NUEVOS GENES DE TRICHODERMA.

[0001] Se describen en la presente invención cuatro genes dos genes que codifican proteínas que comprenden un dominio de unión a celulosa, una arabinofuranosidasa, y una acetilxilano esterasa. También se describen aquí las proteínas deducidas, y las composiciones que tienen las nuevas proteínas. Estas composiciones son especialmente útiles en aplicaciones textiles, detergentes, conversión de biomasa, pienso y alimentos, y las industrias de la pulpa y el papel. Los genes se aislaron a partir de un hongo filamentoso, Trichoderma reesei (también denominado indistintamente aquí Hypocrea jecorina). ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN [0002] La celulosa y la hemicelulosa son los materiales más abundantes de las plantas producidos por fotosíntesis. Se pueden degradar y utilizar como fuente de energía por numerosos microorganismos, incluyendo bacterias, levaduras y hongos, que producen enzimas extracelulares capaces de la hidrólisis de los sustratos poliméricos a azúcares monoméricos (Aro et al., J. Biol. Chem., 10.1074/ M003624200, 13 de abril de 2001). Dado que se acercan los límites de los recursos no renovables, el potencial de la celulosa para convertirse en una energía renovable principal es enorme (Krishna et al., Bioresource Tech. 77:193-196, 2001). La utilización eficaz de la celulosa a través de procesos biológicos es una estrategia para superar la escasez de alimentos, pienso y combustibles (Ohmiya et al., Biotechnol. Gen. Engineer. Rev. 14:365-414, 1997). [0003] La celulosa es un polisacárido lineal de residuos de glucosa conectados mediante uniones ß-1,4. En la naturaleza, la celulosa está normalmente asociada con lignina junto con hemicelulosas, tales como xilanos y glucomananos. El uso práctico de las celulasas está dificultado por la naturaleza de las celulasas conocidas, que a menudo son mezclas de celulasas que tienen una variedad actividades y especificidades de sustrato. Por esta razón, es deseable identificar celulasas que tienen sólo las actividades deseadas o proteínas que pueden facilitar la acción de la celulasa. [0004] La hemicelulosa es cualquiera de los diversos heteropolímeros (polisacáridos en matriz) presentes en casi todas las paredes celulares junto con celulosa. Sus pesos moleculares son habitualmente inferiores a los de la celulosa y presentan una estructura no diferenciada débil en comparación con la celulosa cristalina. Las cadenas forman una base - se unen con pectina a la celulosa para formar un red de fibras reticuladas. De este modo, sería beneficioso aumentar la degradación de la hemicelulosa. [0005] Las O-Glicosil hidrolasas (EC 3.2.1.-) con un grupo amplio de enzimas que hidrolizan el enlace glicosídico entre dos o más carbohidratos, o entre un carbohidrato y un grupo no carbohidrato. EL sistema de clasificación para las glicosil hidrolasas, basada en la similitud de secuencias, ha conducido a la definición de hasta 60 familias diferentes [HENRISSAT, B. AND BAIROCH, A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. BIOCHEM.J. 293 781-788 (1993); HENRISSAT, B. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. BIOCHEM.J. 280 309-316 (1991); DAVIES, G. AND HENRISSAT, B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. STRUCTURE 3 853-859 (1995); and HENRISSAT, B. AND BAIROCH, A. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. BIOCHEM.J. 316 695-696 (1996)]. Las acetil xilano esterasas (EC 3.1.1.72) son un grupo de enzimas que eliminan grupos laterales acetilos a partir de xilano. El sistema de clasificación para carbohidrato esterasas, basado en la similitud de secuencias, ha conducido a la definición de 13 familias, siete de las cuales contienen acetil xilano esterasas (COUTINHO, P.M. AND HENRISSAT, B., 1999 Carbohydrate-active enzymes server at URL: ). [0006] Con el fin de ser eficientes, la digestión de celulosa requiere de varios tipos de enzimas actuando de manera cooperativa. Son necesarias por lo menos tres categorías de enzimas para convertir la celulosa en glucosa: endo (1,4)-beta-D-glucanasas (EC 3.2.1.4) que cortan las cadenas de celulosa al azar; celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) que dividen las unidades de celobiosilo de los extremos de las cadenas de celulosa y beta-glucosidasas (EC 3.2.1.21 ) que convierten la celobiosa y las celodextrinas solubles en glucosa. [0007] WO 96/06935 describe métodos y construcciones de expresión para la sobreexpresión de una enzima de degradación de arabinoxilano de origen fúngico en una célula huésped microbiano. 