Obtención de imágenes y evaluación de embriones, ovocitos y células madre.

Un método para determinar el potencial de desarrollo de un embrión humano, que comprende:

a) cultivar el embrión en condiciones que promuevan la supervivencia

, el crecimiento y/o el desarrollo;

b) medir uno o más parámetros celulares por obtención de imágenes secuenciales, en donde las imágenes son adquiridas a lo largo del tiempo;

c) analizar dichas imágenes para llegar a mediciones de parámetros celulares, en donde los parámetros celulares se seleccionan de:

i) el intervalo de tiempo entre la citocinesis 1 y la citocinesis 2; o

ii) el intervalo de tiempo entre la citocinesis 2 y la citocinesis 3; y

d) emplear dichas mediciones de parámetros celulares para detectar el potencial de desarrollo de un embrión 10 humano.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E13152098.

Solicitante: The Board Of Trustees Of The University Of the Leland Stanford Junior University.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 1705 EL CAMINO REAL PALO ALTO, CA 94306 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: BAER, THOMAS, M., WONG,CONNIE C, LOEWKE,KEVIN E, REIJO-PERA,RENEE A, BEHR,BERRY.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/68 (en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos)
  • SECCION G — FISICA > COMPUTO; CALCULO; CONTEO > RECONOCIMIENTO DE DATOS; PRESENTACION DE DATOS; SOPORTES... > G06K9/00 (Métodos o disposiciones para la lectura o el reconocimiento de caracteres impresos o escritos o el reconocimiento de formas, p. ej. de huellas dactilares (métodos y disposiciones para la lectura de grafos o para la conversión de patrones de parámetros mecánicos, p.e. la fuerza o la presencia, en señales eléctricas G06K 11/00; reconocimiento de la voz G10L 15/00))
  • SECCION G — FISICA > COMPUTO; CALCULO; CONTEO > TRATAMIENTO O GENERACION DE DATOS DE IMAGEN, EN GENERAL... > G06T7/00 (Análisis de imagen, p. ej. desde un mapeado binario para obtener un mapeado no binario)
  • SECCION G — FISICA > COMPUTO; CALCULO; CONTEO > TRATAMIENTO O GENERACION DE DATOS DE IMAGEN, EN GENERAL... > Análisis de imagen, p. ej. desde un mapeado binario... > G06T7/20 (Análisis del movimiento)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/073 (Células o tejidos embrionarios; Células o tejidos fetales)

PDF original: ES-2500057_T3.pdf

 

google+ twitter facebook

Fragmento de la descripción:

Obtención de imágenes y evaluación de embriones, ovocitos y células madre Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. N° 61/332.651, presentada el 7 de mayo de 2010 y la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. N° 61/236.085, presentada el 22 de agosto de 2009, las cuales se incorporan en su totalidad en la presente memoria como referencia.

Campo de la invención

Esta invención se refiere al campo de los ensayos biológicos y clínicos y particularmente a la obtención de imágenes y a la evaluación de cigotos/embriones, ovocitos y células madre, tanto de seres humanos como de animales.

Antecedentes de la invención

La esterilidad es un problema de salud común que afecta a 10-15% de las parejas en edad reproductiva. En los Estados Unidos solamente en el año 2006 se llevaron a cabo aproximadamente 140.000 ciclos de fecundación in vitro (FIV) (cdc.gov/art). Esto dio como resultado el cultivo de más de un millón de embriones anualmente con un potencial variable y, con frecuencia impreciso, de implantación y desarrollo a término. La tasa de nacidos vivos por ciclo, después de la FIV fue sólo del 29%, mientras que una media del 30% de los nacidos vivos resultaron de gestaciones múltiples (cdc.gov/art). Se han documentado bien las consecuencias adversas de las gestaciones múltiples tanto para la madre como para los fetos, tales como aborto involuntario, parto prematuro y baja tasa de natalidad. Las posibles causas del fracaso de la FIV son diversas; sin embargo, desde la introducción de la FIV en 1978, uno de los retos más importantes ha sido la identificación de los embriones que sean los más adecuados para la transferencia y los que más probablemente den como resultado un embarazo a término.

