Oligonucleótidos específicos para la detección, identificación y cuantificación de aislados de Clostridium tyrobutyricum.

Los oligonucleótidos de la presente invención presentan una secuencia de nucleótidos que es específica para una región del gen fla específica de la especie Clostridium tyrobutyricum. Dichos oligonucleótidos actúan como cebadores y sonda, respectivamente, frente a las secuencias diana de dichos genes.

La detección, identificación y cuantificación de aislados de Clostridium tyrobutyricum se lleva a cabo mediante la tecnología estándar de PCR en cualquiera de sus variantes conocidas, especialmente mediante el empleo de PCR a tiempo real mediante sondas tipo TaqMan, y se caracteriza porque para la amplificación de la región del gen fla del aislado de Clostridium tyrobutyricum a determinar se emplean dichos oligonucleótidos

Oligonucleótidos específicos para la detección, identificación y cuantificación de aislados de Clostridium tyrobutyricum.

La presente invención se encuadra dentro del campo técnico de los métodos analíticos y sus correspondientes reactivos para determinaciones microbiológicas.

Más específicamente, la presente invención proporciona nuevos oligonucleótidos que han mostrado ser especialmente útiles para la detección, identificación y cuantificación de aislados de Clostridium tyrobutyricum.

Estado de la técnica

Clostridium tyrobutyricum es un microorganismo Gram+, anaerobio estricto, mesófilo, formador de esporas y altamente resistente en el medio ambiente (suelos, aguas, ensilados, etc.). Este organismo produce ácido butírico por fermentación del ácido láctico, lo que conduce a la formación de cavidades irregulares en la masa del queso por la producción de gas.

Esta fermentación es producida por la germinación de esporas de Clostridium tyrobutyricum debido a condiciones anaerobias generadas en la elaboración del queso. Se ha indicado que tan sólo 50 esporas por litro pueden causar este defecto, siendo 1000 esporas por litro el valor de referencia para descartar una leche. La hinchazón tardía del queso produce una deformación del mismo, con la eliminación al corte de una sustancia que puede producir un olor maloliente y confiere al producto un sabor rancio indeseable. Los quesos dañados también contienen diversas cavidades distribuidas heterogéneamente que se corresponden con la masa digerida. Las esporas de Clostridium tyrobutyricum son muy resistentes en el medio ambiente y contaminan la leche antes de la elaboración del queso. Las principales fuentes de contaminación son los ensilados, el agua y el material que se utiliza como cama para los animales de abasto.

La técnica del Número Más Probable es el método diagnóstico más utilizado en los laboratorios de análisis para la cuantificación de esporas de Clostridium tyrobutyricum. Este método está basado en la detección de la producción de gas por la fermentación de la lactosa en condiciones anaeróbicas en los tubos que son positivos, y la realización de tests adicionales tales como el examen de la posición de las endosporas, el perfil de la fermentación de carbohidratos y el análisis de cromatográfico de los ácidos orgánicos volátiles y no-volátiles de los metabolitos producidos. (Bergéres, J.L., and S. Sivela. 1990. Detection and enumeration of clostridial spores related to cheese quality-classical and new methods. In. I.D. Federation (ed.), Methods for Detection and Prevention of Anaerobic Spore Formers in Relation to the Quality of Cheese. Bulletin of the International Dairy Federation, vol. 251. I.D. Federation, Brussels, pp. 15-23; Cocolin, L., N. Innocente, M Biasutti, and G. Comi. 2004. The late blowing in cheese: a new molecular approach based on PCR and DGGE to study the microbial ecology of the alteration process. Int. J Food Microbiol. 90: 83-91; Ingham, S.C., J.R. Hassler, Y. W. Tsai, B.H. Ingham.1998. Differentiation of lactate-fermenting, gas producing Clostridium spp. isolated from milk. Int. J. Food Microbiol. 43: 173-361 183; Stadhouders, J, G. Hup, and F.F.J. Nieuwenhof 1985. Silage and cheese quality. NIZO Mededeling M19A: 1-40).

Sin embargo, este procedimiento es laborioso y no totalmente específico ya que pueden crecer otros microorganismos esporulados anaerobios. Además, como son necesarios varios días (5-7 días) para la observación de un cambio visible en la turbidez y en la aparición de gas con desplazamiento de la parafina, este método es difícil de adaptar a las necesidades de los productores ya que la leche de diferentes orígenes ha sido ya mezclada y pasada al proceso de producción cuando se obtienen resultados positivos.

Actualmente, se han desarrollado métodos alternativos basados en la amplificación de ADN por PCR convencional para la detección en menos de 24 horas de esporas de este organismo alterante en leche o productos lácteos. (Herman, L.M.F., J.H.G.E. de Block and G. MA. V.J. Waes. 1995. A direct PCR detection method for Clostridium tyrobutyricum spores in up to 100 milliliters of raw milk. Appl. Environ. Microbiol. 61: 4141-4146; Herman, L. J.H.G.E. De Block and R. Van Renterghem. 1997. Isolation and detection of Clostridium tyrobutyricum cells in semi-soft and hard cheeses using the polymerase chain reaction.. J. Dairy Res. 64: 311-314; Klijn, N., F.F. Nieuwenhof J.D. Hoolwerf C.B. van der Waals, and A.H. Weerkamp. 1995. Identification of Clostridium tyrobutyricum as the causative agent of late blowing in cheese by species-specific PCR amplification. Appl Environ Microbiol. 61: 2919-2924). Sin embargo, estos métodos presentan algunos inconvenientes.

