Obtención de perfil de expresión génica en tejidos tumorales biopsiados.

Método de predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo de un paciente con cáncer de mama sin la recidiva de cáncer de mama

, tras la extirpación quirúrgica del tumor primario, que comprende

determinar mediante RT-PCR el nivel del transcrito de ARN de SURV en una muestra de tejido de cáncer de mama incrustado en cera, fijado obtenida de dicho paciente, normalizado frente al nivel de todos los transcritos de ARN sometidos a ensayo en dicha muestra, o un conjunto de referencia de transcritos de ARN,

en el que un aumento del nivel normalizado del transcrito de ARN de SURV en comparación con el nivel normalizado del transcrito de ARN de SURV en un conjunto de referencia de tejidos de cáncer de mama indica una reducción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo sin recidiva de cáncer de mama.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10158652.

Solicitante: GENOMIC HEALTH, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 301 PENOBSCOT DRIVE REDWOOD CITY, CA 94063 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: KIEFER, MICHAEL, C., BAKER,JOFFRE,B, SHAK,STEVE, CRONIN,MAUREEN,T, Walker,Michael G.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/09 (Tecnología del ADN recombinante)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/574 (para el cáncer)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/10 (Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > EQUIPOS PARA ENZIMOLOGIA O MICROBIOLOGIA (instalaciones... > C12M1/00 (Equipos para enzimología o microbiología)

PDF original: ES-2486265_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Obtención de perfil de expresión génica en tejidos tumorales biopsiados

Campo de la invención La presente invención se refiere a la obtención del perfil de expresión génica en tejidos tumorales biopsiados. En particular, la presente invención se refiere a métodos sensibles para medir los niveles de ARNm en tejidos tumorales biopsiados, incluyendo material de biopsia incrustado en parafina archivado. Además, la invención proporciona un conjunto de genes cuya expresión es importante en el diagnóstico y tratamiento del cáncer de mama.

Los oncólogos disponen de varias opciones de tratamiento, incluyendo diferentes combinaciones de fármacos quimioterápicos que se caracterizan como “tratamiento de referencia”, y varios fármacos que no portan un declarado en la etiqueta para un cáncer particular, pero para los que hay pruebas de eficacia en ese cáncer. La mejor

probabilidad de un buen desenlace del tratamiento requiere que los pacientes se asignen al tratamiento contra el cáncer disponible óptimo, y que esta asignación se haga lo más rápidamente como sea posible tras el diagnóstico.

Actualmente, las pruebas de diagnóstico usadas en la práctica clínica son de analito único, y por tanto no capturan el valor potencial de conocer las relaciones entre docenas de diferentes marcadores. Además, las pruebas de diagnóstico frecuentemente son no cuantitativas, basándose en inmunohistoquímica. Este método produce a menudo diferentes resultados en diferentes laboratorios, en parte porque los reactivos no están normalizados, y en parte porque las interpretaciones son subjetivas y no pueden cuantificarse fácilmente. Las pruebas basadas en ARN no se han usado a menudo debido al problema de la degradación del ARN a lo largo del tiempo y el hecho de que es difícil obtener muestras de tejido recientes de los pacientes para el análisis. Está más fácilmente disponible tejido incrustado en parafina fijado y se han establecido métodos para detectar ARN en tejido fijado. Sin embargo, estos métodos normalmente no permiten el estudio de grandes números de genes (ADN o ARN) a partir de pequeñas cantidades de material. Por tanto, pocas veces se ha usado tejido fijado de manera tradicional para otras cosas que para la detección inmunohistoquímica de proteínas.

Recientemente, varios grupos han publicado estudios referentes a la clasificación de diversos tipos de cáncer mediante análisis de la expresión génica con microalineamientos (véanse, por ejemplo Golub et al., Science 286:531-537 (1999) ; Bhattacharjae et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 98:13790-13795 (2001) ; Chen-Hsiang et al., Bioinformatics 17 (supl. 1) :S316-S322 (2001) ; Ramaswamy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:15149-15154 (2001) ) . También se han notificado ciertas clasificaciones de cánceres de mama humanos basándose en los patrones de expresión génica (Martin et al., Cancer Res. 60:2232-2238 (2000) ; West et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 98:11462-11467 (2001) ; Sorlie et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 98:10869-10874 (2001) ; Yan et al., Cancer Res. 61:8375-8380 (2001) ) . Sin embargo, estos estudios se centran en su mayor parte en mejorar y refinar la clasificación ya establecida de diversos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de mama, y generalmente no proporcionan nuevas percepciones en las relaciones de los genes expresados de manera diferencial, y no vinculan los hallazgos a estrategias de tratamiento con el fin de mejorar el desenlace clínico de la terapia contra el cáncer.

