Derivado oxidado del ácido hialurónico, un método para su preparación y un método para su modificación.

Un derivado de ácido hialutónico, oxidado en la posición 6 de la parte de glucosamina a aldehído de acuerdo con la fórmula X

, y su forma hidratada, el diol denominado geminal de acuerdo con la fórmula Y.**Fórmula**

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/CZ2010/000128.

Solicitante: CONTIPRO PHARMA, A.S.

Nacionalidad solicitante: República Checa.

Dirección: DOLNI DOBROUC 401 561 02 DOLNI DOBROUC REPUBLICA CHECA.

Inventor/es: VELEBNÝ,VLADIMÍR, NEMCOVA,MIROSLAVA, BUFFA,RADOVAN, KETTOU,SOFIANE, POSPISILOVÁ,LUCIE.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > COMPUESTOS MACROMOLECULARES ORGANICOS; SU PREPARACION... > POLISACARIDOS; SUS DERIVADOS (polisacáridos que... > C08B37/00 (Preparación de polisacáridos no previstos en los grupos C08B 1/00 - C08B 35/00; Sus derivados (celulosa D21))

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Fragmento de la descripción:

Derivado oxidado del ácido hialurónico, un método para su preparación y un método para su modificación Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para la preparación de un nuevo derivado de ácido hialurónico que contiene un grupo aldehido -CH= en vez del grupo hidroxilo primario -CH2-OH. La oxidación se puede realizar usando el agente DPM (periodinano de Dess-Martin) en disolventes polares apróticos.

**(Ver fórmula)**

DMP- periodinano de Dess-Martin en el que el disolvente incluye, por ejemplo, sulfóxido de dimetilo.

Antecedentes de la invención

El ácido hialurónico es un polisacárido importante compuesto por dos unidades repetidas de ácido |3-(1,3)-D- glucurónico y p-(1,4)-N-acetil-D-glucosamina. El peso molecular está en el intervalo de 5.14 a 5.16 g.mol'1 dependiendo del método de aislamiento y del material fuente. El ácido hialurónico o su sal sódica hialuronano es un componente esencial de los tejidos conectares, fluido sinovial de articulaciones, y desempeña un papel importante en procesos biológicos tales como hidratación, organización de proteoglicanos, diferenciación, proliferación de células y angiogénesis. El ácido hialurónico es un polisacárido considerablemente hidrófilo que es soluble en agua en forma de su sal dentro del intervalo de pH total.

**(Ver fórmula)**

CHjCO

Ácido hialurónico

Oxidación de ácido hialurónico

La oxidación de polisacáridos es un proceso en el que el grado de oxidación de los grupos funcionales de polisacárido es cambiante. Muy frecuentemente se forman los ácidos carboxílicos o aldehidos que pueden cambiar espectacularmente las propiedades de los polisacáridos. En la mayoría de los casos, la reacción se realiza usando agentes que contienen átomos en grados de oxidación superiores.

Se usó el método de oxidación selectiva de sacáridos en el grupo hidroxilo primario, descrito por Angelino, European Journal of Organic Chemistry, 26, 19, 4323-4326, el sistema de 2,2,6,6-tetrametil-1 -piperidiniloxilo radical TEMPO/TCC en DMF a la temperatura de °C, con el aldehido correspondiente como producto principal.

La oxidación de ciclodextrina a monoaldehído ha sido descrita por Cornwell, Tetrahedron Letters 1995, 36 (46), 8371-8374. La oxidación se realizó añadiendo periodinano de Dess-Martin (DMP) en DMSO o en DMF a la temperatura de 2°C como agente oxidante.

La oxidación mediada por 2,2,6,6-tetrametil-1 -piperidiniloxilo radical (TEMPO)- y NaOCI del grupo hidroxilo primario de hialuronano a ácido carboxílico se realizó a pH 1,2 y a la temperatura de °C (Esquema 2) (Carbohydr Res 2, 327 (4), 455-61):

C2Na Na2C

ch3co/

Esquema 2: Oxidación a ácido carboxílico

''Eo;

HO

COOH HO- OH

**(Ver fórmula)**

/

CHjCO

NH-

TEMPO

NaOCI

Análogamente a lo observado en otros polisacárldos, se observó una alta regloselectlvldad y una ligera degradación del polímero. Un aumento de la concentración de la sal (NaBr, NaCI, Na2S4) en la solución causó una disminución de la velocidad de oxidación.