La comprensión en la técnica del desarrollo embrionario básico es limitada puesto que los estudios sobre la biología del embrión humano continúan siendo un reto y, frecuentemente están excluidos de la financiación de la investigación. En consecuencia, la mayor parte del conocimiento actual de desarrollo embrionario procede de los estudios de organismos modelo. Sin embargo, aunque los embriones de diferentes especies pasan por etapas de desarrollo similares, el tiempo varía según la especie. Estas diferencias, y muchas otras, hacen inapropiado la extrapolación directa de una especie a otra (Taft, R.E. (2008) Theriogenology 69(1 ):10-16). Las vías generales de desarrollo humano, así como los determinantes moleculares fundamentales subyacentes, son únicos para el desarrollo embrionario humano. Por ejemplo, en los ratones, la transcripción embrionaria se activa aproximadamente 12 horas después de la fecundación, simultáneamente con la primera división por escisión, mientras que en los seres humanos la activación de genes embrionarios (EGA) se produce en el día 3, alrededor del estadio de 8 células (Bell, C. E., et al., (2008) Mol. Hum. Reprod. 14:691-701; Braude, P., et al., (1988) Nature 332:459-461; Hamatani, T., et al., (2004) Proc. Nati. Acad. Sci. 101:10326-10331; Dobson, T., et al., (2004) Human Molecular Genetics 13(14): 1461-1470). Además, los genes que son modulados en el desarrollo humano temprano son únicos (Dobson, T., et al., (2004) Human Molecular Genetics 13(14):1461-1470). Por otra parte, en otras especies como el ratón, más del 85% de los embriones cultivados in vitro alcanzan el estadio de blastocisto, uno de los primeros puntos de referencias importantes en el desarrollo de los mamíferos, mientras que los cultivos de embriones humanos tienen una tasa media de formación de blastocistos de aproximadamente 30-50%, con una alta incidencia de mosaicismos y fenotipos anómalos, tales como la fragmentación y detención del desarrollo (Rienzi, L., et al., (2005) Reprod. Biomed. Online 10:669-681; Alikani, M., et al., (2005) Mol. Hum. Reprod. 11:335-344; Keltz, M.D., et al., (2006) Fértil. Steril. 86:321-324; French, D. B., et al., (2009) Fértil. Steril.). A pesar de estas diferencias, la mayoría de los estudios de desarrollo embrionario pre-implantacional proceden de organismos modelo y son difíciles de relacionar con el desarrollo de embriones humanos (Zernicka-Goetz, M. (2002) Development 129:815-829; Wang, Q., et al., (2004) Dev. Cell 6:133-144; Bell, C. E., et al., (2008) Mol. Hum. Reprod. 14:691-701; Zernicka-Goetz, M. (2006) Curr. Opin. Genet. Dev. 16:406-412; Mtango, N. R., et al., (2008) Int. Rev. Cell Mol. Biol. 268:223-290).

Tradicionalmente, en las clínicas de FIV, la viabilidad de los embriones humanos se ha evaluado por simples observaciones morfológicas, tales como la presencia de blastómeros mononucleados de tamaño uniforme y el grado de fragmentación celular (Rijinders PM, Jansen CAM. (1998) Hum. Reprod. 13:2869-73; Milki AA, et al., (2002) Fértil. Steril. 77:1191-5). Más recientemente, otros métodos, tales como el cultivo prolongado de embriones (hasta el estadio de blastocisto en el día 5) y el análisis del estado cromosómico por diagnóstico genético pre-implantacional (DGP) también se han usado para evaluar la calidad de los embriones (Milki A, et al., (2000) Fértil. Steril. 73:126-9; Fragouli E, (2009) Fértil. Steril. Jun 21 [PubE ya disponible]. El-Toukhy T, et al., (2009) Hum. Reprod. 6:20; Vanneste E, et al., (2009) Nat. Med. 15:577-83). Sin embargo, también existen riesgos potenciales de estos métodos porque prolongan el período de cultivo y afectan a la integridad del embrión (Manipalviratn S, et al., (2009) Fértil. Steril. 91:305-15; Mastenbroek S, et al., (2007) N. Engl. J. Med. 357:9-17).

Recientemente se ha demostrado que la obtención de imágenes secuenciales puede ser una herramienta útil para observar el desarrollo embrionario temprano. Algunos métodos han utilizado la obtención de imágenes secuenciales para monitorizar el desarrollo embrionario humano después de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (abreviadamente ICSI por la expresión inglesa Intracytoplasmic Sperm Injection) (Nagy et al., (1994) Human

Reproduction 9(9): 1743-1748; Payne et al., (1997) Human Reproduction 12:532-541). Se analizaron la extrusión del cuerpo polar y la formación pronuclear y se correlacionaron con buena morfología en el día 3. Sin embargo, ningún parámetro se correlacionó con la formación de blastocistos ni con los resultados del embarazo. Otros métodos han observado la aparición de la primera escisión como un indicador para predecir la viabilidad de los embriones humanos (Fenwick, et al., (2002) Human Reproduction, 17:407-412; Lundin, et al., (2001) Human Reproduction 16:2652-2657). Sin embargo, estos métodos no reconocen la importancia de la duración de la citocinesis ni de los intervalos de tiempo entre las divisiones tempranas.

