Nuevas sesquiterpeno sintasas aisladas de la piel de naranja.

Nuevas sesquiterpeno sintasas aisladas de la piel de naranja.

La presente invención se relaciona con un enzima natural sesquiterpeno sintasa de naranjo

(CsTPS3) con actividad δ-cadineno sintasa, así como con las variantes de dicha enzima modificadas por la substitución de al menos un aminoácido que altera su actividad catalítica, transformándolas preferentemente en enzimas con actividad elemol sintasa o germacreno D sintasa. Son asimismo objeto de la presente invención, el ácido nucleico que codifica el enzima natural CsTPS3 así como las versiones modificadas derivadas de éste, además de las construcciones génicas, vectores de expresión y cepas bacterianas que los comprenden.

La invención también se refiere al uso de estas enzimas para sintetizar sesquiterpenos, preferentemente δ-cadineno, elemol y germacreno D, y proporciona un método para la obtención de los mismos.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201331820.

Solicitante: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC).

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: TALON CUBILLO,MANUEL, RODRIGO ESTEVE,MARÍA JESÚS, RUIZ RIVERO,Omar José, CARRERA BERGUA,Esther, ZACARÍAS GARCÍA,Lorenzo Ángel.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/88 (Liasas (4.))

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Fragmento de la descripción:

NUEVAS SESQUITERPENO SINTAS~\S AISLADAS DE LA PIEL DE NARANJA

S Sector de la técnica

10 1S 20 La presente invención se relaciona con un enzima natural sesquiterpeno sintasa de naranjo (CsTPS3) con actividad B-cadineno sintasa. Además, la invención se relaciona con una molécula natural de ácido nucleico aislada de la piel de frutos de naranjo (Citrus sinensis) que codifica la sesquiterpeno sintasa natural CsTPS3, con moléculas de ácidos nucleicos modificadas in vilro que derivan de la secuencia natural Cstps3, con sus respectivos enzimas codificadas sesquiterpeno sintasas modificadas, con métodos para preparar sesquiterpeno sintasas, y con las células bacterianas hUésped que expresan los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la invención. La presente invención se relaciona también con métodos para sintetizar sesquiterpenos. Por ejemplo, las sesquiterpenos sintasas objeto de la invención pueden usarse para convertir el precursor famesil-pirofosfato (FPP) en varios sesquiterpenos bicíclicos qw~ incluyen o-cadineno, l3-cubebeno, a-copaeno, germacreno D, a-cadineno y cubebol, y el sesquiterpeno monocíclico elemol con una alta actividad repelente de mosquitos. Estado de la técnica anterior

2S 30 Los terpenoides (isoprenoides) son importantes productos naturales, de los cuales se han identificado más de 30, 000 compuestos en 131 reino vegetal. Entre ellos, los monoterpenos (C10) y sesquiterpenos (C15) son los principales constituyentes de los aceites esenciales de origen vegetal (Dewick, [2009] En Medicinó.1 Natural Products, John Wiley & Sons Ltd, Chichester-Wesl Sussex, pp 187-310; Fra¡¡a, [2006] Nat Prod Rep. 23, 943-972) . Los sesquiterpenos son usualmente compuestos volátiles que pueden actuar como moléculas señales para la atracción de polinizadores y dispersores de semillas, depredadores de herbívoros o repelentes de plagas, además de tener un papel importante en la comunicación enlre plantas (revisado por Gershenzon y Dudareva, [2007] Nat Chem Biol. 3, 408-414) .

35 Las terpeno sintasas (TPS) son los enzimas responsables para la formación de la gran diversidad de terpenos identificados en el reino vegetal (revisado por Chen y col., [2011] Plant J. 66, 212-219) . Las sesquiterpeno sinti3sas convierten el substrato farnesil-pirofosfato (FPP) en diversos sesquiterpenos que pueden tener diferentes estructuras químicas. La

mayoría de las TPS vegetales que se han caracterizado bioquímícamente son enzimas multicatalíticas y multiproducto con una alta promiscuidad y plasticidad de aminoácidos. Al parecer, varios aminoácidos localizados en el sitio activo y capas circundantes de las TPS multifuncionales actúan colectivamente para controlar la cascada en reacción que conduce a la formación de mezclas complejas de sesquiterpenos (Miller y Allemann, [2012] Nat Prod Rep. 29, 60-71) .

