Nuevas retrotranscriptasas del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 grupo O.

La presente invención se refiere a retrotranscriptasas aisladas de un virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) de grupo O y modificadas en la posición 65 y/o en la posición 75, que presentan una elevada fidelidad de copia y termoestabilidad, así como a su uso para llevar a cabo la retrotranscripción, amplificación o secuenciación de un ácido nucleico molde. La invención se refiere, además, a un método para obtener dichas retrotranscriptasas. También se refiere a un método de retrotranscripción, a un método de amplificación, a un método de secuenciación utilizando las retrotranscriptasas de la presente invención y a un kit que comprende los elementos necesarios para llevar a cabo dichos métodos.

Nuevas retrotranscriptasas del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 grupo O

La presente invención se refiere a retrotranscriptasas aisladas de un virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) de grupo O y modificadas en las posiciones 65 y/o 75, que presentan una elevada fidelidad de copia y que mantienen una termoestabilidad elevada (similar a la de la retrotranscriptasa no mutada) , así como a su uso para llevar a cabo la retrotranscripción, amplificación o secuenciación de un ácido nucleico molde.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Los virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1 y VIH-2) son los agentes etiológicos del SIDA en el hombre. Pertenecen al género Lentivirus dentro de la familia Retroviridae (retrovirus) y se caracterizan por presentar una enorme diversidad genética. El VIH-1 se ha clasificado en cuatro grupos: M, N, O y P. Del grupo M se conocen al menos 10 subtipos A-K, además de múltiples recombinantes de dichos subtipos (Buonaguro et al. J Virol 2007; 81: 10209-10219) . El primer aislado del VIH-1 grupo O se obtuvo de pacientes infectados en 1987, y su secuencia de nucleótidos se publicó tres años más tarde (De Leys et al. J Virol 1990; 64: 1207-1216) . Actualmente, se puede obtener información sobre el genoma completo de variantes del VIH-1 grupo O en bases de datos de secuencias de nucleótidos como GenBank (por ejemplo, en esta base de datos la cepa MVP5180/91 tiene el número de acceso L20571) .

En los retrovirus, la retrotranscriptasa (RT) (o transcriptasa inversa) es la enzima responsable de la replicación del genoma viral. La RT convierte el ácido ribonucleico (ARN) genómico monocatenario en ácido desoxirribonucleico (ADN) bicatenario capaz de integrarse en el genoma de la célula hospedadora (Herschhorn y Hizi. Cell Mol Life Sci 2010; 67: 2717-2747) . Las RTs son ADN polimerasas capaces de utilizar como molde tanto ARN como ADN.

La RT del VIH-1 es un heterodímero constituido por dos subunidades, denominadas p66 y p51. En aislados del VIH1 de grupo M – subtipo B, se sabe que la subunidad p51 posee 440 aminoácidos mientras que la subunidad p66 tiene 560. Aunque p51 y p66 comparten idéntica estructura primaria en sus primeros 440 residuos, los distintos subdominios contenidos en sus secuencias respectivas se orientan de forma diferente en ambas subunidades. La subunidad p66 participa de forma importante en la formación del surco en el que interacciona el complejo moldecebador ya sea ARN/ADN o ADN/ADN, además del centro activo que interviene en la catálisis que conduce a la formación de enlaces fosfodiéster entre desoxirribonucleótidos 5´-trifosfato (dNTP) libres y el extremo 5´ de la cadena de ADN que está siendo sintetizada. Por el contrario, la subunidad p51 tiene una función principalmente estructural. Estudios realizados in vitro han demostrado que los homodímeros p66/p66 y los heterodímeros p66/p51 de la RT tienen actividad ADN polimerasa sobre complejos ARN/ADN y ADN/ADN, mientras que la p51 (monomérica u homodimérica) tiene muy poca o carece de dicha actividad (Herschhorn y Hizi. Cell Mol Life Sci 2010; 67: 27172747) .

Las subunidades p51 y p66 se generan a partir del procesamiento de la poliproteína Gag-Pol. Aunque no se conoce con exactitud cuáles son los intermediarios en el procesamiento de Gag-Pol que llevan a la formación del heterodímero funcional p66/p51, se sabe que in vitro, homodímeros p66/p66 pueden convertirse en heterodímeros p66/p51 por acción de la proteasa viral. Esta enzima realiza un corte endoproteolítico, entre los aminoácidos 440 y 441 de la p66 de la HIV-1 grupo M subtipo B, en una de las dos cadenas que forman el homodímero.

