OBTENCIÓN DE MOLUSCOS BIVALVOS TETRAPLOIDES A PARTIR DE PROGENITORES DIPLOIDES.

Obtención de moluscos bivalvos tetraploides a partir de progenitores diploides. La producción de bivalvos poliploides es en la actualidad objeto de un gran interés, en particular en lo que se refiere a las ostras. En efecto, las ostras triploides, denominadas igualmente ostras de las 4 estaciones, presentan varias ventajas. Debido a su número impar de cromosomas, normalmente son estériles, lo que les permite por una parte tener un crecimiento más rápido (al usarse su energía para el crecimiento más que para la reproducción), y por otra parte no producir lechaza durante los meses de verano, lo que les asegura una calidad constante durante todo el año. Las ostras triploides pueden obtenerse por cruzamiento de progenitores diploides, seguido de la retención del primer o del segundo glóbulo polar por tratamiento químico, generalmente con citocalasina B (CB) o en su caso con 6dimetil-aminopurina (6-DMAP), o por tratamiento físico (sobre todo choque térmico o de presión). Estas dos técnicas presentan sin embargo un cierto número de inconvenientes. Se citará sobre todo una falta de homogeneidad del nivel de ploidía; en efecto, los tratamientos que inducen la retención de los glóbulos polares conducen a poblaciones larvarias mezcladas, que poseen niveles de ploidía variados. Al final del desarrollo larvario, la población obtenida contiene generalmente como máximo el 90% de individuos triploides, estando constituido el resto de la población por diploides. Además, en el caso de los tratamientos químicos, estos, que usan productos muy tóxicos, son mal recibidos por el público, y necesitan implantar constantemente precauciones importantes para evitar todo peligro para los manipuladores. Por esta razón el procedimiento privilegiado actualmente para la producción de ostras triploides consiste en cruzar ostras tetraploides con ostras diploides. Este procedimiento presenta además la ventaja de que no necesita el recurso repetido a tratamientos químicos, la de conducir a una población homogénea cuya totalidad de individuos son triploides. El principal inconveniente de este procedimiento proviene de la dificultad de obtener progenitores tetraploides viables. La producción de larvas tetraploides, en proporciones variables, se ha observado en el curso de las experimentaciones de producción de triploides por cruzamiento de progenitores diploides y retención de la expulsión del primer glóbulo polar por tratamiento con citocalasina B (CB). Sin embargo, esta producción de larvas tetraploides parece transitoria; sólo se ha descrito durante las primeras 24 horas después de la fecundación (STEPHENS & DOWNING, J. Shellfish Res, 7, 550-51, 1988; GUO y col., Biol. Bull., 183, 381-93, 1992). Las larvas tetraploides detectadas ven caer a continuación su proporción drásticamente, de tal forma que no se detecta ninguna larva tetraploide ni durante el resto de la cría larvaria ni en el momento de la fijación y a fortiori durante las crías en microcriadero o en criadero. Se han emitido dos hipótesis con el fin de explicar el fracaso de todos los planteamientos usados con el fin de obtener tetraploides viables directamente a partir de progenitores diploides: De acuerdo con la primera de estas hipótesis, la tetraploidía conllevaría una carga genética incompatible con la supervivencia de las larvas debido a la expresión de ciertos alelos letales recesivos cuyo número de copias se encuentra cambiado después de la tetraploidización (hipótesis de los alelos letales recesivos). Sin embargo, las experiencias de ginogenia que usan líneas consanguíneas y silvestres tienden a mostrar que la expresión de los alelos letales recesivos no puede explicar por sí sola la totalidad de la mortalidad de tetraploides durante el estado larvario (GUO, Ph.D. Dissertation: Studies on tetraploid induction in the Pacific oyster, Crassostrea gigas., University of Washington, Seattle 1991). De acuerdo con la segunda de estas hipótesis (hipótesis de la relación núcleo-citoplasma), los ovocitos producidos por los progenitores diploides hembras poseen un tamaño demasiado bajo para sustentar un núcleo cuyo material genético se encuentra duplicado después de la tetraploidización. Es esta segunda hipótesis la que se ha privilegiado, y sobre esta base se han desarrollado los procedimientos propuestos hasta la actualidad para obtener ostras tetraploides viables. El primer procedimiento que se ha aplicado con éxito consiste en cruzar progenitores hembra triploides con progenitores macho diploides, y en bloquear la primera fase de la meiosis (MI) induciendo retención del primer glóbulo polar (Solicitud PCT WO-95/19.703; GUO & ALLEN, Mol Mar Biol Biotechnol 3, 42-50, 1994). Este procedimiento se basa en el hecho de que las raras hembras triploides que no son estériles producen ovocitos cuyo tamaño es muy superior al de los ovocitos producidos por las hembras diploides, lo que le permite sustentar un núcleo tetraploide. 