Nuevo modelo animal de acromatopsia.

La presente invención describe ratones albinos no consanguíneos HsdWin:

NMRI, mutantes para el gen Gnat2, causante del fenotipo alterado de retina coneless, preferentemente una mutación Gnat2cpfl3, y más preferentemente en homocigosis. Así mismo, la presente invención hace referencia al uso de dichos ratones, concretamente su uso como modelo animal para retinopatías, preferentemente acromatopsia y más preferentemente acromatopsia de tipo IV. La presente invención también hace referencia a un método para identificar al menos un ratón albino no consanguíneo HsdWin:NMRI, caracterizado por presentar una mutación en el gen Gnat2, causante del fenotipo alterado de retina coneless, en una colonia de ratones albinos no consanguíneos HsdWin:NMRI, preferentemente una mutación Gnat2cpfl3, y más preferentemente en homocigosis.

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SECTOR DE LA TECNICA NUEVO MODELO ANIMAL DE ACROMATOPSIA DESCRIPCION

La presente invencion se dirige, tanto en los aspectos de produccion como de utilizacion, a los sectores de agricultura, quimica y farmacia. En especial, la presente invencion se dirige a empresas relacionadas con la cria y distribucion de animales de experimentacion, y a empresas biotecnologicas que usan modelos animales para desarrollar o validar estrategias preclinicas para el tratamiento de retinopatias, como por ejemplo la acromatopsia.

ESTADO DE LA TECNICA ANTERIOR

Esta invencion se refiere a una descripcion de un nuevo modelo animal de acromatopsia de tipo IV, identificado en ratones de la colonia albina no consanguinea comercial HsdWin:NMRI. La acromatopsia de tipo IV, como enfermedad rara, esta asociada a mutaciones en el gen Gnat2, localizado en el cromosoma 3 del genoma del raton, en las coordenadas: 3:107895707-107904350, (OMIM quot;Online Mendelian Inheritance in Manquot;: http://omim.org, OMIM: #139340) . Este gen codifica para la subunidad alfa de la proteina transducina, implicada en el proceso de la fototransduccion en la retina (Hofmann KP et al. 2009) . La acromatopsia es una enfermedad congenita rara (ORPHANET: http://www.orphanet.org, ORPHA49382) , autosomica y de herencia recesiva, con una baja prevalencia, estimada en 1-9:100000 personas, caracterizada por una reducida agudeza visual, nistagmo, fotofobia, pequeno escotoma central , fijacion excentrica y perdida total o parcial a la capacidad de discriminacion de colores (Kohl S, et al. 2010) . La mayoria de individuos afectados tienen acromatopsia completa, con una perdida total de la funcion de los tres tipos de fotorreceptores (verdes, rojos y azules) . Mas infrecuentemente existen personas afectadas que tienen acromatopsia incompleta, en la que uno o varios tipos de conos funcionan incorrectamente. En este ultimo caso los sintomas son parecidos a la acromatopsia completa, aunque menos severos. La agudeza visual oscila entre un 10%, o menos, en el caso de acromatopsia completa, y puede llegar al 25% en el caso de acromatopsia incompleta. El diagnostico puede determinarse geneticamente, mediante fallos o confusion en la percepcion de los colores, con ayuda de un sencillo test visual, y mediante electrofisiologia, usando ERG, en la que respuesta fotopica (incluida la respuesta flicker a 30 Hz, debida mayoritariamente a fotorreceptores conos) es ausente o esta marcadamente reducida. Se conocen por lo menos cuatro genes cuyas mutaciones causan diferentes tipos de acromatopsia: CNGA3, CNGB3, GNAT2 y PDE6C. Las mutaciones en el gen CNGB3 (OMIM: #605080) , asociado a acromatopsia de tipo III (OMIN: #262300) suman mas del 50% de casos de acromatopsia (Kohl S, et al. 2005) , un 25% de casos de acromatopsia se deben a mutaciones en el gen CNGA3 (OMIM: #600053) , asociado a acromatopsia de tipo II (OMIM: #216900) (Kohl S, et al. 1998) , mientras que las mutaciones en el gen GNAT2 (OMIM: #139340) , asociado a acromatopsia de tipo IV (OMIM: #613856) (Aligianis et al. 2002) y PDE6C (OMIM: #600827) , asociado a acromatopsia de tipo V (Thiadens AA, et al. 2009) tienen una menor prevalencia ( 2%) . Existen documentos de patente relativos a metodos de ajuste cromatico para personas con acromatopsia (EP2175414 publicada el 14/04/2010 por Konica Minolta Holdings Inc; WO/2009/020115 publicada el 12/2/2009 por Konica Minolta Holdings Inc) o dispositivos para detectar y corregir acromatopsia en humanos (EP1354550 publicada el 22/10/2003 por Chen Yan Dept. Of Physical EDUC; WO/1999/045424 publicada el 10/9/1999 por Chen, Mou) . La acromatopsia es una condicion genetica monogenica y localizada, por lo tanto buena candidata para ser tratada mediante terapia genica (Pang JJ, et al. 2010) . Para ello son necesarios modelos animales de acromatopsia que puedan ser utilizados en el desarrollo y validacion de estas aproximaciones terapeuticas. Hasta la fecha se conocen varios ratones mutantes en los genes causantes de acromatopsia: Cnga3tm1Biel (MGI quot;Mouse Genome Informaticsquot;: http://www.informatics.jax.org, MGI:2388388, descrito en Biel M, et al. 1999) , Cngb3tm1Dgen (MGI:4367989, descrito en Ding XQ, et al. 2009) , ratones de la cepa ALS/LtJ, con la mutacion Gnat2cpfl3 (MGI:3588845, descrito en Chang B, et al. 2006) y Pde6ccpfl1 (MGI:2657247, descrito en Chang B, et al. 2002) , ademas de los que estan siendo producidos, genericamente, dentro de la iniciativa IKMC (IKMC: quot;International Knockout Mouse Consortiumquot;, http://www.knockoutmouse.org) . Algunos de estos modelos animales ya han sido usados con exito en experimentos preclinicos de terapia genica utilizando vectores virales (por ejemplo: AAV) portadores de la copia correcta del gen a corregir. Se han publicado experimentos de terapia genica, en ratones, para restaurar la funcion del gen Gnat2 (Alexander JJ, et al. 2007) , tambien para restaurar la funcion del gen Cnga3 (Michalakis S, et al. 2010) , y para el gen Cngb3 (Carvalho LS, al. 2011) . Tambien para este gen, Cngb3, se han reportado experimentos de terapia genica realizados en modelos caninos (Komaromy AM, et al. 2010) .

