Nuevo método de clonación y mutagénesis in vitro mediante PCR

inversa de clonación

La presente invención pertenece al campo de la Biología Molecular, la Ingeniería Genética y la Biotecnología. La presente invención se refiere a un nuevo método in vitro para la clonación dirigida o para la clonación dirigida y la mutagénesis dirigida simultánea, usando una PCR inversa de clonación (CiPCR) . Además, la presente invención se refiere a un kit que comprende las instrucciones para llevar a cabo dichos métodos.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La clonación de un inserto o fragmento de ADN en un vector consiste en unir los correspondientes extremos 5' y 3' del fragmento de ADN a los correspondientes sitios 3' y 5' del vector, respectivamente. La construcción génica circular generada es un vector que puede ser introducido en una célula, donde se replica cuando la célula es cultivada, de forma que su progenie lo hereda, permitiendo de esta manera la obtención de muchas copias idénticas o clones de dicho fragmento de ADN contenido en el nuevo vector.

Las técnicas usadas mayoritariamente para la clonación de fragmentos de ADN en un vector son muy variadas y se pueden clasificar, según la metodología a usar, en cinco tipos comúnmente conocidos como: métodos de ligamiento de extremos romos, métodos de restricción, métodos de clonación T-A, métodos de recombinación, y métodos LIC (método de clonación independiente de ligasas, del inglés "ligation independent cloning'}.

Los métodos de ligamiento de extremos romos se basan en el uso de enzimas de restricción cuyos productos tienen extremos romos. Estos métodos son fáciles de entender, pero experimentalmente son lentos y tediosos, y no permiten la clonación de forma dirigida de manera fácil y eficiente. Entre sus mayores limitaciones están que dependen de la presencia de las secuencias diana tanto en el inserto como en el vector, que no permiten usar directamente amplicones de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) con residuos de desoxiadenosina en su extremo 3', que falta información acerca de las secuencias flanqueantes a las dianas de determinadas enzimas de restricción y que la eficiencia de la ligasa de ADN a la hora de unir extremos romos es baja.

Los métodos de restricción se basan en el uso de enzimas de restricción cuyos productos tienen extremos cohesivos o protuberantes (en el ADN bicatenario un cierto número de residuos del extremo de la cadena correspondiente sobresale en forma de cadena sencilla) . Estos métodos son fáciles de entender, permiten la clonación tanto dirigida como no dirigida del inserto, y una ligación eficiente del inserto al vector. Sin embargo, presentan importantes limitaciones, como la necesidad de que tanto el vector como el inserto presenten las secuencias diana en los sitios adecuados, la falta de información acerca de las secuencias flanqueantes a las dianas de determinadas enzimas de restricción, el hecho de que cuando se usa una única enzima de restricción solamente se puede clonar de forma no dirigida,

o que la clonación del inserto de forma dirigida requiere el uso de dos enzimas de restricción diferentes. Esto último conlleva un mayor número de pasos experimentales, y sobre todo puede suponer un inconveniente debido a la incompatibilidad de las dianas presentes en el vector deseado y en el inserto. Generalmente, la clonación por restricción requiere un estudio previo exhaustivo de la estrategia a seguir y de los vectores a utilizar, ocasionando una notable pérdida de tiempo, acrecentada cuando la disposición de las secuencias diana obliga a la clonación del inserto en un primer vector y a la transferencia del inserto a un segundo vector o vector deseado.

