Polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AXE2 que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene por lo menos un 85% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17, o el complemento de la misma;

(b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AXE2 que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene por lo menos un 90% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17, o el complemento de la misma;

(c) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AXE2 que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17, o el complemento de la misma;

(d) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AXE2 que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17, o el complemento de la misma;

(e) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AXE2 que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 15, o el complemento de la misma;

(f) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AXE2 que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 15, o el complemento de la misma; y

(g) una secuencia de ácidos nucleicos presentada como SEC ID No. 14, o el complemento de la misma, en el que el % de identidad se calcula utilizando el programa CLUSTAL-W en MacVector versión 6.5, operado con los parámetros por defecto, que incluyen una penalización por la abertura de espacio de 10, 0, una penalización por la extensión del espacio de 0, 1, y una matriz de similitud BLOSUM 30.

Nuevos genes de Trichoderma

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Se describen en la presente invención cuatro genes - dos genes que codifican proteínas que comprenden un dominio de unión a celulosa, una arabinofuranosidasa, y una acetilxilano esterasa. También se describen aquí las proteínas deducidas, y las composiciones que tienen las nuevas proteínas. Estas composiciones son especialmente útiles en aplicaciones textiles, detergentes, conversión de biomasa, pienso y alimentos, y las industrias de la pulpa y el papel. Los genes se aislaron a partir de un hongo filamentoso, Trichoderma reesei (también denominado indistintamente aquí Hypocrea jecorina) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La celulosa y la hemicelulosa son los materiales más abundantes de las plantas producidos por fotosíntesis. Se pueden degradar y utilizar como fuente de energía por numerosos microorganismos, incluyendo bacterias, levaduras y hongos, que producen enzimas extracelulares capaces de la hidrólisis de los sustratos poliméricos a azúcares monoméricos (Aro et al., J. Biol. Chem., 10.1074/ M003624200, 13 de abril de 2001) . Dado que se acercan los límites de los recursos no renovables, el potencial de la celulosa para convertirse en una energía renovable principal es enorme (Krishna et al., Bioresource Tech. 77:193-196, 2001) . La utilización eficaz de la celulosa a través de procesos biológicos es una estrategia para superar la escasez de alimentos, pienso y combustibles (Ohmiya et al., Biotechnol. Gen. Engineer. Rev. 14:365-414, 1997) .

La celulosa es un polisacárido lineal de residuos de glucosa conectados mediante uniones 1-1, 4. En la naturaleza, la celulosa está normalmente asociada con lignina junto con hemicelulosas, tales como xilanos y glucomananos. El uso práctico de las celulasas está dificultado por la naturaleza de las celulasas conocidas, que a menudo son mezclas de celulasas que tienen una variedad actividades y especificidades de sustrato. Por esta razón, es deseable identificar celulasas que tienen sólo las actividades deseadas o proteínas que pueden facilitar la acción de la celulasa.

La hemicelulosa es cualquiera de los diversos heteropolímeros (polisacáridos en matriz) presentes en casi todas las paredes celulares junto con celulosa. Sus pesos moleculares son habitualmente inferiores a los de la celulosa y presentan una estructura no diferenciada débil en comparación con la celulosa cristalina. Las cadenas forman una "base" - se unen con pectina a la celulosa para formar un red de fibras reticuladas. De este modo, sería beneficioso aumentar la degradación de la hemicelulosa.

Las O-Glicosil hidrolasas (EC 3.2.1. ) con un grupo amplio de enzimas que hidrolizan el enlace glicosídico entre dos o más carbohidratos, o entre un carbohidrato y un grupo no carbohidrato. EL sistema de clasificación para las glicosil hidrolasas, basada en la similitud de secuencias, ha conducido a la definición de hasta 60 familias diferentes [HENRISSAT, B. AND BAIROCH, A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. BIOCHEM.J. 293 781-788 (1993) ; HENRISSAT, B. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. BIOCHEM.J. 280 309-316 (1991) ; DAVIES, G. AND HENRISSAT, B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. STRUCTURE 3 853-859 (1995) ; and HENRISSAT, B. AND BAIROCH, A. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. BIOCHEM.J. 316 695-696 (1996) ]. Las acetil xilano esterasas (EC 3.1.1.72) son un grupo de enzimas que eliminan grupos laterales acetilos a partir de xilano. El sistema de clasificación para carbohidrato esterasas, basado en la similitud de secuencias, ha conducido a la definición de 13 familias, siete de las cuales contienen acetil xilano esterasas (COUTINHO, P.M. AND HENRISSAT, B., 1999 Carbohydrate-active enzymes server at URL: <http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/index.html>) .

