Oligonucleótidos modificados para discriminación de desapareamiento.

Un oligonucleótido modificado que comprende al menos una base de la base de pirimidina 5-sustituida y al menos una base de pirazolo[3,

4-d]pirimidina no sustituida o 3-sustituida, en el cual dicha al menos una base de pirimidina 5-sustituida tiene una fórmula que consiste en:

en la que al menos un base de pirazolo[3,4-d]pirimidina no sustituida o 3-sustituida está que consiste en en la que cada uno de los grupos X1 , X2 y X3 es un miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en H, OH, NH2 y un grupo amino protegido; y

cada uno de dichos grupos R1 y R4 es un miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en heteroalquilo(C1-C12), heteroalquenilo(C2-C12), heteroalquinilo(C2-C12), -O-(alquilo C1-C12), -O-(alquenilo C2-C12), -O- (alquinilo C2-C12), -S-(alquilo C1-C12), -S-(alquenilo C2-C12), -S-(alquinilo C2-C12), heterociclil(alquilo C1-C12), heterociclil(alquenilo C2-C12), heterociclil(alquinilo C2-C12), aril(alquilo C1-C12), aril(alquenilo C2-C12), aril(alquinilo C2- C12), arilo, heterociclilo, halógeno, -CN, -CONH2 y las formas protegidas de los mismos,

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E08075235.

Solicitante: EPOCH BIOSCIENCES, INC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 21720 23RD DRIVE SE, SUITE 150 BOTHELL, WA 98021 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: VERMEULEN, NICOLAAS M.J., KUTYAVIN,IGOR,V, GALL,ALEXANDER,A, DEMPCY,ROBERT,O, AFONINA,IRINA,A, SINGER,MICHAEL,J, LOKHOV,SERGEY,G.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07H19/06 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 19/00 Compuestos que contienen un heterociclo que comparten un heteroátomo del ciclo con un radical sacárido; Nucleósidos; Mononucleótidos; Sus anhidro-derivados. › Radicales de pirimidina.
  • C12Q1/68 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

PDF original: ES-2391213_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Oligonucleótidos modificados para discriminación de desapareamiento.

Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional Número de serie 60/186.046, presentada el 1 de marzo de 2000 y la solicitud número de serie 09/724.959, presentada el 28 de noviembre de 2000.

Indicación de los derechos de invención realizada bajoinvestigación y desarrollo patrocinados federalmente

No aplicable

Antecedentes de la invención

La presente solicitud se enmarca en el campo de la biología molecular relacionada con el uso de oligonucleótidos como sondas y cebadores en ensayos en fase líquida, sólida y mixta. La solicitud se refiere además al uso de bases de ácidos nucleicos modificadas y oligonucleótidos modificados para mejorar las propiedades de hibridación y las capacidades discriminatorias de oligonucleótidos que se emplean en matrices y como sondas y cebadores.

Muchas técnicas actualmente en uso en la biología molecular emplean oligonucleótidos como sondas y/o cebadores. A menudo resulta ventajoso, en la práctica de estas tecnologías, podere distinguir entre dos o más secuencias que están relacionadas pero que se diferencian en uno o más nucleótidos. Por ejemplo, muchas mutaciones de importancia clínica se diferencian sólo en un único nucleótido de a la secuencia de tipo salvaje. Los polimorfismos en los genomas de mamífero a menudo también se caracterizan por diferencias en la secuencia de uno o unos pocos nucleótidos. La capacidad para realizar tal distinción se conoce como discriminación de desapareamientos. En términos prácticos, la discriminación de desapareamientos describe la propiedad mediante la cual un oligonucleótido de secuencia definida, a una rigurosidad concreta, se hibrida con gran fuerza (una manifestación de ello es que los híbridos tienen un alto punto de fusión) con una secuencia diana con la que es complementaria a lo largo de su longitud completa (un híbrido perfecto o un apareamiento perfecto) , pero se hibrida, de una manera detectable, de forma más débil con una secuencia diana que no es complementaria con la secuencia del oligonucleótido en uno o unos pocos nucleótidos (un desapareamiento) . Las diferencias en la fuerza de hibridación son tales que puede seleccionarse una rigurosidad concreta en la que un apareamiento perfecto es detectable como un híbrido y un desapareamiento no puede formar un híbrido.

