Nuevos catalizadores altamente estabilizados de la enzima beta-galactosidasa de Kluyveromyces lactis inmovilizada sobre soportes glioxil.

Nuevos catalizadores altamente estabilizados de la enzima β

-galactosidasa de kluyveromyces lactis inmovilizada sobre soportes glioxil.

La presente invención se refiere a un procedimiento de estabilización de una β-galactosidasa de Kluyveromyces lactis, preferentemente inmovilizada en un soporte, que comprende unir la enzima a un polímero activado con al menos un agente conservante de estabilización de enzimas, dicho polímero activado comprendiendo grupos aldehído y/o carboxilo, y donde la unión es de tipo covalente y/o electrostática entre al menos un grupo amino de la enzima con un grupo aldehído o carboxilo del polímero activado.

Es asimismo objeto de la presente invención, el catalizador de β-galactosidasa de Kluyveromyces lactis obtenido por el procedimiento anterior, así como sus diferentes usos tales como la hidrólisis de lactosa en leche y sueros ácidos, la síntesis de galactooligosacáridos o su uso en reactores de tanque agitado, de lecho fijo o de lecho fluidizado.

NUEVOS CATALIZADORES ALTAMENTE ESTABILIZADOS DE LA ENZIMA p- GALACTOSIDASA DE Kluyveromyces lactis INMOVILIZADA SOBRE SOPORTES GLIOXIL

Sector de la técnica

La presente invención se enmarca dentro de los sectores químico y farmacéutico, más concretamente dentro del campo de la biocatálisis para procesos de hidrólisis de lactosa o de síntesis de galactooligosacáridos. También se refiere al campo de la alimentación, y específicamente a la industria de los productos lácteos en procesos de hidrólisis de lactosa tanto en leche como en sueros ácidos. Así, la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de una p-galactosidasa de Kluyveromyces lactis inmovilizada y estabilizada en un soporte altamente activado con grupos glioxil, así como sus usos en biocatálisis y en la producción de distintos productos de origen lácteo. Esto incluye tanto la hidrólisis de lactosa como la síntesis de galactooligosacaridos que son compuestos muy interesantes útiles como probióticos y que se adicionan a alimentos para favorecer la flora microbiana intestinal.

Estado de la técnica

La hidrólisis de lactosa a nivel de cartón de leche es un proceso bien estudiado consistente en la incubación de la leche en presencia de bajas concentraciones de p-galactosidasa soluble. Sin embargo, el uso de p-galactosidasa (P-gal) inmovilizada y estabilizada en reactores en continuo tiene diferentes aplicaciones muy relevantes como: (i) preparación de grandes cantidades de leche y derivados de la misma libres de lactosa, como helados cremosos, leche condensada y queso (Rogalski, Dawidowicz & Leonowi, 1994), (ii) producción de suero de leche libre de lactosa (Szczodrak, 2000), y (iii) síntesis de oligosacáridos (Prenosil, Stuker& Bourne, 1987).

Lactozym es una p-gal comercial de Kluyveromyces lactis proporcionada por Novozymes. Esta p-galactosidasa es un homotetrámero con un peso molecular de aproximadamente 118 KD por subunidad (Pereira-Rodriguez et al. DOI:10.2210/pdb3oba/pdb) siendo esta muy activa (3000 lU/mL). Esta enzima ya ha sido descrita su gran utilidad tanto en procesos de hidrólisis de lactosa y suero así como en proceso de síntesis de galactooligosacaridos u