Otros métodos han utilizado la obtención de imágenes secuenciales para medir la cadencia y la extensión de las divisiones celulares durante el desarrollo embrionario temprano (WO/2007/144001). Sin embargo, estos métodos solamente divulgan un método básico y general para la obtención de imágenes secuenciales de embriones bovinos, que son sustancialmente diferentes de los embriones humanos en términos de potencial de desarrollo, comportamiento morfológico, programas moleculares y epigenéticos y cadencia y parámetros relacionados con la transferencia. Por ejemplo, los embriones bovinos tardan mucho más tiempo en ser implantados en comparación con los embriones humanos (30 días y 9 días, respectivamente). (Taft, (2008) Theriogenology 69 (1): 10-16). Más aún, no se divulgan parámetros específicos de obtención de imágenes ni de intervalos de tiempo que pudieran ser predlctlvos de la viabilidad del embrión humano.

Más recientemente, la obtención de imágenes secuenciales se ha utilizado para observar el... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para determinar el potencial de desarrollo de un embrión humano, que comprende:

a) cultivar el embrión en condiciones que promuevan la supervivencia, el crecimiento y/o el desarrollo;

b) medir uno o más parámetros celulares por obtención de imágenes secuenciales, en donde las imágenes son adquiridas a lo largo del tiempo; 5

c) analizar dichas imágenes para llegar a mediciones de parámetros celulares, en donde los parámetros celulares se seleccionan de:

i) el intervalo de tiempo entre la citocinesis 1 y la citocinesis 2; o ii) el intervalo de tiempo entre la citocinesis 2 y la citocinesis 3; y d) emplear dichas mediciones de parámetros celulares para detectar el potencial de desarrollo de un embrión 10 humano.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el intervalo de tiempo entre la citocinesis 1 y la citocinesis 2 es el intervalo entre el comienzo de la citocinesis 1 y el comienzo de la citocinesis 2, el intervalo entre la resolución de la citocinesis 1 y la resolución de la citocinesis 2, el intervalo entre el comienzo de la citocinesis 1 y la resolución de la citocinesis 2; o el intervalo entre la resolución de la citocinesis 1 y el comienzo de la citocinesis 2. 15

3. El método de la reivindicación 1, en donde el intervalo de tiempo entre la citocinesis 2 y la citocinesis 3 es el intervalo entre el comienzo de la citocinesis 2 y el comienzo de la citocinesis 3, el intervalo entre la resolución de la citocinesis 2 y la resolución de la citocinesis 3, el intervalo entre el comienzo de la citocinesis 2 y la resolución de la citocinesis 3; o el intervalo entre la resolución de la citocinesis 2 y el comienzo de la citocinesis 3.

4. El método de las reivindicaciones 1 - 3, en donde el uno o más parámetros celulares se miden manual o 20 automáticamente.

5. El método de las reivindicaciones 1 - 3, en donde dichos embriones son preparados recientemente a partir de ovocitos por fecundación in vitro.

6. El método de las reivindicaciones 1 - 3, en donde dichos embriones han sido congelados previamente.

7. El método de las reivindicaciones 1 - 6, en donde la obtención de imágenes secuenciales se realiza con un 25 microscopio controlado por ordenador y equipado para el almacenamiento y análisis digitales.

8. El método de las reivindicaciones 1 - 7, en donde la obtención de imágenes secuenciales emplea iluminación de campo brillante, iluminación de campo oscuro, contraste de fases, contraste con modulación de Hoffman, contraste con interferencia diferencial o fluorescencia.

9. El método de las reivindicaciones 1 - 8, en donde el intervalo entre imágenes es entre 1 y 30 minutos. 30

10. El método de la reivindicación 1, en donde los embriones se cultivan en placas de cultivo personalizadas.

11. El método de las reivindicaciones 1 - 9, en donde las mediciones de los parámetros celulares se realiza antes de que transcurran 96 horas de la fecundación, por ejemplo antes de que transcurran 84 horas de la fecundación, por ejemplo antes de que transcurran 72 horas de la fecundación, por ejemplo antes de que transcurran 60 horas de la fecundación, por ejemplo antes de que transcurran 54 horas de la fecundación, por ejemplo antes de que 35 transcurran 36 horas de la fecundación o por ejemplo antes de que transcurran 2 días de la fecundación.

12. El método de las reivindicaciones 1 - 9, en donde las mediciones de los parámetros celulares se realiza antes de que transcurran 54 horas.