Los métodos de clonación T -A y similares se basan en la hibridación del inserto con el vector bien a través de residuos de desoxiadenosinas en los extremos 3' protuberantes del inserto que hibridan con residuos de desoxitimidinas en los extremos 3' protuberantes del vector, o a través de secuencias especiales añadidas, o mediante activaciones de otros residuos terminales. Estos métodos emplean vectores comerciales abiertos en los que se insertan productos de PCR directamente, la mayoría no permite la clonación dirigida, requieren la compra de nuevas alícuotas y generalmente es necesaria la transferencia de la secuencia clonada a un segundo vector deseado. Ejemplos de estos vectores son pGEM T y pGEM®-T Easy de Promega, que usan como insertos fragmentos de ADN con residuos de desoxiadenosina 3' protuberantes y ligasas para la unión del inserto con el vector, o el pCR®II-TOPO de lnvitrogen, que emplea fragmentos de ADN con residuos de desoxiadenosina 3' protuberantes y topoisomerasas. Igualmente, "Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit" también usa topoisomerasas y permite la clonación de fragmentos de ADN con extremos romos de forma no dirigida, como por ejemplo usando los fragmentos obtenidos por PCR mediante polimerasas que no introducen residuos de desoxiadenosina en los extremos 3 ·. Otros vectores como el "Directional TOPO® Cloning permiten la clonación de fragmentos de ADN directamente de forma dirigida con topoisomerasas, y para ello requieren cebadores con secuencias específicas añadidas en sus extremos.

Una alternativa al ligamiento in vitro entre el inserto y el vector, es el ligamiento in vivo. Un ejemplo es el que ocurre en bacterias que sobreexpresen la ligasa de ADN del bacteriófago T4, en las que se introduce el vector y el inserto en forma lineal para que se produzca su ligamiento dentro de la célula. Los mayores problemas de este método son la baja estabilidad de los ADN lineales dentro de las bacterias, lo que lleva a su degradación parcial y a una disminución de la eficiencia del ligamiento, o a su degradación completa, lo que lleva al fracaso.

Los métodos de recombinación pueden emplear dos estrategias: la clonación in vitro mediante recombinasas (ejemplos: la tecnología Gateway® de lnvitrogen y la tecnología ln-Fusion™ y Creator™ PCR Cloning System

de Clontech) y la clonación in vivo, donde el inserto y el vector recombinan dentro de una célula por recombinación homóloga, que es muy eficiente en levaduras y recientemente también se consigue en Escherichia coli (E. coli) mediante "clonación RecET" y "clonación 'A Red". Estos métodos permiten 5 clonaciones dirigidas y evitan el empleo de enzimas de restricción y de ligasas, pero son complicados de entender y diseñar, y en ocasiones requieren el diseño y construcción de vectores de destino no comerciales; o requieren cepas especiales de bacterias, o la cotransfección con otro vector para introducir los elementos necesarios para que tenga lugar la 1 O recombinación. Además, puede haber baja eficiencia, inestabilidad de los vectores y toxicidad celular. Los métodos LIC se basan en la creación de extremos cohesivos, los más comunes contienen 12 residuos nucleotídicos, en el inserto y en el vector, 15 complementarios entre sí. Estos métodos permiten la clonación dirigida y son independientes de enzimas de restricción y de ligasas. La hibridación de los extremos cohesivos complementarios del inserto y del vector permiten su estabilización en forma circular formando una construcción génica tipo vector que al introducirla dentro de una célula es unida covalentemente por ligasas 20 intracelulares para la obtención del vector correspondiente. Sin embargo, la generación de estos extremos cohesivos es laboriosa y el almacenamiento de los productos que los contienen es problemático, ya que los extremos son susceptibles de degradación. Para la generación de los extremos cohesivos se emplean distintas estrategias: la T 4 ADN polimerasa (Aslanidis y 25 colaboradores (cols.) PCR Methods Appl. 1994 4 (3) :172-7) , la uracil ADN glicosilasa y polimerasas que no pueden amplificar desde residuos de ARN presentes en cebadores mixtos ADN-ARN. En el mercado hay vectores comerciales como por ejemplo "Affinity® LIC", 30 de Stratagene o el vector "Genscript pDream 2.1 ", pero son muy escasos. Si se requiere su preparación en el laboratorio, esta es generalmente más

complicada que la preparación de los insertos.