En un dúplex de ácido nucleico, cada par de bases contribuye a la estabilidad. Por tanto, cuanto más corto sea el dúplex, mayor será la contribución relativa de cada par de bases individual a la estabilidad del dúplex. Como resultado, la diferencia en la estabilidad entre un apareamiento perfecto y un desapareamiento será mayor para oligonucleótidos más cortos. Sin embargo, los oligonucleótidos cortos se hibridan de forma débil, incluso con una secuencia perfectamente complementaria, y por tanto deben hibridarse bajo condiciones de rigurosidad reducida. Por tanto, el poder discriminatorio potencial de oligonucleótidos cortos no puede obtenerse con facilidad excepto bajo condiciones de baja rigurosidad.

En la técnica se necesitan nuevos procedimientos para la discriminación de desapareamientos, en particular desapareamientos de un único nucleótido, bajo condiciones de alta rigurosidad, por ejemplo, a las elevadas temperaturas características de la mayoría de las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos. De forma sorprendente, la presente invención proporciona dichos procedimientos, junto con nuevos reactivos y composiciones que pueden utilizarse en los procedimientos.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una serie de oligonucleótidos modificados como se menciona en la reivindicación 1, que se ha descubierto que poseen unas propiedades y una utilidad excepcionales en una diversidad de ensayos. Por consiguiente, la presente invención también proporciona procedimientos para utilizar los oligonucleótidos modificados descritos en la presente.

En un aspecto, la presente invención proporciona oligonucleótidos modificados que tienen al menos dos bases seleccionadas de base de pirazolo[3, 4-d]pirimidina no sustituida y 3-sustituida como se menciona en la reivindicación 1. En realizaciones preferidas, los oligonucleótidos que tienen bases modificadas comprenderán además otros restos, tales como marcadores detectables, extintores de fluorescencia y de quimioluminiscencia y/o ligantes del surco menor y/u otros tipos de bases modificadas o análogos de bases.

En otro aspecto, la presente invención proporciona oligonucleótidos modificados que tienen al menos una base de pirimidina 5-sustituida y al menos una base de pirazolo[3, 4-d]pirimidina 3-sustituida como se menciona en la reivindicación 1. En realizaciones preferidas, estos oligonucleótidos modificados comprenderán además otros restos (como anteriormente) tales como marcadores extintores de fluorescencia y quimioluminiscencia y/o ligantes de surco menor detectables.

En otro aspecto, la presente invención proporciona procedimientos para distinguir polinucleótidos que tienen secuencias relacionadas.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona procedimientos para detectar la presencia de una secuencia diana en un polinucleótido.

En otros aspectos más, la presente invención proporciona procedimientos para la extensión de cebadores, y procedimientos para determinar la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido.

En aspectos relacionados más, la presente invención proporciona procedimientos para estudiar la expresión génica en una célula, y procedimientos para identificar una mutación o un polimorfismo en una secuencia diana de un gen de interés.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona una serie de bases modificadas que son útiles para preparar oligonucleótidos modificados para los procedimientos descritos en la presente y otros procedimientos y ensayos convencionales.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona matrices de oligonucleótidos modificados en las que los miembros de la matriz tienen unas Tm diferente aproximadamente en 1-2 ºC, y unas longitudes diferentes aproximadamente en 1-2 bases entre ellos. También se proporcionan procedimientos para determinar las secuencias de los miembros de la matriz.