Las RTs son enzimas que carecen de actividad exonucleasa correctora de errores y por tanto, tienen una elevada tasa de error (alrededor de 10-4) , lo que explicaría en parte la enorme variabilidad genética observada en algunos retrovirus como el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) (Menéndez-Arias. Viruses 2009; 1: 11371165) . A pesar de ello, las RTs se utilizan de forma generalizada en tecnología de ADN recombinante, como por ejemplo para la síntesis de ADN copia a partir de ARN mensajero (ARNm) , como es el caso de la RT del virus Moloney de la leucemia de ratón (MLV) y la RT del virus de la mieloblastosis de aves (AMV) (Gerard et al. Nucleic Acids Res 2002; 30: 3118-3129; Yasukawa et al. J Biochem (Tokyo) 2008; 143: 261-268) .

En relación a RTs del VIH-1, se ha visto que en reacciones de síntesis de ADN complementario, la RT del VIH-1 de grupo M – subtipo B muestra una eficacia similar a la de las RTs de MLV o AMV a 37 y 42 ºC, pero retiene una actividad mayor a 50 ºC. Por otra parte, se ha demostrado que la RT “wild-type” (salvaje o WT) del VIH-1 de grupo O presenta una mayor termoestabilidad en comparación con la RT de MLV y con una RT “wild-type” del VIH-1 grupo M

– subtipo B (WO20101130864) .

Las RTs del VIH-1 grupo O se caracterizan por presentar alrededor de un 20% de aminoácidos distintos cuando se comparan con secuencias prototipo “wild-type” de subtipo B (Quiñones-Mateu et al. Virology 1997; 236: 364-373) . Además, las RTs del VIH-1 grupo O son resistentes naturales a nevirapina y otros inhibidores no análogos a nucleósido y presentan mayor estabilidad en presencia de urea que las RTs de subtipo B (Menéndez-Arias et al.J Biol Chem 2001; 276: 27470-27479) . Mutantes V75I y V75I/E478Q de la RT del VIH-1 grupo O proporcionan rendimientos más altos que los obtenidos con la RT “wild-type” del VIH-1 subtipo B en reacciones de amplificación por RT-PCR, cuando la retrotranscripción se lleva a cabo a 57 – 69 ºC (Álvarez et al. J Mol Biol 2009; 392: 872-884) . A pesar de su elevada termostabilidad, las RTs “wild-type” del VIH-1, tanto las del grupo M – subtipo B, como las del grupo O, son aproximadamente 7 a 15 veces menos fieles que las RTs del MLV y AMV, en ensayos genéticos basados en la síntesis de ADN utilizando como molde el gen lacZ presente en el fago M13mp2 (Roberts et al. Science 1988; 242: 1171-1173; Roberts et al. Mol Cell Biol 1989; 9: 469-476; Menéndez-Arias. Viruses 2009; 1: 1137-1165; patente WO20101130864) .

Se ha observado que algunos cambios de aminoácido pueden producir un incremento de fidelidad en algunas RTs, como por ejemplo las mutaciones K65A, K65R, V75I, D76V, R78A, V148I y Q151N, en el contexto de secuencia de la RT del VIH-1 de subtipo B (Menéndez-Arias. Viruses, 2009; 1: 1137-1165; Garforth et al. J Mol Biol 2010; 401: 3344) . Sin embargo, no es posible a priori conocer si la misma mutación ejerce el mismo efecto en una variante del VIH-1 filogenéticamente alejada del subtipo B como es el caso de las variantes de grupo O. De hecho, el mismo cambio puede tener efectos distintos según el contexto de secuencia. Por ejemplo, la sustitución E89G en la RT del VIH-1 del grupo M - subtipo B produce un aumento de fidelidad en ensayos de incorporación errónea y en ensayos de extensión de extremos desapareados (Drosopoulos y Prasad. J Virol 1996; 70: 4834-4838; Hamburgh et al. Nucleic Acids Res 1998; 26: 4389-4394; Rubinek et al. Eur J Biochem 1997; 247: 238-247) . Sin embargo, en el contexto de secuencia de la RT del VIH-2, E89G tiene un efecto mínimo sobre la fidelidad de copia, medida con el mismo tipo de ensayos (Taube et al. Eur J Biochem 1997; 250: 106-114) . Otro ejemplo es la mutación L74V, que en la RT del VIH-1 del grupo M subtipo B produce un aumento de fidelidad medida en ensayos de incorporación errónea y en ensayos de extensión de extremos desapareados (Rubinek et al. Eur J Biochem 1997; 247: 238-247) , aunque estos efectos no se observaron cuando la mutación se introdujo en la RT del VIH-2 (Taube et al. Eur J Biochem 1997; 250: 106-114) .