Con el fin de ser eficientes, la digestión de celulosa requiere de varios tipos de enzimas actuando de manera cooperativa. Son necesarias por lo menos tres categorías de enzimas para convertir la celulosa en glucosa: endo (1, 4) -beta-D-glucanasas (EC 3.2.1.4) que cortan las cadenas de celulosa al azar; celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) que dividen las unidades de celobiosilo de los extremos de las cadenas de celulosa y beta-glucosidasas (EC

3.2.1.21 ) que convierten la celobiosa y las celodextrinas solubles en glucosa.

Margolles-Clark et al. (Eur. J. Biochem. 237, 553-560 (1996) ) describen la clonación del gen que codifica AXE1 de Trichoderma reesei.

Gutiérrez et al. (FEBS Letters 423 (1998) 35-38) caracterizan una acetil xilano esterasa II de Penicillin purpurogenum y la comparan con AXE1 de Trichoderma reesei.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar proteínas mejoradas que tienen una actividad degradante de celulosa o hemicelulosa y polinucleótidos que codifican las proteínas. Un objetivo de la presente invención es proporcionar proteínas mejoradas que tienen actividad de unión a celulosa o hemicelulosa y polinucleótidos que codifican las proteínas. Las proteínas mejoradas pueden mejorar la degradación del material de la pared celular, por ejemplo, celulosa y/o hemicelulosa. Las proteínas también pueden mejorar la estabilidad o la actividad de otras enzimas implicadas en la degradación del material de la pared celular de la planta, por ejemplo, biomasa.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

Se describen aquí genes nuevos, denominados aquí cip1, cip2, axe2 y abf2. También se describen aquí los productos génicos codificados por los genes nuevos. Por lo menos dos genes se coexpresan con los genes en la familia de celulasa.

AXE2

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido tal como se define en las reivindicaciones. El polinucleótido puede ser ARNm, ADN, ADNc, ADN genómico o un análogo no codificante de los mismos. En una realización específica, el polinucleótido comprende una secuencia sustancialmente idéntica a la SEC ID No. 14.

En un segundo aspecto, se proporcionan los polipéptidos o proteínas AXE2 tal como se definen en las reivindicaciones.

En una realización, la presente invención incluye (i) fragmentos de AXE2 de por lo menos aproximadamente 20-100 aminoácidos de longitud, más preferiblemente aproximadamente 100-200 aminoácidos de longitud, y (iii) una composición que comprende AXE2.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos, que codifica el polipéptido de la presente invención, unida operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped adecuado.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un vector de expresión recombinante que comprende la construcción de ácido nucleico de la invención.

La presente invención proporciona además vectores de expresión recombinantes que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica AXE2 o un fragmento del mismo unido operativamente a elementos reguladores eficaces para la expresión de la proteína en un huésped seleccionado. En un aspecto relacionado, la presente invención incluye una célula huésped que contiene el vector.

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a una célula huésped recombinante que comprende la construcción de ácido nucleico de la invención.

La presente invención también incluye un método para producir AXE2 mediante técnicas recombinantes, mediante el cultivo de células huésped recombinantes procariotas o eucariotas que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica AXE2 bajo condiciones efectivas para inducir la expresión de la proteína, y la posterior recuperación de la proteína de la célula huésped o el medio de cultivo de la célula.

En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir un polipéptido de la invención, comprendiendo el método: (a) cultivar un microorganismo tal como se define en las reivindicaciones; y (b) recuperar el polipéptido.

Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Debe entenderse que, sin embargo, la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones preferidas de la invención,... [Seguir leyendo]

1. Polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AXE2 que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene por lo menos un 85% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17, o el complemento de la misma;

(b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AXE2 que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene por lo menos un 90% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17, o el complemento de la misma;

(c) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AXE2 que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17, o el complemento de la misma;

(d) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AXE2 que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17, o el complemento de la misma;

(e) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AXE2 que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 15, o el complemento de la misma;

(f) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AXE2 que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 15, o el complemento de la misma; y

(g) una secuencia de ácidos nucleicos presentada como SEC ID No. 14, o el complemento de la misma, en el que el % de identidad se calcula utilizando el programa CLUSTAL-W en MacVector versión 6.5, operado con los parámetros por defecto, que incluyen una penalización por la abertura de espacio de 10, 0, una penalización por la extensión del espacio de 0, 1, y una matriz de similitud BLOSUM 30.

2. Polinucleótido aislado según la reivindicación 1, en el que dicho polinucleótido es una molécula de ARN.

3. Polinucleótido aislado según la reivindicación 1, en el que la enzima deriva de una fuente de Trichoderma.

4. Polinucleótido aislado según la reivindicación 3, en el que la enzima deriva de Trichoderma reesei.

5. Construcción de expresión que comprende una secuencia de polinucleótido (i) que codifica una enzima que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene por lo menos un 85% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17, o el complemento de la misma; o (ii) que codifica una enzima que tiene actividad acetil xilano esterasa y que tiene por lo menos un 85% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 15, o el complemento de la misma

6. Vector que comprende la construcción de expresión de la reivindicación 5.

7. Vector que comprende un polinucleótido aislado según la reivindicación 1, unido operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector.

8. Célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 6 o la reivindicación 7.

9. Célula huésped según la reivindicación 8, que es una célula procariota.

10. Célula huésped según la reivindicación 8, que es una célula eucariota.

11. Célula huésped procariota recombinante que comprende un polinucleótido según la reivindicación 1.

12. Polipéptido AXE2 sustancialmente purificado que tiene actividad acetil xilano esterasa, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 85% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17;

(b) una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17;

(c) una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17;

(d) una secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO: 17;

(e) una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 15;

(f) una secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO: 15;

(g) un fragmento biológicamente activo sustancialmente purificado de la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO: 17, donde el fragmento tiene actividad acetil xilano esterasa y donde el fragmento comprende por lo menos 20 aminoácidos.

13. Método de producción de una enzima que tiene actividad acetil xilano esterasa, que comprende:

(a) transformar de forma estable una célula huésped con un vector de expresión que comprende un polinucleótido tal como se define en la reivindicación 1;

(b) cultivar dicha célula huésped transformada en condiciones adecuadas para que dicha célula huésped produzca dicha acetil xilano esterasa; y

(b) recuperar dicha acetil xilano esterasa.

14. Método según la reivindicación 13, en el que la célula huésped es un hongo filamentoso o una célula de levadura.

15. Método de preparación de una célula huésped recombinante, que comprende proporcionar una célula parental que tiene un gen axe2 que comprende un polinucleótido tal como se define en la reivindicación 1, y realizar una deleción o inserción u otra alteración en dicho gen axe2 que desactiva el gen, para producir una célula huésped recombinante que no es capaz de producir polipéptido AXE2 tal como se define en la reivindicación 12.

16. Oligonucleótido antisentido complementario a un ARN mensajero que codifica un polipéptido AXE2 que tiene la secuencia presentada como SEC ID No. 17, donde tras la exposición a una célula huésped productora de acetil xilano esterasa, dicho oligonucleótido disminuye o inhibe la producción de acetil xilano esterasa por dicha célula huésped.

17. Oligonucleótido antisentido según la reivindicación 16, en el que la célula huésped es un hongo filamentoso.

18. Composición de detergente, comprendiendo dicha composición una enzima que tiene actividad acetil xilano esterasa seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 85% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17;

(b) una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17;

(c) una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 17;

(d) una secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO: 17;

(e) una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 15;

(f) una secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO: 15;

(g) un fragmento biológicamente activo sustancialmente purificado de la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO: 17, donde el fragmento tiene actividad acetil xilano esterasa y donde el fragmento comprende por lo menos 20 aminoácidos.

19. Alimento animal que contiene xilano que comprende un aditivo alimentario basado en enzimas que comprende acetil xilano esterasa según la reivindicación 12.

20. Aditivo alimentario que comprende acetil xilano esterasa según la reivindicación 12.

21. Método de conversión de biomasa en azúcares que comprende poner en contacto dicha biomasa con una acetil xilano esterasa según la reivindicación 12.

Figura 1: secuencia de ADNc de cip1 (SEC Id No. 1)

Figura 2: secuencia codificante de cip1 (SEC Id No.2)

Figura 4: secuencia de longitud completa de cip2 (SEC Id No. 6)

No. 7)

igura 6: Alineación de Cip2 con R. Flavefaciens cesA CAB55348Cip2 tiene una secuencia señal N-terminal prevista de 17 aminoácidosseguida de 36 aminoácidos que comprenden un módulo de unión a carbohidratode la familia CBM1 y una región enlazadora que termina en aproximadamenteel aminoácido 95

Id No. 10)

Figura 9: alineación de la familia de GH62: aminoácidos.

Figura 10: ADNc de axe2 (SEC Id No. 14)

Figura 12: alineación de axe2Miembro de la familia CE5 Axe2 es un miembro de la familia 5 de carbohidrato esterasas (CE5) . Seprevé que tiene una secuencia señal N-terminal de 21 aminoácidos.Presenta un potencial sitio de unión al ancla de GPI en el aminoácidonúmero 274, correspondiente al residuo de serina en la posición 291 en

la alineación (Undenfriend, S. y K. Kodukula, 1995. Prediction of 0 site in nascent precursor of glycophosphatidylinositol proteína.Methods in Enzymology, 250.

5. 82)

FIGURA 13: transferencia Northern FIGURA 15

FIGURA 17

FIGURA 19