Breve descripción de la invención

Las figuras 1A y 1B proporcionan las estructuras de varias bases modificadas y sus abreviaturas. La línea ondulada se utiliza para indicar la posición de un resto azúcar unido (sin proteger, protegido, activado y similares) . La figura 2 es una gráfica que ilustra el equilibrio de la Tm de sondas de 8 meros ricas en GC y ricas en AT con diferentes combinaciones de MGB, PPPA y PU. La figura 3 es un gráfica que ilustra una ventaja lograda mediante el uso de PPPA y PPG en sondas oligonucleotídicas modificadas con MGB. Como puede observarse en la figura, las bases modificadas permiten acortar la sonda que muestre una mayor discriminación de desapareamientos en una PCR atiempo real. Ã es PPPA y Ĝ es PPG. Sonda FAM modificada con MGB = SEQ ID NO:1; complemento de la sonda FAM modificada con MGB = SEQ ID NO:2; complemento de la sonda FAM modificada con MGB que contiene PPPA y PPG = SEQ ID NO:3; sonda FAM modificada con MGB que contiene PPPA y PPG = SEQ ID NO:4. La figura 4 ilustra un ensayo Invader™ en que pueden utilizarse los oligonucleótidos modificados de la invención. La figura 5 ilustra la comparación de la actuación de la sonda de Invader™ con diferentes números de PPG.

Descripción de la invención

Abreviaturas y definiciones

Las abreviaturas para una serie de bases modificadas descritas en la presente se proporcionan como sigue (las estructuras de estas bases se muestran en las figuras 1A y 1B) : 6-amino-3-prop-1-inil-5-hidropirazolo[3, 4-d]pirimidin4-ona, PPPG; 6-amino-3- (3-hidroxiprop-1-inil) -5-hidropirazolo[3, 4-d]pirimidin-4-ona, HOPPPG; 6-amino-3- (3aminoprop-1-inil) -5-hidropirazolo[3, 4-d]pirimidin-4-ona, NH2PPPG; 4-amino-3- (prop-1-inil) pirazolo[3, 4-d]pirimidina, PPPA; 4-amino-3- (3-hidroxiprop-1-inil) pirazolo[3, 4-d]pirimidina, HOPPPA; 4-amino-3- (3-aminoprop-1-inil) pirazolo[3, 4d]pirimidina, NH2PPPA; 3-prop-1-inilpirazolo[3, 4-d]pirimidin-4, 6-diamino, (NH2) 2PPPA; 2- (4, 6-diaminopirazolo[3, 4d]pirimidin-3-il) etin-1-ol, (NH2) 2PPPAOH; 3- (2-aminoetinil) pirazolo[3,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un oligonucleótido modificado que comprende al menos una base de la base de pirimidina 5-sustituida y al menos una base de pirazolo[3, 4-d]pirimidina no sustituida o 3-sustituida, en el cual dicha al menos una base de pirimidina 5-sustituida tiene una fórmula que consiste en:

en la que al menos un base de pirazolo[3, 4-d]pirimidina no sustituida o 3-sustituida está que consiste en

en la que cada uno de los grupos X1 , X2 y X3 es un miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en H, OH, NH2 y un grupo amino protegido; y cada uno de dichos grupos R1 y R4 es un miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en

heteroalquilo (C1-C12) , heteroalquenilo (C2-C12) , heteroalquinilo (C2-C12) , -O- (alquilo C1-C12) , -O- (alquenilo C2-C12) , -O (alquinilo C2-C12) , -S- (alquilo C1-C12) , -S- (alquenilo C2-C12) , -S- (alquinilo C2-C12) , heterociclil (alquilo C1-C12) , heterociclil (alquenilo C2-C12) , heterociclil (alquinilo C2-C12) , aril (alquilo C1-C12) , aril (alquenilo C2-C12) , aril (alquinilo C2-C12) , arilo, heterociclilo, halógeno, -CN, -CONH2 y las formas protegidas de los mismos,

2. Un oligonucleótido modificado de la reivindicación 1, que comprende además un ligante del surco menor unido de

modo covalente. 3. Un oligonucleótido modificado de la reivindicación 1, que comprende además al menos un grupo indicador unido de modo covalente.

4. Un oligonucleótido modificado de la reivindicación 1, que comprende además al menos un extintor unido de modo 25 covalente.