El uso universal de multitud de cepas y colonias de raton en investigacion biomedica hace que sea muy importante la caracterizacion genetica de las mismas, con objeto de que los experimentos a realizar a posteriori con ellas puedan interpretarse correctamente. Es importante describir si una determinada cepa de raton es portadora de mutaciones que puedan interferir en las investigaciones posteriores (Mattapallil MJ, et al. 2012) .

En la actualidad, se conoce otro modelo animal de acromatopsia de tipo IV con mutaciones en el mismo gen Gnat2. Los ratones ALS/Ltj son portadores de la mutacion Gnat2cpfl3, correspondiente a un unico cambio de nucleotido, situado en el exon numero 6 del gen, en posicion G598A, que esta asociado al cambio de residuo de aminoacido Asp200Asn en la proteina Gnat2 resultante (Chang B, et al. 2006) . Estos ratones ALS/Ltj manifiestan las alteraciones en la retina caracteristicas de los pacientes con acromatopsia de tipo IV, sin embargo han tenido un uso muy limitado en investigacion biomedica. Una busqueda de quot;ALS/Ltjquot; en la base de datos de publicaciones cientificas PubMed aporta solamente tres articulos.

Por otro lado, algunos ratones de la colonia albina no consanguinea comercial HsdWin:NMRI presentan un deficit funcional de fotorreceptores de tipo cono, medido mediante eletrorretinografia, ERG, alteracion que se correlaciona con un numero inferior de fotorreceptores de tipo cono analizados mediante histologia e inmunohistoquimica (De la Villa P, et al. 2007) . Los ratones HsdWin:NMRI se utilizan habitualmente en experimentacion animal. A diferencia de los ratones de la cepa ALS/Ltj, cuyo uso es muy poco frecuente en biomedicina, los ratones de la colonia comercial (stock en ingles) no consanguinea HsdWin:NMRI son de uso muy comun y se utilizan como ratones albinos no consanguineos en multitud de experimentos, en todo el mundo, gracias a su buen comportamiento, excelente capacidad de cria y a que pueden ser obtenidos facilmente desde diversos distribuidores: Harlan, Charles River, Taconic. Una busqueda de quot;NMRIquot; en la base de datos de publicaciones cientificas PubMed aporta mas de 2000 articulos.