Aunque la moderna bioquímica y biología molecular han revelado más de 100 genes cuyas actividades influyen en el comportamiento de células tumorales, el estado de su diferenciación y su sensibilidad o resistencia a ciertos fármacos terapéuticos, con unas pocas excepciones, el estado de estos genes no se ha aprovechado para el fin de 45 tomar decisiones clínicas de manera rutinaria sobre los tratamientos farmacológicos. Una notable excepción es el uso de la expresión de la proteína de receptor de estrógenos (RE) en carcinomas de mama para seleccionar pacientes a tratamiento con fármacos antiestrógenos, tales como tamoxifeno. Otro ejemplo excepcional es el uso de la expresión de la proteína ErbB2 (Her2) en carcinomas de mama para seleccionar pacientes con el fármaco antagonista de Her2 Herceptin® (Genentech, Inc., South San Francisco, CA) .

A pesar de los recientes avances, el desafío del tratamiento contra el cáncer sigue siendo dirigir regímenes de tratamiento específicos a tipos de tumores patogénicamente distintos, y en última instancia personalizar el tratamiento tumoral con el fin de maximizar el desenlace. Por tanto, existe una necesidad de pruebas que proporcionan simultáneamente información predictiva sobre las respuestas de los pacientes a la variedad de 55 opciones de tratamiento. Esto es particularmente cierto para cáncer de mama, cuya biología se entiende mal. Está claro que la clasificación del cáncer de mama en unos cuantos subgrupos, tales como el subgrupo ErbB2+ y los subgrupos caracterizados por expresión génica de baja a ausente del receptor de estrógenos (RE) y unos cuantos factores de transcripción adicionales (Perou et al., Nature 406:747-752 (2000) ) no se refleja en la heterogeneidad celular y molecular del cáncer de mama, y no permite el diseño de estrategias de tratamiento que maximicen la respuesta del paciente El documento WO 02/10436 da a conocer un método de pronóstico de cáncer de mama basado en determinar el nivel de expresión de transcritos de ARN específicos. Se ensaya la expresión SURV, pero no se encuentra que esté asociada.

VAN ’T VEER ET AL, 2002 ("Gene Expression Profiling Predicts Clinical Outcome of Breast Cancer", NATURE, vol.

415, nº 6871, páginas 530-536) da a conocer perfiles de expresión de ARNm asociados con un mal desenlace en cánceres de mama. La tabla 2 complementaria enumera 231 genes indicadores de pronóstico, incluyendo BIRC5/SURV. Sin embargo, SURV no se selecciona para la firma de pronóstico de 70 genes.

Sumario de la invención Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un método de predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo de un paciente con cáncer de mama sin recidiva de cáncer de mama, tras la extirpación quirúrgica del tumor primario tal como se especifica en la reivindicación 1.

La presente invención adapta el uso de material de biopsia incrustado en parafina archivado para el ensayo de todos los marcadores en el conjunto, y por tanto es compatible con el tipo de material de biopsia más ampliamente disponible.

El aislamiento del ARN a partir de una muestra de tejido de cáncer de mama incrustado en cera, fijado del paciente puede llevarse a cabo, por ejemplo, siguiendo cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente o a lo largo de la solicitud, o mediante cualquier otro método conocido en la técnica.

Breve descripción de los dibujos La figura 1 es un gráfico que ilustra el flujo de trabajo del procedimiento de la invención para la medición de la expresión génica. En la figura, FPET significa “tejido incrustado en parafina fijado” y “RT-PCR” significa “PCR con transcriptasa inversa”. Se determina la concentración de ARN usando el protocolo y reactivo de cuantificación de ARN RiboGreen™ comercial.

La figura 2 es un diagrama de flujo que muestra las etapas de un método de extracción de ARN según la invención junto a un diagrama de flujo de un método comercial representativo.

La figura 3 es un esquema que ilustra las etapas de un método mejorado para preparar ARNm fragmentado para el 30 análisis de obtención del perfil de expresión.

La figura 4 ilustra métodos para la amplificación... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método de predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo de un paciente con cáncer de mama sin la recidiva de cáncer de mama, tras la extirpación quirúrgica del tumor primario, que comprende determinar mediante RT-PCR el nivel del transcrito de ARN de SURV en una muestra de tejido de cáncer de mama incrustado en cera, fijado obtenida de dicho paciente, normalizado frente al nivel de todos los transcritos de ARN sometidos a ensayo en dicha muestra, o un conjunto de referencia de transcritos de ARN,

en el que un aumento del nivel normalizado del transcrito de ARN de SURV en comparación con el nivel normalizado del transcrito de ARN de SURV en un conjunto de referencia de tejidos de cáncer de mama indica una reducción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo sin recidiva de cáncer de mama.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el cáncer de mama es cáncer de mama invasivo.

3. Método según la reivindicación 2, en el que el cáncer de mama invasivo es carcinoma ductal invasivo o carcinoma lobular invasivo.

4. Método según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que el conjunto de referencia de tejido de cáncer de mama consiste en al menos aproximadamente 30 muestras distintas fijadas de tejido de cáncer de mama incrustadas en parafina.

5. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el conjunto de referencia de tejido de cáncer de mama consiste en al menos aproximadamente 40 muestras distintas fijadas de tejido de cáncer de mama incrustadas en parafina.