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

El problema técnico que resuelve la invención es el de proporcionar retrotranscriptasas (RTs) de retrovirus con mayor fidelidad de copia y por lo tanto menor tasa de error y que además sean estables a temperaturas elevadas, mayores de 54 ºC.

La presente invención se refiere a RTs aisladas de un virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) de grupo O y modificadas en una o en más posiciones, que presentan una elevada fidelidad de copia y termoestabilidad, así como a su uso para llevar a cabo la retrotranscripción, amplificación o secuenciación de un ácido nucleico molde.

Con el fin de obtener nuevas RTs modificadas del VIH-1 de grupo O se han generado mutantes de una RT aislada de un VIH-1 de grupo O (RT del VIH-1 de grupo O) cuya subunidad... [Seguir leyendo]

1. Retrotranscriptasa aislada de un virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 de grupo O y modificada para que comprenda una secuencia de aminoácidos en la que el residuo que corresponde a la posición 65 de la SEQ ID NO: 1 está sustituido por una arginina o por otro aminoácido que suponga una sustitución conservativa respecto a la arginina.

2. Retrotranscriptasa según la reivindicación 1, donde la secuencia de aminoácidos presenta una identidad de, al menos, un 70% con la SEQ ID NO: 1.

3. Retrotranscriptasa según la reivindicación 2, donde la secuencia de aminoácidos presenta una identidad de, al menos, un 80% con la SEQ ID NO: 1.

4. Retrotranscriptasa según la reivindicación 3, donde la secuencia de aminoácidos presenta una identidad de, al menos, un 90% con la SEQ ID NO: 1.

5. Retrotranscriptasa según las reivindicaciones 1 a 4, donde la secuencia de aminoácidos es la SEQ ID NO: 2.

6. Retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la secuencia de aminoácidos además tiene otra sustitución del residuo que corresponde a la posición 75 de la SEQ ID NO: 1 por una isoleucina o por otro aminoácido que suponga una sustitución conservativa respecto a la isoleucina.

7. Retrotranscriptasa según la reivindicación 6, donde la secuencia de aminoácidos es la SEQ ID NO: 3.

8. Polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de una retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Vector que comprende el polinucleótido según la reivindicación 8.

10. Vector según la reivindicación 9, donde el polinucleótido está unido operativamente a, al menos, una secuencia de control de la lista que comprende: a) un promotor, b) una señal de inicio de la transcripción, c) una señal de terminación de la transcripción,

d) una señal de poliadenilación, o e) un activador transcripcional.

11. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10 donde el polinucleótido está unido en fase de lectura a una secuencia que codifica para una etiqueta de purificación.

12. Vector según la reivindicación 11 donde la etiqueta de purificación consiste en una cola de residuos de histidina.

13. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, que además comprende un polinucleótido que codifica para una proteasa capaz de realizar un corte endoproteolítico en la secuencia de aminoácidos de una retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 entre, o alrededor de, los residuos que corresponden a las posiciones 440 y 441 de la SEQ ID NO: 1.

14. Célula que comprende un vector según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.

15. Célula según la reivindicación 14, que además comprende otro vector que comprende un polinucleótido que codifica para una proteasa capaz realizar un corte endoproteolítico en la secuencia de aminoácidos de la retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 entre o alrededor de los residuos que corresponden a las posiciones 440 y 441 de la SEQ ID NO: 1.

16. Célula que comprende el vector según la reivindicación 13.

17. Método para producir la secuencia de aminoácidos de una retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende:

a) cultivar la célula según cualquiera de las reivindicaciones 14, 15 ó 16, y b) aislar la secuencia de aminoácidos de la retrotranscriptasa expresada en el paso (a) por dicha célula.

18. Método para producir la retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende: a) cultivar la célula según cualquiera de las reivindicaciones 14, 15 ó 16, y b) aislar la retrotranscriptasa expresada en el paso (a) por dicha célula.

19. Uso de la retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la retrotranscripción de un ácido nucleico molde.

20. Uso de la retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la amplificación de un ácido nucleico molde.

21. Uso de la retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la secuenciación de un ácido nucleico molde.

22. Uso de la retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 donde el ácido nucleico molde es ARNm.

23. Método de retrotranscripción de un ácido nucleico molde que comprende:

a) mezclar dicho ácido nucleico molde con la retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, e b) incubar la mezcla del paso (a) en condiciones que permitan la síntesis de ADN complementario al ácido nucleico molde.