Aunque han sido muchos los monoterpenos y sesquiterpenos que se han identificado en varias especies del género Citrus (revisado por ladeo y col., [2008] Ad Bot Res 47, 147223) , pocos han sido los genes y enzimas monoterpeno y sesquiterpeno sintasas que se han aislado y caracterizado bioquímicamente. Con respecto a las sesquiterpeno sintasas, el gen Cstps1 de naranjo (Citrus sinensis) el cual codifica una valenceno sintasa (CVS) (Sharon-Asa y col., (2003) Plan/ J. 36, 664-676) , fue patentado por el Ministerio de Agricultura de Israel (WO 2005/021705, 10 de Marzo de 2005) . Hasta la fecha, se han patentado otras monoterpeno y sesquiterpeno sintasas vegetales tales como: la E-a.bisaboleno sintasa, &-selineno sintasa y y-humuleno sintasa del abeto gigante Abies grandis (US 6451576, Washington State University Research Foundation, 17 de Septiembre de 2002) ; y-curcumeno sintasa, (+) -germacreno A sintasa, (-) -germacreno D sintasas y pachoulol sintasas de pachouli (Pogos/emon cablin) (WO 2005/052163, Firmenich SA, 9 de June de 2005) ; sesquiterpeno sintasas multifuncional de Vetiveria zizanoides, que catalizan la formación de ciclocopacanfeno, (+) -epi-¡3-santaleno, trans-a-bergamoteno, cis-abergamoteno, p-bisaboleno y/o /rans-l"bisaboleno (WO 2006/134523, Firmenich SA, 21 de Diciembre de 2006) ; germacreno O sintasa multifuncional del fruto del kiwi (W02004/058814, The Horticulture and Food Research Institute 01 New Zea/and Limi/ed, 15 de Julio de 2004) ; santaleno sin tasa (SSy) de las especies Santalum album (SaSSy) , S. aus/rocaledonicum (SauSSy) y S. spica/um (SspiSSy) (WO 2011 /000026, 6 de Junio de 2011 , The University of Western Australia, Forest Products Commission, University of British Columbia, y Joerg Bohlmann) ; y valenceno sintasas modificadas (WO 2012/058636, Allylix INe, 3 de Mayo de 2012) .

La comercialización de los terpenos vegetales a nivel mundial alcanza los 20 billones de dólares anuales. La creciente demanda de terpenos de origen vegetal por la industria cosmética y perfumera, ha forzado la búsqueda de nuevas fuentes y la subsecuente aceptación de equivalentes sintéticos con menos olor y calidad. La síntesis química de terpenos (usando substancias pesadas) , resulta en mezclas altamente complejas (productos colaterales e isómeros) , los cuales requieren posteriormente de laboriosas y costosas

etapas de purificación. Hasta la fecha no existe ningún método de síntesis química de terpenos que sea respetuoso con el medio ambiente y que además sea notoriamente eficiente. Por el contrario, existen diversos ejemplos que muestras como la biotecnología puede ser una estrategia económica y fiable frente a la síntesis química o la destilación convencional a partir de materias primas de origen vegetal (revisado por Krings y Berger, [2010] Nat Prod Commun. 5, 1507-1522) . La tecnología del DNA recombínante y herramientas de biología molecular, la disponibilidad de base de datos de ácidos nucleicos y proteínas, así como el diseño de programas informáticos para el modelaje in si/ico y acoplamiento molecular de proteínas, han contribuido al rápido progreso de la biosíntesis de terpenos.