2   [0008] Un objetivo de la presente invención es proporcionar proteínas mejoradas que tienen una actividad degradante de celulosa o hemicelulosa y polinucleótidos que codifican las proteínas. Un objetivo de la presente invención es proporcionar proteínas mejoradas que tienen actividad de unión a celulosa o hemicelulosa y polinucleótidos que codifican las proteínas. Las proteínas mejoradas pueden mejorar la degradación del material de la pared celular, por ejemplo, celulosa y/o hemicelulosa. Las proteínas también pueden mejorar la estabilidad o la actividad de otras enzimas implicadas en la degradación del material de la pared celular de la planta, por ejemplo, biomasa. DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN [0009] En la presente invención se describen genes nuevos, denominados aquí cip1, cip2, axe2 y abf2. También se describen en la presente inevnción los productos génicos codificados por los genes nuevos. Por lo menos dos genes se coexpresan con los genes en la familia de celulasa. ABF2 [0010] En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido tal como se define en las reivindicaciones. El polinucleótido puede ser ARNm, ADN, ADNc, ADN genómico, o un análogo no codificante de los mismos. [0011] En otra realización, el polinucleótido tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o más de identidad en la secuencia con la secuencia presentada como SEC ID No: 10 y codifica una proteína ABF2. En una realización específica, el polinucleótido comprende una secuencia sustancialmente idéntica a SEC ID NO: 10. [0012] En un segundo aspecto, se proporcionan polipéptidos o proteínas ABF2 tal como se definen en las reivindicaciones. [0013] En una realización, la presente invención incluye (I) fragmentos de ABF2 de por lo menos 100 aminoácidos de longitud, más preferiblemente 100-200 aminoácidos de longitud, y (iii) una composición que comprende ABF2. [0014] En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos, que codifica el polipéptido de la presente invención, unida operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped adecuado. [0015] En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un vector de expresión recombinante que comprende la construcción de ácido nucleico de la invención. [0016] La presente invención proporciona además vectores de expresión recombinantes que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica ABF2 o un fragmento del mismo unido operativamente a elementos reguladores eficaces para la expresión de la proteína en un huésped seleccionado. En un aspecto relacionado, la presente invención incluye una célula huésped que contiene el vector. [0017] En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a una célula huésped recombinante que comprende la construcción de ácido nucleico de la presente invención. [0018] La presente invención incluye además un método para producir ABF2 mediante técnicas recombinantes, mediante el cultivo de células huésped procariotas o eucariotas recombinantes que comprenden la secuencia de ácido nucleico que codifica ABF2 bajo condiciones efectivas para inducir la expresión de la proteína, y la posterior recuperación de la proteína de la célula huésped o el medio de cultivo celular. [0019] En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir un polipéptido de la invención, comprendiendo el método: (a) cultivar un microorganismo tal como se define en las reivindicaciones; y (b) recuperar los polipéptidos. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS [0020] La figura 1 es una representación en cadena sencilla de la secuencia de ácidos nucleicos (SEC ID NO:1), del ADNc de cip1 de T. reesei, donde la secuencia no codificante está subrayada. [0021] La figura 2 es la secuencia codificante para cip1 de T. reesei (SEC ID No. 2), donde la secuencia señal 3   codificada se indica con los nucleótidos en negrita. [0022] La figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos prevista de CIP1 (SEC ID no. 3), la secuencia señal (SEC ID No. 4) y la secuencia de la proteína madura (SEC ID No. 5) en base a la secuencia de nucleótidos proporcionada en la... [Seguir leyendo]

1. Polinucleótido aislado que tiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido ABF2 que tiene actividad de arabinofuranosidasa y que tiene por lo menos un 85% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO:13, o el complemento de la misma; donde el % de identidad se calcula utilizando el programa CLUSTAL-W en MacVector versión 6.5, operado con los parámetros por defecto, incluyendo una penalización por la apertura del espacio de 10,0, una penalización por la extensión del espacio de 0,1 y una matriz de similitud de BLOSUM30. 