Por otra parte, existen varias metodologías para la introducción de mutaciones dirigidas o aleatorias en la secuencia de un fragmento de ADN lineal o clonado en un vector, o en la secuencia... [Seguir leyendo]

1. Un método de clonación dirigida o de clonación y mutagénesis dirigidas caracterizado porque comprende una primera etapa (a) : 5 a. diseñar una pareja de oligonucleótidos F (directo) y R (reverso) donde: i. las secuencias de los extremos 3´ (Ci) hibridan total o parcialmente con la secuencia a clonar o a clonar y mutar, 10 ii. las secuencias de los extremos 5´ (T) hibridan total o parcialmente con las secuencias de un vector V que flanquean el lugar donde se va a insertar el ADN a clonar o a clonar y mutar, y iii. el vector V es un vector bicatenario preferentemente 15 circular que comprende al menos un origen de replicación y preferentemente al menos un gen de selección. 2. El método según la reivindicación 1 caracterizado porque los 20 oligonucleótidos F y/o R comprenden una mutación M de tipo inserción entre la secuencia Ci y la secuencia T, donde M comprende al menos un nucleótido y no hibrida con la secuencia a clonar o a clonar y mutar, ni con el vector V. 25 3. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 caracterizado porque los oligonucleótidos F y/o R comprenden al menos una mutación M´ en Ci, donde la mutación puede ser una inserción, una sustitución o una deleción y no hibrida con la secuencia a clonar o a clonar y mutar, ni con el vector V. 30 4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque los oligonucleótidos F y/o R comprenden al menos una mutación M´´ en T, donde la mutación puede ser una inserción, una sustitución o una deleción y no hibrida con la secuencia a clonar o a clonar y mutar, ni con el vector V. 5 5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado porque después de la etapa (a) se lleva a cabo la siguiente etapa (b) : b. Amplificar mediante PCR la secuencia a clonar o a clonar y 10 mutar empleando los oligonucleótidos F y R diseñados en la etapa (a) . 6. El método según la reivindicación 5 caracterizado porque en la PCR se emplea una ADN polimerasa con actividad 3´-5´ exonucleasa. 15 7. El método según la reivindicación 6 caracterizado porque después de la etapa (b) se lleva a cabo la siguiente etapa (c) : c. Clonar la secuencia amplificada en la etapa (b) en el vector V mediante una PCR inversa de clonación (CiPCR) . 20 8. El método según la reivindicación 7 caracterizado porque después de la etapa (c) se lleva a cabo la siguiente etapa (d) : d. Digerir el producto de la etapa (c) con una ADN endonucleasa dependiente de metilación. 25 9. El método según la reivindicación 8 caracterizado porque la ADN endonucleasa dependiente de metilación es DpnI. 10. El método según la reivindicación 9 caracterizado porque después de 30 la etapa (d) se lleva a cabo la siguiente etapa (e) : e. Introducir los productos de la etapa (d) en una célula. 4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque los oligonucleótidos F y/o R comprenden al menos una mutación M´´ en T, donde la mutación puede ser una inserción, una sustitución o una deleción y no hibrida con la secuencia a clonar o a clonar y mutar, ni con el vector V. 5 5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado porque después de la etapa (a) se lleva a cabo la siguiente etapa (b) : b. Amplificar mediante PCR la secuencia a clonar o a clonar y 10 mutar empleando los oligonucleótidos F y R diseñados en la etapa (a) . 6. El método según la reivindicación 5 caracterizado porque en la PCR se emplea una ADN polimerasa con actividad 3´-5´ exonucleasa. 15 7. El método según la reivindicación 6 caracterizado porque después de la etapa (b) se lleva a cabo la siguiente etapa (c) : c. Clonar la secuencia amplificada en la etapa (b) en el vector V mediante una PCR inversa de clonación (CiPCR) . 20 8. El método según la reivindicación 7 caracterizado porque después de la etapa (c) se lleva a cabo la siguiente etapa (d) : d. Digerir el producto de la etapa (c) con una ADN endonucleasa dependiente de metilación. 