Además de su importancia biológica como señales químicas, los terpenos de orígen vegetal tienen un inmenso valor comercial debido a su uso como fragancias en cosmética y perfumería, como aditivos organolépticos de alimentos y bebidas o para adicionar fragancias deseables a productos de limpieza. El uso de fitoaceites esenciales, así como de sus componentes en forma aislada (principalmente monoterpenos y sesquiterpenos) , como repelentes de mosquitos transmisores de ciertas enfermedades tropicales infecciosas de alto riesgo, tales como: paludismo, dengue hemorrágico, fiebre amarilla, filariasis o fiebre del Nilo Occidental (West Ni/e Virus Infection: WNV) , les confiere además un gran interés médico y farmacéutico (revisado por Pohlit y col., [2011] Planta Medica 77, 598-617) . En septiembre de 2012, el mosquito doméstico del norte (Culex pipens) , causó 2.636 casos de infección del WNV en el este de los Estados Unidos de América, produciendo 118 defunciones. Del total de casos detectados, el 53% mostraron complicaciones neuroinvasivas (meningitis y encefalitis) (http://www.cdc.gov/ncidod/dvbid/westnile/index.htm) .

Los fitoaceites esenciales extraídos de citronela (Cymbopogon spp.) , eucalipto (Eucalyotus L'Hér. spp) , y albahaca (Ocimum spp) , se han utilizado tradicionalmente como repelentes de mosquitos en la fabricación de velas, lociones, geles, aspersores y toallas higiénicas. No obstate, la eficiacia de estos productos como repelentes de insectos es cuestionable. Recientemente, 70 fitoaceites esenciales utilizados en diferentes patentes de formulas repelentes de mosquitos han sido objeto de revisiones exhaustivas (Nerio y col., [2010] Bioresour Techonol. 101, 372-378: Pohlít y col., (2011) Planta Medica 77, 618-630) . En contraparte a los repelentes de insectos de origen vegetal,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un polipéptido caracterizado porque presenta actividad sesquiterpeno sintasa y su secuencia comprende al menos un 90% de identidad con SEO ID NO:14.

2. Un polipéptido según la reivindicación 1, donde la actividad sesquiterpeno sintasa es al menos una seleccionada del grupo que consiste en: actividad ó-cadineno sintasa, actividad elemol sintasa y actividad germacreno O sintasa.

3. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 Ó 2, en el que su secuencia comprende al menos un 90% de identidad con SEO ID NO:2, o con la SEO ID NO:2 modificada con al menos una susbstitución en un aminoácido que altera la actividad sesquiterpeno sintasa y/o especificidad de producto, y donde dicha susbtitución se selecciona entre al menos una del grupo compuesto por:

a. una substitución de la cisteina en posición 455 por glicina (C455G) , y

b. una triple substitución de la serina en posición 416 por treonina, de la glicina en posición 417 por treonina, y de la serina en posición 418 por tirosina (S416T/G417T IS418y) .

4. Un polipéptido según la reivindicación 3, donde la SEO ID NO:2 modificada comprende además otra substitución en un aminoácido de su secuencia, y que:

a. cuando la SEO ID NO:2 comprende la substitución C455G, es una substitución de la serina en posición 418 por histidina (S418H) , y

b. cuando la SEO ID NO:2 comprende la triple substitución S41&r/G417T/S418y , es una 25 substitución de la serina en posición 422 por alanina (S422A) .

5. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende una secuencia seleccionada del grupo compuesto por: SEO ID NO:2, SEO ID NO:16 y SEO ID NO:18.

6. Un polipéptido según la reivindicación 5, en el que:

a. cuando su secuencia comprende SEO ID NO:2, presenta actividad ó-cadineno sintasa,

b. cuando su secuencia comprende SEO ID NO: 16, presenta actividad ele mol sintasa, o

c. cuando su secuencia comprende SEQ ID NO:18, presenta actividad germacreno D sintasa.

7. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que es una sesquiterpeno sintasa seleccionada del grupo compuesto por: la o-cadineno sintasa CsTPS3 que consiste en SEO ID NO:2, la elemol sintasa CsTPS3-VB2 que consiste en SEO ID NO:4, la elemol sintasa CsTPS3-VB5 que consiste en SEO ID NO:6, la germacreno D

sintasa CsTPS3-VC1 que consiste en SEO ID NO:8 y la germacreno D sintasa CsTPS3-VC2 que consiste en SEO ID NO:10 .

8. Un ácido nucleico caracterizado porque comprende una secuencia que codifica un polipéptido definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Un ácido nucleico según la reivindicación 8, que cuando codifica un polipéptido comprendiendo SEO ID NO:2, consiste en un polinucleótido que comprende SEO ID NO:1.

10. Un ácido nucleico según la reivindicación 8 que, cuando codifica un polipéptido que

comprende la secuencia SEO ID NO:2 modificada, consiste en un polinucleótido que comprende la secuencia SEO ID NO:1 con al menos una mutación seleccionada del grupo compuesto por:

a. una transversión T -G en la posición +1363 con respecto al codón de inicio (ATG) de SEO ID NO:1: y

b. un grupo de sustituciones de los nucleótidos T_NG_NAGC_TAT en las posiciones +1246/1249/1252-1254 con respecto al codón de inicio (ATG) de SEO ID NO:1 .

11. Un ácido nucleico según la reivindicación 10 que consiste en un polinucleótido en el

que, adicionalmente a la mutación en el polinucleótido de secuencia SEO ID NO:1, 25 comprende además otra mutación en SEO ID NO:1 que se selecciona entre:

a. una transversión/transición AG-CA en las posiciones +1252/1253 con respecto al codón de inicio, cuando SEO ID NO:1 comprende la transversión T -G; Y

b. una transversión T _A en la posición + 1264 con respecto al codón de inicio de SEO

ID NO:1, cuando SEO ID NO:1 comprende el grupo de sustituciones 30 T_NG_NAGC_TAT.

12. Un ácido nucleico según la reivindicación 8 que comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en: SEO ID NO:1, SEO ID NO:3, SEO ID NO:5, SEO ID NO:? y SEO ID NO:9.

13. Una construcción génica caracterizada porque comprende al menos un ácido nucleico definido en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12.

14. Un vector de expresión caracterizado porque comprende una construcción génica 5 definida en la reivindicación 13.

15. Una cepa bacteriana caracterizada porque comprende un vector de expresión definido en la reivindicación 14.

16. Un método para obtener un polipéptido con actividad sesquiterpeno sin tasa, caracterizado porque comprende cultivar una célula bacteriana transformada con un ácido nucleico definido en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, o con un vector recombinante que lo comprende, en condiciones adecuadas para favorecer o inducir la expresión de dicho ácido nucleico.

17. Uso de al menos un polipéptido definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la sintesis sesquiterpenos.

18. Uso según la reivindicación 17 caracterizado porque dicha sintesis se lleva a cabo in vitro.

19. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18 caracterizado porque el sesquiterpeno sintetizado es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: a-cubebeno, a-copaeno, ¡3-cubebeno, ¡3-elemeno, a-gu~uneno, E-¡3-cariofileno, a-humuleno, germacreno D, bicidogermacreno, a-muuroleno, a-bulneseno, cubebol, i5-cadineno, elemol, germacreno 0-4-01,

bulnesol y guaiol, o una combinación cuaquiera de dos o más de los anteriores.

20. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 caracterizado porque el sesquiterpeno sintetizado es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: &-cadineno, elemol y germacreno D, o una combinación cuaquiera de dos o más de los anteriores.

21. Un procedimiento para sintetizar al menos un sesquiterpeno caracterizado porque comprende:

a. incubar el substrato farnesil-pirofosfato con al menos un polipéptido definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 35 b. dejar reaccionar hasta obtener un producto volátil que comprende el sesquiterpeno.