En la solicitud de patente WO 2/18448 A2 se describe la oxidación de hlaluronano al usar el sistema TEMPO/NaCIO. Los autores consideraron también las Interacciones de polisacárldos percarboxllados mientras que se formaban complejos biológicos.

**(Ver fórmula)**

Esquema 3. Oxidación a dialdehído

La velocidad de oxidación de HA usando peryodato sódico fue estudiada por Scott y otros (Esquema 3) (Hlstochemle 1969, 19(2), 155-61). Se estudiaron y cuantlflcaron factores tales como longitud de cadena, sustitución, configuración del polímero y temperatura. También se consideró en las patentes U.S. n°. 6 683 64 y n°. 6 953 784 el uso de Nal4 para una oxidación del ácido hlalurónlco.

Se estudiaron reacciones modelo de análogos de HA de un peso molecular bajo en un tampón fisiológico (Carbohydrlc Res 1999, 321, (3-4), 228-34). Se identificaron por análisis de GC-EM los productos de oxidación de las partes glucurónlca y de glucosamlna. Los resultados sugirieron que la oxidación se realiza principalmente en la parte glucurónlca, mientras que la parte de ácido mesotartárico es el producto principal y se puede usar como biomarcador de la oxidación de hialuronano.

3.4.2. Uso de un HA oxidado en reacciones de reticulación

Weng y otros (Esquema 4), J. Biomed. Mater Res. A 28, 85 (2), 352-65, han descrito el uso de un Ha oxidado para la preparación de hidrogeles reticulados. Se usaron dos precursores en este caso: un hlaluronano parcialmente oxidado y gelatina

**(Ver fórmula)**

Esquema 4. Reacción de reticulación del hialuronano oxidado y gelatina

Las propiedades fisicoquímicas de los hidrogeles resultantes se han elucidado por análisis instrumental de FT-IR, SEM (microscopía electrónica de barrido) y reometría. El aumento del grado de oxidación del hialuronano condujo a un aumento de la compatibilidad de hidrogeles y una disminución de la capacidad de absorción de agua. Se usaron dermoblastos dérmicos para estudiar las interacciones célula-hidrogel. Tanto los hidrogeles como sus productos de degradación son biocompatibles como lo demuestra el ensayo de viabilidad de células a largo plazo. Cuando se cultivó con células, el hidrogel experimentó degradación en 4 semanas, con una obvia pérdida de cohesión. La buena biocompatibilidad y capacidad biodegradación se demostró además en implantes subdérmicos de ratones. Finalmente, por análisis de SEM se demostraron depósitos in vitro e in vivo de matriz extracelular en hidrogeles.

En la publicación de Weng y otros, Biomaterials 28, 29, (31), 4149-56, se describió el método de preparación de HA reticulado de un hialuronano oxidado y gelatina por un método de emulsión de agua en aceite, en el que se forma un hidrogel tridimensional en ausencia de cualquier reticulador externo. En este trabajo se estudió por HPLC la incorporación de fármacos modelo en la estructura del hidrogel (encapsulación) y su liberación mediante macrófagos.

Sahiner y otros, (Esquema 5), J. Biomater. Sci. Polym. Ed 28, 19 (2), 223-43, describieron la preparación de hidrogeles elásticos por acoplamiento de HA oxidado a HA-aldehído mediante peryodato sódico y el HA modificado

con dihidrazida de ácido adípico.