25 9. El método según la reivindicación 8 caracterizado porque la ADN endonucleasa dependiente de metilación es DpnI. 10. El método según la reivindicación 9 caracterizado porque después de 30 la etapa (d) se lleva a cabo la siguiente etapa (e) : e. Introducir los productos de la etapa (d) en una célula. 4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque los oligonucleótidos F y/o R comprenden al menos una mutación M´´ en T, donde la mutación puede ser una inserción, una sustitución o una deleción y no hibrida con la secuencia a clonar o a clonar y mutar, ni con el vector V. 5 5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado porque después de la etapa (a) se lleva a cabo la siguiente etapa (b) : b. Amplificar mediante PCR la secuencia a clonar o a clonar y 10 mutar empleando los oligonucleótidos F y R diseñados en la etapa (a) . 6. El método según la reivindicación 5 caracterizado porque en la PCR se emplea una ADN polimerasa con actividad 3´-5´ exonucleasa. 15 7. El método según la reivindicación 6 caracterizado porque después de la etapa (b) se lleva a cabo la siguiente etapa (c) : c. Clonar la secuencia amplificada en la etapa (b) en el vector V mediante una PCR inversa de clonación (CiPCR) . 20 8. El método según la reivindicación 7 caracterizado porque después de la etapa (c) se lleva a cabo la siguiente etapa (d) : d. Digerir el producto de la etapa (c) con una ADN endonucleasa dependiente de metilación. 25 9. El método según la reivindicación 8 caracterizado porque la ADN endonucleasa dependiente de metilación es DpnI. 10. El método según la reivindicación 9 caracterizado porque después de 30 la etapa (d) se lleva a cabo la siguiente etapa (e) : e. Introducir los productos de la etapa (d) en una célula. 11. El método según la reivindicación 10 caracterizado porque la célula es una célula procariota. 12. El método según la reivindicación 11 caracterizado porque la célula 5 procariota es Escherichia coli. 13. El método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 caracterizado porque después de la etapa (e) se lleva a cabo la siguiente etapa (f) : 10 f. cultivar la célula de la etapa (e) . 14. El método según la reivindicación 13 caracterizado porque después de la etapa (f) se lleva a cabo la siguiente etapa (g) : g. extraer el vector V´ del cultivo de la etapa (f) . 15 15. El método según la reivindicación 14 caracterizado porque después de la etapa (g) se lleva a cabo la siguiente etapa (h) : h. comprobar la clonación o la clonación y mutación en el vector V´ extraído en la etapa (g) . 20 16. Un kit que comprende dos oligonucleótidos cebadores de reamplificación del producto obtenido de la etapa (b) según el método descrito en la reivindicación 6, uno directo y otro reverso, cuyas 25 secuencias hibridan con la secuencia del vector V. 17. El kit según la reivindicación 16 que además comprende un vector V. 18. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17 que además 30 comprende una ADN polimerasa. Escherichia coliEscherichia coli 19. El kit según la reivindicación 18 donde la ADN polimerasa tiene actividad 3´-5´ exonucleasa. 20. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19 que además comprende la ADN endonucleasa DpnI. 5 21. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20 que además comprende células apropiadas para la introducción de un vector. 22. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21 para la 10 clonación dirigida o para la clonación y mutagénesis dirigidas. LISTADO DE SECUENCIAS <110> Universidad de Santiago de Compostela <120> Nuevo método de clonación y mutagénesis in vitro mediante PCR inversa de clonación <130> ES1596.30bis <160> 12 <170> Patentin version 3.5 <210> 1 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cebador F para la clonación de EGFP en pcDNA3 <400> 1 ccaaccctga ggaaccaatc acaaccatgg tgagcaa <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cebador R para la clonación de EGFP en pcDNA3 <400> 2 caatggcaag aaaggcatta cttgtacagc tcgtccatgc <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cebador F para comprobar la clonación de EGFP <400> 3 ctgccgggct cccccaaccc tgaggaac <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cebador R para comprobar la clonación de EGFP <400> 4 ggccctctag agcacacaat ggcaag <210> <211> <212> <213> <220> 5 7072 DNA Artificial Sequence <223> Plásmido pcDNA3-SLC16A2 37 40 28 26