2 ES 2 367 624 T3 Recientemente, se ha descrito igualmente la producción de ostras tetraploides viables a partir de un cruzamiento de machos tetraploides con hembras diploides, seleccionadas previamente por el gran tamaño de sus ovocitos, seguido de la retención del segundo glóbulo polar (MCCOMBIE y col., Ma Biotechnol (NY), 7, 318-30, 2005). Sin embargo, en el momento actual, el único procedimiento de producción de tetraploides usado en la práctica es el consistente en implantar el cruzamiento de hembras triploides con machos diploides. Este procedimiento presenta sin embargo dos inconvenientes importantes: 1) Al haberse obtenido estos tetraploides a partir de triploides que presentan una fertilidad no despreciable, el uso de estos mismos tetraploides con el fin de producir nuevas generaciones de triploides puede conllevar un aumento de la fertilidad de los triploides obtenidos de generaciones sucesivas. Así, se ha observado que la fertilidad media pasaba del 2% para los triploides de primera generación (triploides químicos obtenidos después de la retención del segundo GP después de un tratamiento con CB) al 13,4% para los triploides de segunda generación, obtenidos de un cruzamiento de progenitores macho tetraploides con hembras diploides (GUO & ALLEN, Biol. Bull., 187, 309-18, 1994). Este aumento de fertilidad en el curso de las generaciones corre el riesgo de conllevar la aparición a plazo más o menos largo de una población de triploides cuya fertilidad sería creciente, lo que hace correr el riesgo de una esterilización progresiva del medio, y de contaminación de las reservas de ostras diploides autóctonas después de la reproducción de las ostras triploides cuya descendencia es mayoritariamente aneuploide. 2) La necesidad de pasar por triploides hace especialmente difícil y molesta la introducción, en el nivel tetraploide, de todo avance genético realizado de forma normal y general en el nivel diploide. En efecto, las líneas diploides mejoradas después de programas de selección genética deben usarse en primer lugar para producir triploides mediante procedimientos clásicos de inducción química. Sólo a continuación los pocos triploides que llegan a entrar en la madurez y a producir ovocitos pueden usarse como progenitores hembra con el fin de producir tetraploides. Así pues, parece especialmente deseable disponer de un procedimiento de producción de ostras tetraploides que permita el paso directo del estado diploide al estado tetraploide sin pasar por el estado triploide. Los autores de la invención han propuesto la hipótesis de que la no supervivencia, más allá del estado larvario, de los tetraploides producidos durante el cruzamiento de progenitores diploides podría tener causas distintas que un tamaño demasiado bajo del ovocito diploide con respecto al núcleo tetraploide, y que entre estas causas podría figurar en especial un descenso del valor adaptativo general (es decir, de la aptitud global para la supervivencia) resultante de la tetraploidía. Este descenso del valor adaptativo podría deberse a la expresión de ciertos alelos negativos que se encuentran normalmente reprimidos en los diploides y los triploides y que no estarían reprimidos, o lo estarían sólo parcialmente en los tetraploides. Esto tendría como resultado una baja competitividad de las larvas tetraploides, y así pues su rápida desaparición cuando se crían en combinación con larvas diploides y triploides, que están presentes igualmente en las poblaciones larvarias resultantes del cruzamiento de progenitores diploides seguido de la retención del primer glóbulo polar. A partir de esta hipótesis, los autores de la invención han postulado que la clasificación de las larvas, con el fin de aislar los tetraploides y de permitirles superar la competición muy intensa ejercida por las larvas diploides y triploides permitiría conducir a la obtención de tetraploides viables, a partir... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de obtención de moluscos bivalvos tetraploides, caracterizado porque comprende: a) la fecundación de ovocitos de hembras diploides por esperma de machos diploides, seguida de la inducción de la retención del primer cuerpo polar de los huevos fecundados; b) el cultivo de las larvas obtenidas después de esta fecundación; c) el aislamiento, a partir de la población de larvas cultivadas de la etapa b), de una subpoblación enriquecida en tetraploides, que comprende al menos el 20% de larvas tetraploides; d) el cultivo de la subpoblación de larvas aislada en la etapa c). 2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la retención del primer cuerpo polar es inducida por un tratamiento con citocalasina B, realizado entre el minuto 5° y 25° después de la fecundación, durante 10 a 20 minutos. 3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque la citocalasina B se usa en una concentración final por litro de medio de tratamiento comprendida entre 0,3 y 0,7 mg. 4. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el cultivo de la etapa b) se realiza durante 6 a 8 días. 5. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el cultivo de la etapa d) se realiza durante 2 a 3 días. 6. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque comprende las etapas adicionales siguientes: e) el aislamiento, a partir de la subpoblación de larvas cultivadas de la etapa precedente, de una subpoblación rica en tetraploides, que comprende al menos el 20% de larvas tetraploides; f) el cultivo de la subpoblación de larvas aislada en la etapa e). 7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque el cultivo de la etapa f) se realiza durante 2 a 3 días. 8. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el aislamiento de las subpoblaciones enriquecidas en tetraploides se realiza clasificando las larvas sobre la base de su tamaño. 9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque el aislamiento de las subpoblaciones enriquecidas en tetraploides se realiza por el paso en un tamiz de tamaño de malla apropiado, y selección de las larvas que no son retenidas por el tamiz. 10. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque dichos moluscos bivalvos son ostras. 11. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque dichos moluscos bivalvos son mejillones. 12 ES 2 367 624 T3 13 ES 2 367 624 T3 14 ES 2 367 624 T3 ES 2 367 624 T3 16 ES 2 367 624 T3 17 ES 2 367 624 T3 18 ES 2 367 624 T3 19 ES 2 367 624 T3 ES 2 367 624 T3 21 ES 2 367 624 T3 22 ES 2 367 624 T3 23 ES 2 367 624 T3 24 ES 2 367 624 T3 ES 2 367 624 T3 26 ES 2 367 624 T3 27 ES 2 367 624 T3 28 ES 2 367 624 T3 29 ES 2 367 624 T3 ES 2 367 624 T3 31 ES 2 367 624 T3 32