otros compuestos de gran interés que tienen galactosa en su estructura (Rodríguez-Colinas et al, 2011). Sin embargo esta enzima tiene una relativamente baja estabilidad incluso en condiciones de pH neutro. De esta manera, es clave disponer de catalizadores heterogéneos que tengan una buena estabilidad en diferentes condiciones de reacción, tanto en pH neutro como en otras condiciones de pH o incluso en presencia de codisolventes orgánicos. Esto haría tener una mayor versatilidad en diferentes procesos como hidrólisis de lactosa en leche o sueros a pH neutro, hidrólisis de lactosa en sueros ácidos o bien síntesis o hidrólisis en otras condiciones que pudieran tener interés como pH básico o presencia de codisolventes. Esta enzima ha sido inmovilizada usando diferentes técnicas, pero las estabilizaciones observadas no han sido muy altas. De este modo cuando la enzima fue inmovilizada sobre sílica o agarosa activadas con diferentes grupos funcionales los derivados obtenidos tuvieron una estabilidad similar a la de la enzima soluble (Giacomini, Villarino, Franco-Fraguas & Batista-Vi era, 1998). Esta enzima fue inmovilizada también sobre soportes activados con glutaraldehído obteniéndose derivados con estabilidad muy similar a la de la enzima soluble (Ladero, Santos & Garcia-Ochoa, 2000), y en Duolite A-568 obteniéndose derivados 7 veces más estables que la enzima soluble (Maugard, Gaunt, Legoy, & Besson, 2003).

Los soportes glioxil agarosa han sido utilizados satisfactoriamente para la inmovilización y estabilización de enzimas mediante un proceso de inmovilización covalente multipuntual o multisubunidades en el caso de proteínas multiméricas (Blanco, Calvete & Guisan, 1988; Mateo et al, 2006). Los factores de estabilización utilizando estos soportes han sido diferentes dependiendo de la estructura de la enzima estando estos entre 60,000 veces para el caso de la quimotripsina hasta 10 veces en el caso de la uroquinasa (Mateo et al. 2006). Mientras generalmente está descrito que el incremento del grado de multipuntualidad de la unión covalente está relacionado con un incremento en la estabilidad de los derivados obtenidos, se ha podido comprobar cómo en algunos casos este incremento del grado de multipuntualidad está relacionado con un descenso en la estabilidad de los derivados obtenidos. Este efecto es particularmente pronunciado en el caso de enzimas multiméricas (Fernandez-Lafuente 2009).

En los soportes glioxil (GS), los grupos glioxil reaccionan con grupos amino primarios para formar iminas. Este proceso es reversible pero pueden ser convertidos en irreversibles tras un proceso de reducción de la ¡mina para convertirse en una amina secundaria. Durante este mismo proceso de reducción, los grupos aldehido que no han reaccionado con la enzima son reducidos también para producir grupos hidroxilo inertes (figura 1). Sin embargo,

estos soportes solo pueden inmovilizar enzimas si consiguen interactuar simultáneamente a través de varios puntos de enlace covalente con la proteína. Teniendo en cuenta este mecanismo multipuntual, las enzimas serán así inmovilizadas por la región de su superficie más rica en lisinas y además la inmovilización debe ser generalmente realizada a pH alcalino, condición en la cual las lisinas estarán desprotonadas y por tanto reactivas. Tras el primer proceso de inmovilización, ha sido descrito que un alto número de grupos reactivos, altas temperaturas y tiempos de incubación enzima-soporte largos provocan que se aumente el número de interacciones entre la proteína y el soporte (Guisan, 1988). Previamente se ha podido demostrar el aumento de la multiinteracción tras medir la desaparición de lisinas en los derivados glioxil comparado con las lisinas que tiene la enzima soluble (Blanco, Calvete & Guisan, 1989; Pedroche et al. 2007). Sin embargo, mientras el aumento de enlaces covalentes normalmente aumenta la rigidez y estabilidad de la estructura de la proteína, esto generalmente va acompañado de una pérdida parcial de actividad dependiendo de la distorsión que induzca este proceso.

Además esta técnica de inmovilización podría prevenir la degradación proteolítica causada por la plasmina, una proteasa similar a la tripsina presente en la leche (Crudden, Fox & Kelly, 2005; Vlakh et al, 2003). Esto es debido a que la interacción multipuntual enzima- soporte involucra residuos lisina, lo que hace de estos derivados en principio más resistentes a un ataque hidrolítico y el hecho de que sean derivados inmovilizados por unión covalente multipuntual les protege de las proteasas y les da rigidez a la estructura enzimática.

