Nuevos promotores de la beta-actina y rpS21, y sus usos.

Un promotor de β-actina aislado que se escoge de las secuencias nucleotídicas expuestas en SEC ID NOs: 1 ó 3

, o una variante del mismo que tiene actividad promotora, en el que dicha variante es una secuencia nucleotídica que tiene al menos 95% de identidad con una secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO: 1 ó 3 a lo largo de toda la longitud de esa secuencia de referencia.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2004/017422.

Solicitante: GENZYME CORPORATION.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 500 KENDALL STREET CAMBRIDGE, MA 02142 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: ESTES,SCOTT D, ZHANG,WEIQUN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K48/00 (Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/85 (para células animales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/10 (Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/47 (de mamíferos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS;... > Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido... > C07H21/04 (con desoxirribosilo como radical sacárido)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA > CRIA; AVICULTURA, PISCICULTURA, APICULTURA; PESCA;... > Cría u obtención de animales, no prevista en otro... > A01K67/027 (Nuevas razas de vertebrados)
  • C12N5/06
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/02 (Oxidorreductasas (1.), p. ej. luciferasa)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales > C07K16/22 (contra factores de crecimiento)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/79 (Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a huéspedes eucariotas)

PDF original: ES-2541136_T3.pdf

 

google+ twitter facebook

Fragmento de la descripción:

Nuevos promotores de la beta-actina y rpS21, y sus usos Campo de la invención

Esta invención se refiere a elementos génicos reguladores, tales como promotores, y a sus usos, por ejemplo para la expresión de proteínas. Más específicamente, esta invención se refiere a promotores de p-actina y del gen de la proteína ribosómica S21.

Antecedentes de la invención

Cada gen eucariota contiene elementos reguladores que conduce la transcripción de ese gen. Tales elementos reguladores incluyen promotores, que están típicamente situados inmediatamente en dirección 5 de la secuencia codificante de un gen. Los promotores regulan la transcripción al proporcionar sitios de unión para factores de transcripción, que son una parte de la maquinaria de transcripción. Los promotores se usan habitualmente para expresar proteínas en cultivo celular e in vivo. Muchos promotores se conocen y se usan para la expresión de proteínas en diversos sistemas de expresión. Los ejemplos de promotores incluyen el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), repeticiones terminales largas de genoma grande del genoma del virus de sarcoma de Rous (RSV), el promotor del virus 4 del simio (SV4), el promotor del gen de ¡nterferón, el promotor de metalotioneína, y el promotor de timidina cinasa y otros, por ejemplo como se describe en Fernandez et al. (1999) Gene Expression Systems, Academic Press. Sin embargo, todavía existe la necesidad en la técnica de proporcionar promotores que sean capaces de generar niveles elevados de expresión y/o de sostener la expresión durante un período prolongado de tiempo.

La p-actina es una proteína estructural y se expresa habitualmente en todas las especies, desde protozoos a eucariotas, incluyendo seres humanos. Los promotores de p-actina humanos y de pollo se han descrito previamente. El promotor de p-actina, en general, muestra una actividad más ubicua que el promotor de CMV que se usa ampliamente (Xu et al. (21) Gene 272: 149-156). Se mostró que el promotor de p-actina de pollo exhibe una actividad mayor que los promotores virales de CMV y SV4, pero solamente cuando está enlazado a una secuencia potenciadora de CMV (Xu et al., más arriba).

La proteína ribosómica S21 (rpS21) está asociada con la subunidad 4S del ribosoma. El promotor del gen de rpS21 humano se identificó previamente (n° de acceso GenBank® AJ2597). De forma similar a la mayoría de los promotores génicos ribosómicos, carece de elementos de transcripción convencionales tales como la caja TATA y la secuencia CAAT (Smirnova et al. (2) Bioorg. Khim. 26 (5): 392-396).