24. Método de amplificación de un ácido nucleico molde que comprende:

a) mezclar dicho ácido nucleico con la retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y con, al menos, una ADN polimerasa dependiente de ADN, e b) incubar la mezcla del paso (a) en condiciones que permitan la amplificación de ADN complementario al ácido nucleico molde.

25. Método de secuenciación de un ácido nucleico molde que comprende:

a) poner en contacto dicho ácido nucleico con la retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, b) incubar dicha mezcla en condiciones que permitan la síntesis de una población de moléculas de ADN complementario al ácido nucleico molde, y c) separar dicha población de moléculas de ADN complementario para determinar la secuencia de nucleótidos.

26. Método según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 donde el ácido nucleico molde es ARNm.

27. Kit que comprende: a) la retrotranscriptasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y b) al menos, un elemento de la lista que comprende:

i) un tampón, ii) un cebador, iii) una ADN polimerasa dependiente de ADN, y iv) un nucleótido.

28. Uso de un kit según la reivindicación 27, para la retrotranscripción, la amplificación o la secuenciación de un ácido nucleico molde.

29. Uso de un kit según la reivindicación 28 donde el ácido nucleico es ARN mensajero.

FIG. 1 FIG. 2 FIG. 3 A

FIG 3 B FIG. 4

<110> Consejo Superior de Investigaciones Cientificas <120> Nuevas retrotranscriptasas del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 grupo 0