El haber descubierto que en los ratones HsdWin:NMRI segrega la mutacion Gnat2cpfl3, hecho desconocido hasta el momento, implica que en cualquier colonia de estos ratones existente actualmente en el mundo habra, por lo menos, relativo a este locus, dos tipos de ratones NMRI, los que manifiesten el fenotipo de acromatopsia y los que no (ademas de los portadores de la mutacion que, al ser recesiva, no manifestaran alteraciones en su retina) . A cualquier persona interesada en utilizar un modelo animal de acromatopsia o en diferenciar, en su colonia de ratones NMRI, los portadores de la mutacion en el gen Gnat2, le sera mucho mas sencillo y asequible utilizar estos ratones NMRI que los ratones ALS/LtJ.

Adicionalmente, tambien se conoce en estos animales HsdWin:NMRI la existencia de individuos que, ademas de presentar las alteraciones en ERG mencionadas, asociadas a un deficit funcional de conos, fenotipo electrorretinografico denominado quot;conelessquot;, muestran ademas defectos degenerativos en la retina (presencia de vacuolas/drusas) , similares a los que aparecen asociados a muchas otras retinopatias, como la degeneracion macular asociada a la edad (DMAE) (Zurita E, et al. 2010) .

Las alteraciones del fenotipo quot;conelessquot; (alteraciones en la retina y en el ERG de los conos) identificadas en los ratones HsdWin:NMRI son caracteristicas de un elevado numero de distintas retinopatias, como por ejemplo: la acromatopsia, la retinitis pigmentosa (la cual presenta mas de 100 genes distintos asociados) , la vitroretinocoroidiopatia, el sindrome... [Seguir leyendo]

1. Un raton albino no consanguineo HsdWin:NMRI, caracterizado por presentar una mutacion en el gen Gnat2 causante del fenotipo electrorretinografico (ERG) de conos alterado de retina coneless.

2. El raton segun la reivindicacion 1, caracterizado por presentar una mutacion Gnat2cpfl3.

3. El raton segun la reivindicacion 2, caracterizado por presentar una mutacion Gnat2cpfl3 en homocigosis.

4. Uso del raton descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, como modelo animal de una retinopatia.

5. Uso segun la reivindicacion 4, caracterizado por que la retinopatia es acromatopsia.

6. Uso segun la reivindicacion 5, caracterizado por que la acromatopsia es de tipo IV.

7. Uso del raton descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para el tratamiento y/o prevencion de anomalias y/o deficits visuales asociados a una retinopatia.

8. Uso segun la reivindicacion 7, caracterizado por que la retinopatia es acromatopsia.

9. Uso segun la reivindicacion 8, caracterizado por que la acromatopsia es de tipo IV.

10. Uso del raton descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para terapia genica.

11. Uso del raton descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para validar protocolos de terapia experimental, genica o no, para tratamiento y/o prevencion de los sintomas clinicos asociados a la acromatopsia de tipo IV.

12. Uso del raton descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para estudios de la retina o del sistema visual.

13. Un metodo mediante PCR para identificar al menos un raton albino no consanguineo HsdWin:NMRI, caracterizado por presentar una mutacion en el gen Gnat2, causante del fenotipo electrorretinografico (ERG) de conos alterado de retina coneless, en una colonia de ratones albinos no consanguineos HsdWin:NMRI.

14. El metodo segun la reivindicacion 13, caracterizado por que se identifica al menos un raton que presenta una mutacion Gnat2cpfl3.

15. El metodo segun la reivindicacion 14, caracterizado por que se identifica al menos un raton que presenta una mutacion Gnat2cpfl3 en homocigosis.

16. El metodo segun la reivindicacion 14, caracterizado por que se identifica al menos un raton que presenta una mutacion Gnat2cpfl3 en heterocigosis.