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Esquema 5. Preparación del hialuronano reticulado

Los derivados resultantes no tienen efecto observable alguno sobre la proliferación de los fibroblastos cultivados, 5 según lo revela el ensayo MTT.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un método de oxidación selectiva del grupo hidroxilo primario de ácido hialurónico en la posición 6 de la parte de glucosamina del polisacárido a aldehido. La reacción se realiza en un medio aprótlco usando perlodlnano de Dess-Martln DMP como agente oxidante. El presente método es original en 1 cuanto a que introduce un grupo aldehido en la posición 6 de la parte de glucosamina del hialuronano (esquema 6, estructura 3). Enfoques publicados hasta ahora han Introducido un grupo aldehido en la posición 2 y 3 de la parte glucurónica del hialuronano, mientras que se abre el anillo del sacárido (esquema 6, estructura 2), o un grupo carboxllo en la posición 6 de la parte de glucosamina de hialuronano (esquema 6, estructura 1).

**(Ver fórmula)**

Esquema 6. Oxidación de hialuronano, productos de reacción

El método de acuerdo con la invención es más ventajoso en cuanto a que el producto de oxidación respectivo (estructura 3, esquema 6) mantiene la estructura de los anillos de sacárido conjugados. La apertura del anillo en el producto oxidado a dialdehído (estructura 2, esquema... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un derivado de ácido hialutónico, oxidado en la posición 6 de la parte de glucosamina a aldehido de acuerdo con la fórmula X, y su forma hidratada, el diol denominado geminal de acuerdo con la fórmula Y.

**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**

2. Un método de preparación del derivado de ácido hialurónico de la reivindicación 1, en el que el ácido hialurónico reacciona con periodinano de Dess-Martin (DMP) en un disolvente aprótico polar, especialmente en sulfóxido de dimetilo.

3. El método de preparación de la reivindicación 2, en el que el ácido hialurónico está en forma de ácido libre o una sal.

4. El método de preparación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, en el que el peso molecular del ácido hialurónico está en el intervalo de 1.14 a 5.1® g.mol'1.

5. El método de preparación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que la reacción del ácido hialurónico con periodinano de Dess-Martin (DMP) se realiza a una temperatura en el intervalo de 1 a 5°C, preferiblemente a 2°C, durante 5 minutos a 15 horas, preferiblemente durante como mínimo 1 horas.

6. El método de preparación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que el DMP está presente en una cantidad en el intervalo de ,5 a 1 equivalente respecto al dímero de ácido hialurónico.

7. El método de modificación del derivado de ácido hialurónico preparado usando el método de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que el derivado de ácido hialurónico oxidado reacciona con una amina de fórmula general H2N-R o con un hialuronano sustituido por un grupo -R-NH2-, en el que R es un alquilo C1.3 de cadena lineal o ramificada, que opcionalmente contiene grupos aromáticos o heteroaromáticos.

8. El método de modificación de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el derivado de ácido hialurónico oxidado reacciona con un aminoácido.

9. El método de modificación de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el derivado de ácido hialurónico oxidado reacciona con un péptido.

1. El método de modificación de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el derivado de ácido hialurónico oxidado reacciona con un polisacárido que contiene un grupo amino libre.

11. El método de modificación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 1, en el que la cantidad de amina, aminoácido, péptido o polisacárido está en el intervalo de ,5 a 1 equivalentes respecto al dímero de hialuronano.

12. El método de modificación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que la reacción del derivado de ácido hialurónico oxidado con la amina, el aminoácido, el péptido o el polisacárido se realiza en agua o en un sistema agua-disolvente orgánico a una temperatura en el Intervalo de a 8°C, preferiblemente a 2°C, durante 1 minuto a 24 horas, preferiblemente durante 1 hora.

13. El método de modificación de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la reacción del derivado de ácido hialurónico oxidado con la amina, el aminoácido, el péptido o el polisacárido se realiza en presencia de NaBhhCN como agente de reducción, que se añade a la mezcla de reacción después de a 1 horas de haber añadido la amina, el aminoácido, el péptido o el polisacárido.

14. El método de modificación de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la cantidad de NaBH3CN como agente de reducción está en el intervalo de a 2 equivalentes molares respecto a la cantidad de aldehido o diol geminal.

15. El método de modificación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que el disolvente orgánico se selecciona entre el grupo que comprende alcoholes miscibles con agua, especialmente isopropanol o etanol, y por disolventes apróticos polares miscibles con agua, en especial sulfóxido de dimetilo.

16. El método de modificación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que la cantidad de agua es de como mínimo 5% (v/v) respecto al volumen de la solución total.