Herman et al. (1995) propone un método basado en la técnica de PCR anidada. De nuevo se trata de una técnica laboriosa, imposible de implementar en un laboratorio que procese 5.000 muestras de leche diarias y que además, presenta graves problemas de contaminación cruzada al tratarse de una reamplificación por PCR originando un porcentaje muy alto de falsos positivos.

Por otra parte, el método propuesto por Klijn et al, (1995) permite únicamente la detección pero no la cuantificación de Clostridium tyrobutyricum, abordando nuestro método propuesto en la presente invención este último alcance, así como aportando la facilidad de automatización del mismo y mejorando la sensibilidad. Así mismo, se comprobó en nuestro laboratorio dicho método publicado por Klijn et al, (1995), sin poder llegar a detectar C. tyrobutyricum y por tanto sin obtener los resultados descritos en dicho artículo, por lo que dicho método presentaría un problema de reproducibilidad entre laboratorios.

También se han descrito kits con oligonucleótidos específicos para la detección de otros esporulados (JP3121332) y para la detección de diversas especies de Clostridium, como por ejemplo C. botulinum (JP2002176982), C. difficile (Simon D. Manger, Maurice Boissinot, Natalie Clairoux, Francois. J. Picard, and Michel G. Bergeron. Feb. 2003. Rapid Detection of Clostridium difficile in Feces by Real-Time PCR. Journal of Clinical Microbiology, February 2003, p. 730-734, Vol. 41, No. 2 y KR20040032588), C. bifermentas (JP2005058023), C. tetanus (CN1514023 y JP2002176982), C. perfringens (US6472155) y también para C. tyrobutyricum (JP6113899, Klijn et al 1995, Herman et al 1995), sin embargo dichos kits y sistemas describen procedimientos de PCR convencional que no permiten la cuantificación.

El kit descrito en el documento de patente JP6113899 se fundamenta en una amplificación por PCR convencional seguida de una digestión con enzimas de restricción, haciendo el proceso de detección largo y requiriendo para ello un equipamiento en el laboratorio específico y un alto grado de experiencia del personal en técnicas de biología molecular.

Por tanto, todos estos métodos anteriormente mencionados, permiten la identificación pero no la cuantificación. Actualmente, la cuantificación absoluta de la microbiota contaminante en productos alimentarios por PCR a tiempo real, se está convirtiendo en una técnica de uso común en microbiología de los alimentos. (Rodríguez-Lázaro, D., M Pla, M Scortti, H.J. Monzó, and J.A. Vázquez-Boland. 2005. A novel real-time PCR for Listeria monocytogenes that monitors analytical performance via an internal amplification control. Appl. Environ. Microbiol. 71: 9008- 9012).

Por lo tanto, es de gran importancia poder disponer de métodos analíticos rápidos, fiables, sensibles y con buenos límites de cuantificación. La identificación y cuantificación de microorganismos por técnicas de biología molecular, particularmente la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real, está siendo ampliamente empleada hoy día. Sin embargo, aunque en la actualidad existen diversos métodos para la determinación de aislados de Clostridium tyrobutyricum que incluso se basan en la técnica de PCR convencional, no existe un método de PCR a tiempo a real que permita la enumeración del microorganismo alterante Clostridium tyrobutyricum.

En la presente invención se ha desarrollado y evaluado un sistema de PCR a tiempo real que permita la identificación y enumeración de C. tyrobutyricum y su aplicación en muestras alimentarias. Este sistema está...

1. Oligonucleótidos específicos para la detección, identificación y cuantificación de aislados de Clostridium tyrobutyricum, caracterizados por poseer una secuencia de nucleótidos específica para una región del gen fla de Clostridium tyrobutyricum, siendo dichos oligonucleótidos:

2. Método analítico para la detección, identificación y cuantificación de aislados de Clostridium tyrobutyricum mediante la tecnología estándar de PCR en cualquiera de sus variantes conocidas, caracterizado porque para la amplificación de la región del gen fla del aislado de Clostridium tyrobutyricum a determinar, se emplean los oligonucleótidos según la reivindicación 1.

3. Método analítico según la reivindicación 2, para la detección, identificación y cuantificación de aislados de Clostridium tyrobutyricum mediante la tecnología PCR a tiempo real empleando sondas tipo TaqMan, caracterizado porque se emplean como cebadores los oligonucleótidos CTflaF (SEQ ID NO. 1) y CTflaR (SEQ ID NO. 2) y, como sonda, el oligonucleótido CTflaP (SEQ ID NO. 3)

4. Método analítico según la reivindicación 2, para la detección, identificación y cuantificación de aislados de Clostridium tyrobutyricum mediante la tecnología PCR convencional, caracterizado porque se emplean como cebadores los oligonucleótidos CTflaF (SEQ ID NO. 1) y CTflaR (SEQ ID NO. 2).

5. Uso de los oligonucleótidos en un método analítico para la determinación de aislados de Clostridium tyrobutyricum según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.

6. Uso de los oligonucleótidos como reactivos de un kit para la puesta en práctica de un método para la determinación de aislados de Clostridium tyrobutyricum según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.