2. Polinucleótido aislado según la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de ácidos nucleicos codifica un polipéptido ABF2 que tiene actividad de arabinofuranosidasa y que tiene (i) por lo menos un 90% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO:13, (ii) por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO:13, o (iii) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO:13; o es el complemento de la misma; donde el % de identidad se calcula utilizando el programa CLUSTAL-W en MacVector versión 6.5, operado con los parámetros por defecto, incluyendo una penalización por la apertura del espacio de 10,0, una penalización por la extensión del espacio de 0,1 y una matriz de similitud de BLOSUM30. 3. Polinucleótido aislado según la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de ácidos nucleicos tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95% ó 98% de identidad en la secuencia con la secuencia presentada como SEC ID NO:10, o tiene la secuencia de SEC ID NO: 10; o es el complemento de la misma. 4. Polinucleótido aislado que tiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido ABF2 que tiene actividad de arabinofuranosidasa y que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO:11, o el complemento de la misma; donde el % de identidad se calcula utilizando el programa CLUSTAL-W en MacVector versión 6.5, operado con los parámetros por defecto, incluyendo una penalización por la apertura del espacio de 10,0, una penalización por la extensión del espacio de 0,1 y una matriz de similitud de BLOSUM30. 5. Polinucleótido aislado según la reivindicación 4, en el que dicha secuencia de ácidos nucleicos codifica un polipéptido ABF2 que tiene actividad de arabinofuranosidasa y que tiene la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO:11; o es el complemento de la misma. 6. Polinucleótido aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho polinucleótido es una molécula de ADN. 7. Polinucleótido aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que codifica una enzima que tiene actividad de arabinofuranosidasa, en el que la enzima deriva de una fuente de Trichoderma. 8. Polinucleótido aislado según la reivindicación 7, en el que la enzima deriva de Trichoderma reesei. 9. Construcción de expresión que comprende una secuencia de polinucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. 10. Vector que comprende un polinucleótido aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, unido operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector. 11. Célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 10. 12. Célula huésped según la reivindicación 11, que es una célula procariota. 13. Célula huésped según la reivindicación 11, que es una célula eucariota. 14. Célula huésped procariota recombinante que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. 62   15. Polipéptido ABF2 sustancialmente purificado con actividad de arabinofuranosidasa, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 85% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO:13. 16. Polipéptido ABF2 sustancialmente purificado con actividad de arabinofuranosidasa, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO:11. 17. Polipéptido ABF2 sustancialmente purificado según la reivindicación 15, que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO:13, o que tiene la secuencia de SEC ID NO: 13. 18. Polipéptido ABF2 sustancialmente purificado según la reivindicación 16 que tiene la secuencia de SEC ID NO: 11. 19. Fragmento biológicamente activo sustancialmente purificado de la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO:13, en el que el fragmento tiene acitividad de arabinofuranosidasa y tiene una longitud mínima de 100 aminoácidos. 20. Método de producción de una enzima que tiene actividad de arabinofuranosidasa, que comprende: (a) transformar de manera estable una célula huésped con un vector de expresión que comprende un polinucleótido tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; (b) cultivar dicha célula huésped transformada bajo condiciones adecuadas para dicha célula huésped para producir dicha arabinofuranosidasa; y (c) recuperar dicha arabinofuranosidasa. 21. Método según la reivindicación 20, en el que la célula huésped es un hongo filamentoso o célula de levadura. 22. Composición de cultivo celular que comprende células huésped fúngicas filamentosas que comprenden una construcción de expresión según la reivindicación 9 o un vector según la reivindicación 10, que se han cultivado de manera eficaz para dar lugar a la expresión de un polipéptido ABF2 según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 en un nivel que es superior al de las correspondientes células fúngicas filamentosas que no comprenden dicha construcción de expresión o vector. 