<130> ES.1641.843

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 560

<212> PRT

<213> Virus de la Inmunodeficiencia Humana Tipo 1 CVIH-1) de Grupo 0

<400> 1

Pro Ile Ser Pro Ile Ala Pro Val Pro Val Lys Leu Lys Pro Gly Met 1 5 10 15

Asp Gly Pro Lys Val Lys Gln Trp Pro Leu Ser Lys Glu Lys Ile Glu 20 25 30

Ala Leu Thr Ala Ile Cys Gln Glu Met Glu Gln Glu Gly Lys Ile Ser 35 40 45

Arg Ile Gly Pro Glu Asn Pro Tyr Asn Thr Pro Ile Phe Ala Ile Lys 50 55 60

Lys Lys Asp Ser Thr Lys Trp Arg Lys Leu Val Asp Phe Arg Glu Leu 65 70 75 80

Asn Lys Arg Thr Gln Asp Phe Trp Glu Val Gln Leu Gly Ile Pro His 85 90 95

Pro Gly Gly Leu Lys Gln Lys Arg Ser Val Thr Val Leu Asp Val Gly 100 105 110

Asp Ala Tyr Phe Ser Cys Pro Leu Asp Pro Asp Phe Arg Lys Tyr Thr 115 120 125

Ala Phe Thr Ile Pro Ser Val Asn Asn Glu Thr Pro Gly Ile Arg Tyr 130 135 140

Gln Tyr Asn Val Leu Pro Gln Gly Trp Lys Gly Ser Pro Ala Ile Phe 145 150 155 160

Gln Ser Ser Met Thr Lys Ile Leu Asp Pro Phe Arg Lys Asp Asn Pro 165 170 175

Glu Leu Glu Ile Cys Gln Tyr Met Asp Asp Leu Tyr Val Gly Ser Asp 180 185 190

Leu Tyr Gln Trp Gly Phe Thr Thr Pro Asp Lys Lys His Gln Lys Glu 210 215 220

Pro Pro Phe Met Trp Met Gly Tyr Glu Leu His Pro Asp Lys Trp Thr 225 230 235 240

Val Gln Pro Ile Lys Leu Pro Asn Lys Asp Val Trp Thr Val Asn Asp 245 250 255

Ile Gln Lys Leu Ile Gly Lys Leu Asn Trp Ala Ser Gln Ile Tyr Gln 260 265 270

Gly Ile Arg Val Arg Glu Leu Cys Lys Leu Ile Arg Gly Thr Lys Ser 275 280 285

Leu Thr Glu Val Val Pro Leu Ser Lys Glu Ala Glu Met Glu Leu Glu 290 295 300

Glu Asn Arg Glu Lys Leu Lys Glu Pro Met His Gly Val Tyr Tyr Gln 305 310 315 320

Pro Asp Lys Asp Leu Trp Val Asn Ile Gln Lys Gln Gly Glu Gly Gln 325 330 335

Trp Thr Tyr Gln Ile Tyr Gln Asp Glu His Lys Asn Leu Lys Thr Gly 340 345 350

Lys Tyr Thr Arg Gln Lys Ala Ser His Thr Asn Asp Ile Arg Gln Leu 355 360 365

Ala Glu Val Ile Gln Lys Val Ser Gln Glu Ser Ile Val Ile Trp Gly 370 375 380

Lys Leu Pro Lys Phe Lys Leu Pro Val Thr Arg Glu Thr Trp Glu Thr 385 390 395 400

Trp Trp Ala Asp Tyr Trp Gln Ala Thr Trp Ile Pro Glu Trp Asp Tyr 405 410 415

Val Ser Thr Pro Pro Leu Ile Lys Leu Trp Tyr Arg Leu Glu Ser Glu 420 425 430

Pro Ile Arg Gly Ala Glu Thr Tyr Tyr Val Asp Gly Ala Ala Asn Arg 435 440 445

Asp Thr Lys Leu Gly Lys Ala Gly Tyr Val Thr Glu Gln Gly Lys Gln 450 455 460

Ala Val Leu Leu Ala Leu Gln Asp Ser Lys Glu Lys Val Asn Ile Val 485 490 495

Thr Asp Ser Gln Tyr Val Leu Gly Ile Ile Ser Ser Gln Pro Thr Gln 500 505 510

Ser Glu Ser Pro Ile Val Gln Gln Ile Ile Glu Glu Leu Thr Lys Lys 515 520 525

Glu Gln Val Tyr Leu Thr Trp Val Pro Ala His Lys Gly Ile Gly Gly 530 535 540

Asn Glu Lys Ile Asp Lys Leu Val Ser Lys Asp Ile Arg Arg Val Leu 545 550 555 560

<210> 2

<211> 560

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de aminoacidos de la subunidad p66 de la RT del VIH-1 de grupo 0 modificada con la mutacion K65R

