 4 6 8101214

3% Peptide gut DC

5 10 15 20 25 30 Number 02 4 6 810

2 4 6 8 10121416

Number 0 5 10152025

100 101 102 103 104 IL17 FL2-H 100 101 102 103 104

100 101 102 103 104 100 101 102 103 104

TGFb FL2-H IL10 FL4-H IFNg FL4-H

5 1015202530354045

Number 0 1020304050

Number

IFNg FL4-H

100 101 102 103 104

100 101 102 103 104 100 101 102 103 104

IL10 FL4-H IL17 FL2-H

FIG. 13

CLA

b7

Number 0 5 10 15 20 25 Number

Number 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

Number 0 5 10 15 20 Number Number 0 2 4 6 810

Resting T-cells

3% Basal gut DC

3% Peptide gut DC

100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 B7 FL2-H CLA FL4-H

100 101 102 103 104 B7 FL2-H

100 101 102 103 104 CLA FL4-H

78% IR 22.7

100 101 102 103 104 CLA FL4-H

FIG. 14

IL-10

basal +BP

100 101 102 103 104 100 101 102 103 104

IL-12

100 101 102 103 104

Lista de Secuencias