Beddington R S P et al. (Development; Volumen 16; 1989; páginas 37-46) describen un marcador celular in situ que se puede usar para seguir el destino celular. Los autores afirman que, para crear tal marcador, se obtuvo mediante inyección pronuclear de ADN una raza de ratones transgénicos que porta 6 copias del gen lac Z de Escherichia coli bajo el control del promotor de p-actina de rata.

Breitbart A S et al. (Annals of Plástic Surgery; Volumen 43 n° 6; diciembre 1999; páginas 632-639) describen la clonación del gen de PDGF-B humano en vectores retrovíricos bajo el control del promotor de citomegalovirus o el promotor de p-actina de rata.

Nudel U et al. (Nucleic Acids Research; Volumen 11 Número 6; 1983; páginas 1759-1771) se refieren a la determinación de la secuencia nucleotídica del gen de p-actina de rata. Los autores afirman que el gen de p-actina codifica una proteína idéntica a la p-actina bovina, tiene un gran intrón en la región no traducida de 5, 6 nucleótidos en dirección 5 del iniciador ATG, y 4 intrones en la región codificante en codones que especifican aminoácidos 41/42, 121/122, 267, y 327/328.

El número de acceso de Database U2114 (Database EMBL EBI; 21 de abril de 1995) se refiere a la secuencia del gen de p-actina de hámster chino.

Eider P K et al. (Molecular and Cellular Biology; enero 1988, p. 48-485) afirman que se usó la hibridación a oligonucleótidos sintéticos que representan regiones conservadas en el promotor y primer intrón de varios genes de P-actina de vertebrados para discriminar entre lo que parece ser un único gen de p-actina funcional y numerosos pseudogenes en el genoma de ratón. Los autores afirman que se construyó un plásmido denominado pp5-Gem4 usando un fragmento de 4,5 kb de EcoRI-Sall que representa el extremo 5 del gen de p-actina de ratón.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente descripción proporciona nuevos promotores de p-actina que tienen un nivel bajo de homología de secuencia con promotores de p-actina previamente conocidos (tales como, por ejemplo, humano y de pollo). La presente descripción proporciona además nuevos promotores de rpS21 que tienen un bajo nivel de homología de secuencia con promotores de rpS21 previamente conocidos (tales como, por ejemplo, humano y ratón).

La presente descripción se basa, en parte, en el descubrimiento y aislamiento de promotores de p-actina y de rpS21 a partir de la estirpe celular de ovario de hámster chino (CHO). Esta invención se basa además, en parte, en la observación de que el promotor de p-actina de hámster tiene una actividad significativamente mayor que el promotor de CMV. La presente descripción se basa además, en parte, en la observación de que el promotor de rpS21 es al menos tan activo como el promotor de p-actina de hámster cuando se usa para expresar ciertos genes. La presente descripción proporciona secuencias nucleotídicas para estos promotores, e incluye variantes de las secuencias nucleotídicas que tienen actividad promotora. En algunos casos, un promotor de p-actina de la presente descripción deriva de un roedor, por ejemplo hámster, rata, y ratón. El promotor de rpS21 deriva típicamente de un hámster.

La presente descripción proporciona además vectores que comprenden un promotor de p-actina o un promotor de rpS21 de la presente descripción ligado operablemente a un ácido nucleico heterólogo. En ciertos casos, un vector de la presente descripción comprende un promotor que está ligado operablemente a un ácido nucleico heterólogo que codifica un producto de expresión heterólogo tal como, por ejemplo, una protelna terapéutica o un fragmento de la misma. En casos ilustrativos, el producto de expresión es esfingomielinasa ácida (ASM), a-glucosidasa (GAA), o activador de plasminógeno tisular (tPA).

La invención también proporciona células hospedantes transfectadas con un vector de la invención. En realizaciones ilustrativas, la célula hospedante es una célula de mamífero tal como, por ejemplo, CHO, HEK, y BHK.