<400> 2

Pro Ile Ser Pro Ile Ala Pro Val Pro Val Lys Leu Lys Pro Gly Met 1 5 10 15

Asp Gly Pro Lys Val Lys Gln Trp Pro Leu Ser Lys Glu Lys Ile Glu 20 25 30

Ala Leu Thr Ala Ile Cys Gln Glu Met Glu Gln Glu Gly Lys Ile Ser 35 40 45

Arg Ile Gly Pro Glu Asn Pro Tyr Asn Thr Pro Ile Phe Ala Ile Lys 50 55 60

Arg Lys Asp Ser Thr Lys Trp Arg Lys Leu Val Asp Phe Arg Glu Leu 65 70 75 80

Asn Lys Arg Thr Gln Asp Phe Trp Glu Val Gln Leu Gly Ile Pro His 85 90 95

Pro Gly Gly Leu Lys Gln Lys Arg Ser Val Thr Val Leu Asp Val Gly 100 105 110

Asp Ala Tyr Phe Ser Cys Pro Leu Asp Pro Asp Phe Arg Lys Tyr Thr 115 120 125

Ala Phe Thr Ile Pro Ser Val Asn Asn Glu Thr Pro Gly Ile Arg Tyr 3

130 135 140

Gln Tyr Asn Val Leu Pro Gln Gly Trp Lys Gly Ser Pro Ala Ile Phe 145 150 155 160

Gln Ser Ser Met Thr Lys Ile Leu Asp Pro Phe Arg Lys Asp Asn Pro 165 170 175

Glu Leu Glu Ile Cys Gln Tyr Met Asp Asp Leu Tyr Val Gly Ser Asp 180 185 190

Leu Pro Leu Ala Glu His Arg Lys Arg Val Glu Leu Leu Arg Glu His 195 200 205

Leu Tyr Gln Trp Gly Phe Thr Thr Pro Asp Lys Lys His Gln Lys Glu 210 215 220

Pro Pro Phe Met Trp Met Gly Tyr Glu Leu His Pro Asp Lys Trp Thr 225 230 235 240

Val Gln Pro Ile Lys Leu Pro Asn Lys Asp Val Trp Thr Val Asn Asp 245 250 255

Ile Gln Lys Leu Ile Gly Lys Leu Asn Trp Ala Ser Gln Ile Tyr Gln 260 265 270

Gly Ile Arg Val Arg Glu Leu Cys Lys Leu Ile Arg Gly Thr Lys Ser 275 280 285

Leu Thr Glu Val Val Pro Leu Ser Lys Glu Ala Glu Met Glu Leu Glu 290 295 300

Glu Asn Arg Glu Lys Leu Lys Glu Pro Met His Gly Val Tyr Tyr Gln 305 310 315 320

Pro Asp Lys Asp Leu Trp Val Asn Ile Gln Lys Gln Gly Glu Gly Gln 325 330 335

Trp Thr Tyr Gln Ile Tyr Gln Asp Glu His Lys Asn Leu Lys Thr Gly 340 345 350

Lys Tyr Thr Arg Gln Lys Ala Ser His Thr Asn Asp Ile Arg Gln Leu 355 360 365

Ala Glu Val Ile Gln Lys Val Ser Gln Glu Ser Ile Val Ile Trp Gly 370 375 380

Lys Leu Pro Lys Phe Lys Leu Pro Val Thr Arg Glu Thr Trp Glu Thr 385 390 395 400

Trp Trp Ala Asp Tyr Trp Gln Ala Thr Trp Ile Pro Glu Trp Asp Tyr 4

405 410 415

Val Ser Thr Pro Pro Leu Ile Lys Leu Trp Tyr Arg Leu Glu Ser Glu 420 425 430

Pro Ile Arg Gly Ala Glu Thr Tyr Tyr Val Asp Gly Ala Ala Asn Arg 435 440 445

Asp Thr Lys Leu Gly Lys Ala Gly Tyr Val Thr Glu Gln Gly Lys Gln 450 455 460

Lys Ile Ile Lys Leu Asp Glu Thr Thr Asn Gln Lys Ala Glu Leu Met 465 470 475 480

Ala Val Leu Leu Ala Leu Gln Asp Ser Lys Glu Lys Val Asn Ile Val 485 490 495

Thr Asp Ser Gln Tyr Val Leu Gly Ile Ile Ser Ser Gln Pro Thr Gln 500 505 510

Ser Glu Ser Pro Ile Val Gln Gln Ile Ile Glu Glu Leu Thr Lys Lys 515 520 525

Glu Gln Val Tyr Leu Thr Trp Val Pro Ala His Lys Gly Ile Gly Gly 530 535 540

Asn Glu Lys Ile Asp Lys Leu Val Ser Lys Asp Ile Arg Arg Val Leu 545 550 555 560

<210> 3

<211> 560

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de aminoacidos de la subunidad p66 de la RT del VIH-1 de grupo 0 modificada con las mutaciones K65R y V75I