Por otro lado, otra estrategia de estabilización de enzimas consiste en adicionar aditivos solubles a las diferentes preparaciones enzimáticas. Estos compuestos pueden ser polímeros de gran tamaño como dextranos, PEG, polietileniminas, u otros; o diferentes compuestos de pequeño tamaño como glicerol, otros azúcares como la trehalosa o diferentes compuestos cargados como aminoácidos o incluso inhibidores de la enzima. Si bien la adición de estos compuestos a escala de laboratorio es un método eficiente de estabilización, esto es imposible de hacer a escala industrial debido a que sería necesario adicionar grandes cantidades del compuesto con el alto coste que esto generaría. Además, el tratamiento con diferentes compuestos solubles produciría la contaminación de los productos de reacción, que en algunos casos podrían ser similares a estos aditivos. Esto generaría la necesidad de realizar costosos procesos de purificación.

Descripción detallada

La presente invención describe una estrategia novedosa consistente en la unificación de un procedimiento de inmovilización de la enzima p-galactosidasa de Kluyveromyces lactis sobre soportes glioxil, el cual permite obtener derivados muy estables, con la adición posterior de diferentes conservantes que promuevan una mayor estabilización de la enzima. Más concretamente, estos conservantes irán anclados en polímeros desplegados como son por ejemplo los dextranos, que posteriormente serán inmovilizados sobre la enzima previamente inmovilizada sobre el soporte (Figura 2). Con esta técnica se pueden estabilizar aún más los derivados enzimáticos previamente estabilizados durante el proceso de inmovilización. La utilización de esta metodología nos permite obtener derivados con mayores factores de estabilización que los solamente inmovilizados, pero sin tener que adicionar grandes cantidades de conservantes en el proceso de reacción.

Asimismo, la presente... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de estabilización de una p-galactosidasa de Kluyveromyces lactis, caracterizado porque comprende unir la enzima a un polímero activado con al menos un agente conservante de estabilización de enzimas, dicho polímero activado comprendiendo grupos aldehído y/o carboxilo, y donde la unión es de tipo covalente y/o electrostática entre al menos un grupo amino de la enzima con un grupo aldehído o carboxilo del polímero activado.

2. Procedimiento según la reivindicación 1 donde para llevar a cabo la unión de la enzima al polímero comprende:

a. poner en contacto la enzima y el polímero,

b. hacer reaccionar la enzima y el polímero en medio acuoso a pH entre 4,5 y 10,2 hasta formar al menos un enlace entre un grupo amino de la enzima y un grupo aldehído o carboxilo del polímero, dicho enlace seleccionado del grupo que consiste en:

- enlace covalente entre un grupo amino de la enzima y un grupo aldehído del polímero;

- enlace covalente entre un grupo amino de la enzima y un grupo carboxilo del polímero;

- enlace electrostático entre un grupo amino de la enzima y un grupo carboxilo del polímero;

o una combinación de dos o más de los anteriores.

3. Procedimiento según la reivindicación 2 en el que, cuando el polímero activado comprende grupos aldehído o grupos aldehído y carboxilo, para formar el enlace covalente entre el grupo amino de la enzima y el grupo aldehído del polímero, se hace reaccionar la enzima y el polímero comprendiendo las siguientes etapas:

b.1. mantener el medio acuoso que contiene la enzima a pH entre 9,8 y 10,2 hasta formar al menos un enlace imina,

b.2. reducir el enlace imina con un agente reductor de iminas y aldehídos, b.3. neutralizar el pH del medio acuoso a un valor comprendido entre 6,0 y 8,0, una vez finalizada la etapa de reducción anterior.

4. Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3 en el que, cuando el polímero comprende grupos carboxilo, para formar el enlace entre el grupo amino de la enzima y el grupo

carboxilo del polímero, se hace reaccionar la enzima y el polímero comprendiendo al menos una de las siguientes etapas:

b.4. mantener el medio acuoso que contiene la enzima a pH entre 4,5 y 5,0, en presencia de un agente de acoplamiento peptídico, hasta formar un enlace covalente tipo amida entre los grupos amino y carboxilo; y/o

b.5. ajustar el pH del medio acuoso que contiene la enzima entre 6,0 y 8,0 hasta formar al menos un enlace electrostático entre un grupo amino de la enzima y un grupo carboxilo del polímero.

5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el polímero está activado entre un 50% y un 100% con dicho agente conservante, y además entre un 0% y un 50% con grupos aldehido o glioxilo.

6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el polímero es un dextrano.

7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el agente conservante es glicina.

8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, donde la enzima se hace reaccionar con el polímero entre 1 y 20 horas.

9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la unión de la enzima al polímero se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 4 °C y 25 °C.

10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, donde la enzima se deja reaccionar con el polímero entre 1 y 3 horas.

11. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende obtener el polímero activado previamente a su unión con la enzima.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, que cuando el polímero activado es un dextrano activado con glicina, la obtención del mismo comprende:

i.1. oxidar un dextrano entre un 50% y un 100% a grupos aldehido o glioxilo;

1.2. unir glicina covalentemente al dextrano mediante reacción del dextrano oxidado con glicina, seguido de reducción con un agente reductor de aldehidos e iminas y posterior neutralización del pH.

13. Procedimiento según la reivindicación 12 que, cuando la oxidación del dextrano es inferior al 100%, además comprende:

1.3. reoxidar a grupos aldehído o glioxilo el dextrano previamente unido a glicina.

14. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde la p- galactosidasa se encuentra inmovilizada en un soporte activado con grupos glioxil.

15. Procedimiento según la reivindicación 14 que comprende además inmovilizar la p- galactosidasa previamente a su unión con el polímero activado, donde dicha inmovilización comprende:

11.1. hacer reaccionar la p-galactosidasa con un soporte altamente activado con grupos glioxil en solución tamponada libre de sodio a pH 10 y en presencia de al menos un catión estabilizador de la enzima en concentración adecuada para mantener la actividad de dicha enzima;

11.2. reducir el producto de la reacción anterior con un agente reductor de aldehídos e iminas.

16. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, donde el soporte es glioxil agarosa.

17. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 donde, donde la glioxil agarosa es agarosa 6BCL activada con 75 micromoles de grupos aldehído por mililitro de soporte.

18. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, donde la solución tamponada es bicarbonato de potasio.

19. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, donde el catión estabilizador se selecciona del grupo que consiste en: catión potasio a una concentración comprendida entre 0,05 M y 0,3 M, catión magnesio a una concentración comprendida entre 0,5 mM y 0,3 mM, y una combinación de los mismos.

20. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, donde se deja reaccionar la (3-galactosidasa con el soporte entre 20 minutos y 20 horas.

21. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, donde se deja 5 reaccionar la (3-galactosidasa a una temperatura comprendida entre 4 °C y 35 °C.

22. Un catalizador de (3-galactosidasa de Kluyveromyces lactis obtenido por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.

23. Uso de una (3-galactosidasa de Kluyveromyces lactis obtenida por el procedimiento de

una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, como catalizador enzimático en un reactor de tanque agitado, de lecho fijo o de lecho fluidizado.

24. Uso de una (3-galactosidasa de Kluyveromyces lactis obtenida por el procedimiento de 15 una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, para hidrolizar lactosa en leche o en sueros

ácidos.

25. Uso de una (3-galactosidasa de Kluyveromyces lactis obtenida por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, como catalizador enzimático en procesos de

transglicoxilación para producir galactooligosacáridos.