5. Un oligonucleótido modificado de la reivindicación 3, en el que dicho grupo indicador es un fluoróforo.

6. Un oligonucleótido modificado de la reivindicación 3, en el que dicho grupo indicador es un fluoróforo, y dicho oligonucleótido modificado comprende además un extintor unido.

7. Un oligonucleótido modificado de la reivindicación 1, que comprende de 4 a 70 bases.

8. Un oligonucleótido modificado de la reivindicación 1, que comprende de 4 a 70 bases, y que comprende además un ligante del surco menor unido.

9. Un oligonucleótido modificado de la reivindicación 1, que comprende de 4 a 70 bases, y que comprende además

un fluoróforo unido y un extintor.

10. Un oligonucleótido modificado de la reivindicación 2, que comprende de 4 a 70 bases, y que comprende 35 además un fluoróforo unido y un extintor.

11. Un oligonucleótido modificado de la reivindicación 1, que tiene la fórmula:

R2 representa un primer extremo de dicho oligonucleótido modificado; R3 representa un segundo extremo de dicho oligonucleótido modificado; el subíndice n es un número entero de 4 a 70;

cada B es un miembro seleccionado independientemente del grupo que consiste en adenina, timina, citosina, guanina, uracilo, una piramidina -5-sustituida, y una pirazolo[3, 4-d]pirimidina 3-sustituida; y cada M es un miembro seleccionado del grupo que consiste en un azúcar formador de oligómero y un aminoácido formador de ácidos nucleicos peptídicos.

12. Un oligonucleótido modificado de la reivindicación 11, en el que al menos un M es un azúcar formador de oligómero bloqueado

13. El uso de compuesto para preparr el oligonucleótido modificado de la reivindicación 1, teiendo el compuesto la fórmula:

en la que:

Z1 es un miembro seleccionado del grupo que consiste en H, F y ORa, en el que Ra es un miembro seleccionado del grupo que consiste en H, alquilo (C1-C8) y un grupo protector de hidroxi; Z2 es un miembro seleccionado del grupo que consiste en H y alquilo (C1-C8) , u opcionalmente Z2 se

combina con Z1 para formar un anillo de cinco o siete miembros; Y1 es O-P1, en el que P1 es una fosforamidita o un grupo H-fosfonato; Y2 es un miembro seleccionado del grupo que consiste en OH, y un grupo hidroxi protegido; O-P1 en el que P2 es es un fosforamidita, H-fosfonato, monofosdato, difosfato o trifosfato; y B es un nucleótido modificado seleccionado del grupo que consiste en:

en las que

X11 se seleccionan del grupo que consiste en H, NH2 y un grupo amino protegido; R11 se selecciona a del grupo que consiste en las formas protegidas o desprotegidas de 3-hidroxiprop-1inilo, 3-aminoprop-1-inilo, 3-metoxiprop-1-inilo, 4-hidroxi-1-butinilo, 3- (hidroximetil) -4-hidroxi-1-butinilo.

14. El uso de la reivindicación 13, en el cual B e.

15. El uso de la reivindicación 13, en el cual B es

16. El uso de la reivindicación 14, en el cual X11 es HN2.

17. El uso de la reivindicación 16, en el cual Y11 es O-P1, Y2 es un hidroxi protegido, Z1 es H, R11 se selecciona del grupo que consiste en 3-hidroxiprop-1-inilo, 3-aminoprop-1-inilo, 4-hidroxi-1-butinilo y 3- (hidroximetil) -4-hidroxi-110 butinilo.

18. El uso de la reivindicación 17, en el que Y1 es -O-[ (2-cianoetil) -N, N-diisopropilfosforamidita] e Y2 es -O- (4, 4’dimetoxitritilo) .

19. El uso de la reivindicación 15, en el que Y1 es O-P1, Y2 es un hidroxi protegido, Z1 es H, R11 se selecciona del grupo que consiste en 3-hidroxiprop-1-inilo, 3-aminoprop-1-inilo, 4-hidroxi-1-butinilo y 3- (hidroximetil) -4-hidroxi-115 butinilo.

20. Un compuesto de la reivindicación 19, en el que Y1 es -O-

 

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