23. Método de preparación de una célula huésped recombinante que comprende proporcionar una célula parental que tiene un gen abf2 que comprende un polinucleótido tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y realizar una deleción o inserción u otra alteración en dicho gen abf2 que inactiva el gen, para producir una célula huésped recombinante que es incapaz de producir un polipéptido ABF2 tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18. 24. Oligonucleótido antisentido complementario a un ARN mensajero que codifica un polipéptido ABF2 que tiene la secuencia presentada como SEC ID NO:13, en el que tras la exposición a una célula huésped productora de arabinofuranosidasa, dicho oligonucleótido disminuye o inhibe la producción de arabinofuranosidasa por dicha célula huésped. 25. Oligonucleótido antisentido según la reivindicación 24, en el que la célula huésped es un hongo filamentoso. 26. Composición de detergente, comprendiendo dicha composición un polipéptido ABF2 o un fragmento del mismo con actividad de arabinofuranosidasa según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19. 27. Aditivo de alimentación que comprende un polipéptido ABF2 o un fragmento del mismo con actividad de arabinofuranosidasa según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19. 28. Método de conversión de biomasa en azúcares que comprende poner en contacto dicha biomasa con un polipéptido ABF2 o un fragmento del mismo con actividad de arabinofuranosidasa según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19. 63   Figura 1: secuencia de ADNc de cip1 (SEC Id No. 1) 64   Figura 2: secuencia codificante de cip1 (SEC Id No. 2)   Figura 3A: secuencia de la proteína CIP1 (SEC Id No. 3) Figura 3B: secuencia señal CIP1 (SEC Id No. 4) Figura 3C: secuencia de la proteína madura CIP1 (SEC Id No. 5) 66   Figura 4: secuencia de longitud completa de cip2 (SEC Id No. 6) 67   Figura 5A: secuencia de la proteína CIP2 (SEC Id No. 7) Figura 5B: secuencia señal de CIP2 (SEC Id No. 8) Figura 5C: secuencia de la proteína madura (SEC Id No. 9) 68   Figura 6: Alineación de Cip2 con R. Flavefaciens cesA CAB55348 Cip2 tiene una secuencia señal N-terminal prevista de 17 aminoácidos seguida de 36 aminoácidos que comprenden un módulo de unión a carbohidrato de la familia CBM1 y una región enlazadora que termina en aproximadamente el aminoácido 95 69   Figura 7: secuencia de ácido nucleico de abf2 (SEC Id No. 10)   Figura 8A: secuencia de aminoácidos de Abf2 (SEC Id No. 11) Figura 8B: secuencia señal de Abf2 (SEC Id No. 12) Figura 8C: secuencia de proteína madura de Abf2 (SEC Id No. 13) 71   Figura 9: alineación de la familia de GH62: Abf2 es un miembro de la familia de glicosil hidrolasas 62. Se prevé que tiene una secuencia señal N-terminal de 19 aminoácidos. 72   Figura 10: ADNc de axe2 (SEC Id No. 14) 73   Figura 11A: secuencia de aminoácidos de AXE2 (SEC Id No. 15) Figura 11B: secuencia señal de AXE2 (SEC Id No. 16) Figura 11C: secuencia de proteína madura de AXE2 (SEC Id No. 17) 74   Figura 12: alineación de axe2 Miembro de la familia CE5 Axe2 es un miembro de la familia 5 de carbohidrato esterasas (CE5). Se prevé que tiene una secuencia señal N-terminal de 21 aminoácidos. Presenta un potencial sitio de unión al ancla de GPI en el aminoácido número 274, correspondiente al residuo de serina en la posición 291 en la alineación (Undenfriend, S. y K. Kodukula, 1995. Prediction of site in nascent precursor of glycophosphatidylinositol proteína. Methods in Enzymology, 250: 57-82)   76 FIGURA 13: transferencia Northern   FIGURA 14: Análisis por microarray 77   FIGURA 15 78   FIGURA 16: Alineación de Cip1 con la hidrolasa secretada potencial de Streptomyces coelicolor A3 (número de acceso CAA18323) 79   FIGURA 17 Polienlazador pSL1180 Promotor cbh1 Polienlazador pSL1180 Marco de lectura A Gateway Promotor cbh1 Gen amdS   FIGURA 18 Sitio para cebado directo M13 81 Sitio de reconocimiento 1 de TOPO Sitio de reconocimiento 2 de TOPO Sitio para cebado inverso M13 Gen de resistencia a kanamicina   FIGURA 19 Polienlazador pSL1180 Promotor cbh1 82 Gen de interés, es decir, cip1 o cip2 o abf2 o axe2 Polienlazador pSL1180 Terminador cbh1 Gen amdS   FIGURA 20 Muestras con Cip1 en matraz de agitación Muestras: 1) Marcadores de peso molecular 2) Transformante #1 3) Transformante #2 4) Transformante #3 5) Transformante #4 6) Transformante #5 7) Transformante #6 8) Transformante #7 9) Transformante #8 10) Transformante #9 11) Transformante #10 12) Transformante #11 83   FIGURA 21 Muestras con Cip2 en matraz de agitación Muestras: 1) Marcadores de peso molecular 2) Cepa con quad eliminado 3) Transformante #1 4) Transformante #2 5) Transformante #3 6) Transformante #4 7) Transformante #5 8) Transformante #6 9) Transformante #7 10) Transformante #8 11) Transformante #9 12) Transformante #10 84   FIGURA 22 Muestras con Abf2 en matraz de agitación Muestras: 1) Cepa con quad eliminado 2) Marcadores de peso molecular 3) Transformante Abf2