También se proporcionan métodos para producir una proteína. Los métodos para producir una protelna incluyen, por ejemplo, cultivar una célula transfectada con un vector que comprende un promotor de p-actina y/o un promotor de rpS21 de la presente descripción ligado operablemente a un ácido nucleico heterólogo que codifica una protelna, y recuperar la protelna. En algunos casos, el producto de expresión heterólogo es una proteína secretora, que se recupera del medio. En casos ilustrativos, la proteína es ASM, GAA, o tPA.

En base a la descripción contenida aquí, la presente invención proporciona un promotor de p-actina aislado que se escoge de las secuencias nucleotídicas expuestas en SEC ID NOs: 1 ó 3, o una variante de las mismas que tiene actividad promotora, en el que dicha variante es una secuencia nucleotídica que tiene al menos 95% de identidad con una secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO: 1 ó 3, a lo largo de toda la longitud de esa secuencia de referencia.

La presente invención proporciona además un método para producir una proteína, en el que dicho método comprende: (a) cultivar una célula hospedante transfectada... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un promotor de (5-actina aislado que se escoge de las secuencias nucleotídicas expuestas en SEC ID NOs: 1 ó 3, o una variante del mismo que tiene actividad promotora, en el que dicha variante es una secuencia nucleotídica que tiene al menos 95% de identidad con una secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO: 1 ó 3 a lo largo de toda la longitud de esa secuencia de referencia.

2. Un promotor aislado según la reivindicación 1, en el que dicho promotores la secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO:1, o una variante del mismo que tiene actividad promotora, en el que dicha variante es una secuencia nucleotídica que tiene al menos 95% de identidad con la secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO:1 a lo largo de toda la longitud de SEC ID NO:1.

3. Un promotor aislado según la reivindicación 2, en el que dicho promotor es una variante de la secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO:1, y en el que dicha variante es una secuencia nucleotídica que tiene al menos 97% de identidad con la secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO:1 a lo largo de toda la longitud de SEC ID

NO:1.

4. Un promotor aislado según la reivindicación 1, en el que dicho promotor es la secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO:3,o una variante del mismo que tiene actividad promotora, en el que dicha variante es una secuencia nucleotídica que tiene al menos 95% de identidad con la secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO:3 a lo largo de toda la longitud de SEC ID NO:3.

5. Un promotor aislado según la reivindicación 4, en el que dicho promotor es una variante de la secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO:3, y en el que dicha variante es una secuencia nucleotídica que tiene al menos 97% de identidad con la secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO:3 a lo largo de toda la longitud de SEC ID NO:3.

6. Un vector que comprende el promotor de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, 4 ó 5.

7. El vector de la reivindicación 6, en el que dicho vector comprende el promotor de la reivindicación 2 o reivindicación 3.

8. El vector de la reivindicación 6 o reivindicación 7, en el que dicho promotor está ligado operablemente a un ácido nucleico heterólogo.

9. El vector de la reivindicación 8, en el que dicho ácido nucleico heterólogo codifica una proteína terapéutica.

1. El vector de la reivindicación 9, en el que dicha proteína terapéutica se selecciona del grupo que consiste en esfingomielinasa ácida, a-glucosidasa, y activador de plasminógeno tisular.

11. Una célula hospedante transfectada con el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 6-1.

12. La célula hospedante de la reivindicación 11, en la que dicha célula hospedante es una célula de ovario de hámster chino (CHO).

13. Un método para producir una proteína, en el que dicho método comprende: (a) cultivar una célula hospedante transfectada con un vector que comprende un promotor según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o 5, en el que dicho promotor está ligado operablemente a una molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína; y (b) recuperar dicha proteína.

14. El método de la reivindicación 13, en el que la proteína es un anticuerpo.

15. El método de la reivindicación 14, en el que el anticuerpo se une a un miembro de la familia de TGF-p.

16. El método de la reivindicación 13, en el que la proteína es una proteína terapéutica.

17. El método de la reivindicación 16, en el que la proteína terapéutica se selecciona del grupo que consiste en

esfingomielinasa ácida, a-glucosidasa, y activador de plasminógeno tisular.

18. Un animal transgénico no humano que comprende el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 6-1.