<400> 3

Pro Ile Ser Pro Ile Ala Pro Val Pro Val Lys Leu Lys Pro Gly Met 1 5 10 15

Asp Gly Pro Lys Val Lys Gln Trp Pro Leu Ser Lys Glu Lys Ile Glu 20 25 30

Ala Leu Thr Ala Ile Cys Gln Glu Met Glu Gln Glu Gly Lys Ile Ser 35 40 45

Arg Ile Gly Pro Glu Asn Pro Tyr Asn Thr Pro Ile Phe Ala Ile Lys 50 55 60

Arg Lys Asp Ser Thr Lys Trp Arg Lys Leu Ile Asp Phe Arg Glu Leu 65 70 75 80

Asn Lys Arg Thr Gln Asp Phe Trp Glu Val Gln Leu Gly Ile Pro His 85 90 95

Pro Gly Gly Leu Lys Gln Lys Arg Ser Val Thr Val Leu Asp Val Gly 100 105 110

Asp Ala Tyr Phe Ser Cys Pro Leu Asp Pro Asp Phe Arg Lys Tyr Thr 115 120 125

Ala Phe Thr Ile Pro Ser Val Asn Asn Glu Thr Pro Gly Ile Arg Tyr 130 135 140

Gln Tyr Asn Val Leu Pro Gln Gly Trp Lys Gly Ser Pro Ala Ile Phe 145 150 155 160

Gln Ser Ser Met Thr Lys Ile Leu Asp Pro Phe Arg Lys Asp Asn Pro 165 170 175

Glu Leu Glu Ile Cys Gln Tyr Met Asp Asp Leu Tyr Val Gly Ser Asp 180 185 190

Leu Pro Leu Ala Glu His Arg Lys Arg Val Glu Leu Leu Arg Glu His 195 200 205

Leu Tyr Gln Trp Gly Phe Thr Thr Pro Asp Lys Lys His Gln Lys Glu 210 215 220

Pro Pro Phe Met Trp Met Gly Tyr Glu Leu His Pro Asp Lys Trp Thr 225 230 235 240

Val Gln Pro Ile Lys Leu Pro Asn Lys Asp Val Trp Thr Val Asn Asp 245 250 255

Ile Gln Lys Leu Ile Gly Lys Leu Asn Trp Ala Ser Gln Ile Tyr Gln 260 265 270

Gly Ile Arg Val Arg Glu Leu Cys Lys Leu Ile Arg Gly Thr Lys Ser 275 280 285

Leu Thr Glu Val Val Pro Leu Ser Lys Glu Ala Glu Met Glu Leu Glu 290 295 300

Glu Asn Arg Glu Lys Leu Lys Glu Pro Met His Gly Val Tyr Tyr Gln 305 310 315 320

Pro Asp Lys Asp Leu Trp Val Asn Ile Gln Lys Gln Gly Glu Gly Gln 325 330 335

Trp Thr Tyr Gln Ile Tyr Gln Asp Glu His Lys Asn Leu Lys Thr Gly 340 345 350 6

Lys Tyr Thr Arg Gln Lys Ala Ser His Thr Asn Asp Ile Arg Gln Leu 355 360 365

Ala Glu Val Ile Gln Lys Val Ser Gln Glu Ser Ile Val Ile Trp Gly 370 375 380

Lys Leu Pro Lys Phe Lys Leu Pro Val Thr Arg Glu Thr Trp Glu Thr 385 390 395 400

Trp Trp Ala Asp Tyr Trp Gln Ala Thr Trp Ile Pro Glu Trp Asp Tyr 405 410 415

Val Ser Thr Pro Pro Leu Ile Lys Leu Trp Tyr Arg Leu Glu Ser Glu 420 425 430

Pro Ile Arg Gly Ala Glu Thr Tyr Tyr Val Asp Gly Ala Ala Asn Arg 435 440 445

Asp Thr Lys Leu Gly Lys Ala Gly Tyr Val Thr Glu Gln Gly Lys Gln 450 455 460

Lys Ile Ile Lys Leu Asp Glu Thr Thr Asn Gln Lys Ala Glu Leu Met 465 470 475 480

Ala Val Leu Leu Ala Leu Gln Asp Ser Lys Glu Lys Val Asn Ile Val 485 490 495

Thr Asp Ser Gln Tyr Val Leu Gly Ile Ile Ser Ser Gln Pro Thr Gln 500 505 510

Ser Glu Ser Pro Ile Val Gln Gln Ile Ile Glu Glu Leu Thr Lys Lys 515 520 525

Glu Gln Val Tyr Leu Thr Trp Val Pro Ala His Lys Gly Ile Gly Gly 530 535 540

Asn Glu Lys Ile Asp Lys Leu Val Ser Lys Asp Ile Arg Arg Val Leu 545 550 555 560

<210> 4

<211> 99

<212> PRT

<213> Virus de la Inmunodeficiencia Humana Tipo 1 CVIH-1) de Grupo M Suptipo B

<400> 4

Pro Gln Ile Thr Leu Trp Gln Arg Pro Leu Val Thr Ile Lys Ile Gly 1 5 10 15

Gly Gln Leu Lys Glu Ala Leu Leu Asp Thr Gly Ala Asp Asp Thr Val 20 25 30

Gly Ile Gly Gly Phe Ile Lys Val Arg Gln Tyr Asp Gln Ile Leu Ile 50 55 60

Glu Ile Cys Gly His Lys Ala Ile Gly Thr Val Leu Val Gly Pro Thr 65 70 75 80

Pro Val Asn Ile Ile Gly Arg Asn Leu Leu Thr Gln Ile Gly Cys Thr 85 90 95

Leu Asn Phe <210> 5

<211> 1720

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de nucleotidos del inserto portador de la region codificante de p66 de la RT del VIH-1 de Grupo 0 con una cola de 6 histidinas, flanqueada por un sitio de restriccion EcoRI en el extremo 5' y codones de terminacion en el extremo 3'

<400> 5 gaattctcct ataagcccca tagccccagt gccagtaaag ctaaaaccag gaatggatgg 60 accaaaagta aaacaatggc ccctatctaa agaaaaaata gaagccttaa cagcaatatg 120 ccaggaaatg gaacaagaag gaaaaatttc aagaatagga cctgaaaatc cttataatac 180 acctatcttt gctataaaaa agaaagatag tactaagtgg agaaagctgg tagactttag 240 ggaattaaac aagagaacac aagatttttg ggaggtacag ttaggtatcc cacatccggg 300 gggtttaaag caaaagcgat ctgttacagt cttagatgta ggagatgcct atttctcatg 360 ccccttagac ccagatttta gaaaatatac tgctttcact attcctagtg taaacaatga 420 gaccccagga ataagatacc agtacaatgt cctcccgcaa ggatggaaag gttcgccagc 480 catattccaa agttcaatga caaaaatttt agatccattt aggaaagaca acccagaatt 540 agaaatttgt cagtacatgg atgacctata tgtaggatca gatttacccc tggcagaaca 600 tagaaaaagg gttgaattgc ttagagaaca cttatatcag tggggattca ctacccctga 660 taaaaagcat caaaaggaac ctccctttat gtggatgggg tatgagctcc atccagataa 720 atggacagta cagcccatca aattgcctaa caaagatgtg tggacagtaa atgatataca 780 aaaactaata ggaaagttaa attgggcaag tcaaatctat caaggaatta gagtaagaga 840 attgtgtaag ttaattagag gcaccaagtc attaacagaa gtagtaccat taagcaaaga 900 ggcagagatg gaattagagg agaacagaga gaaattaaaa gaaccaatgc atggtgtata 960 ctatcaacct gataaagact tatgggttaa tattcagaag caaggagaag ggcaatggac 1020 ttaccagata tatcaggatg aacataagaa cctcaaaaca gggaaatata ctaggcaaaa 1080 8

ggcctcccac acaaatgaca taagacaatt agcagaagta atccagaagg tgtctcaaga 1140

atctatagtt atctggggaa aattgcctaa atttaagctg ccagtcacta gagaaacttg 1200

ggaaacatgg tgggcagatt attggcaagc cacctggatc ccagaatggg attatgtcag 1260

cacaccccca ttgatcaaat tatggtaccg gttagaaagt gaacctatta ggggggcaga 1320

aacctattat gtagatggag cagctaatag agatacaaaa ttaggaaaag caggatatgt 1380

tacagaacaa gggaaacaga aaataataaa attagatgag accaccaatc aaaaggctga 1440

attaatggca gtattattag ccttacagga ttccaaagaa aaagtaaata tagtaacaga 1500

ctcacaatat gtattgggca ttatctcctc ccagcctaca cagagtgaat cccctatagt 1560

tcagcagata atagaggaac taacaaaaaa ggaacaggtg tatcttacat gggttcctgc 1620

tcataaaggc ataggaggaa atgaaaaaat agataaatta gtaagcaagg atattagaag 1680

agtcctcgag tcgactcacc accaccacca ccactgataa 1720

<210> 6

<211> 572

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de aminoacidos de la subunidad p66 de la RT del VIH-1 de Grupo 0 con modificaciones en los extremos N- y C-terminales que incluyen una cola de seis residuos de histidina <400> 6

Met Asn Ser Pro Ile Ser Pro Ile Ala Pro Val Pro Val Lys Leu Lys 1 5 10 15

Pro Gly Met Asp Gly Pro Lys Val Lys Gln Trp Pro Leu Ser Lys Glu 20 25 30

Lys Ile Glu Ala Leu Thr Ala Ile Cys Gln Glu Met Glu Gln Glu Gly 35 40 45

Lys Ile Ser Arg Ile Gly Pro Glu Asn Pro Tyr Asn Thr Pro Ile Phe 50 55 60

Ala Ile Lys Lys Lys Asp Ser Thr Lys Trp Arg Lys Leu Val Asp Phe 65 70 75 80

Arg Glu Leu Asn Lys Arg Thr Gln Asp Phe Trp Glu Val Gln Leu Gly 85 90 95

Ile Pro His Pro Gly Gly Leu Lys Gln Lys Arg Ser Val Thr Val Leu 100 105 110

Asp Val Gly Asp Ala Tyr Phe Ser Cys Pro Leu Asp Pro Asp Phe Arg 115 120 125

Ile Arg Tyr Gln Tyr Asn Val Leu Pro Gln Gly Trp Lys Gly Ser Pro 145 150 155 160

Ala Ile Phe Gln Ser Ser Met Thr Lys Ile Leu Asp Pro Phe Arg Lys 165 170 175

Asp Asn Pro Glu Leu Glu Ile Cys Gln Tyr Met Asp Asp Leu Tyr Val 180 185 190

Gly Ser Asp Leu Pro Leu Ala Glu His Arg Lys Arg Val Glu Leu Leu 195 200 205

Arg Glu His Leu Tyr Gln Trp Gly Phe Thr Thr Pro Asp Lys Lys His 210 215 220

Gln Lys Glu Pro Pro Phe Met Trp Met Gly Tyr Glu Leu His Pro Asp 225 230 235 240

Lys Trp Thr Val Gln Pro Ile Lys Leu Pro Asn Lys Asp Val Trp Thr 245 250 255

Val Asn Asp Ile Gln Lys Leu Ile Gly Lys Leu Asn Trp Ala Ser Gln 260 265 270

Ile Tyr Gln Gly Ile Arg Val Arg Glu Leu Cys Lys Leu Ile Arg Gly 275 280 285

Thr Lys Ser Leu Thr Glu Val Val Pro Leu Ser Lys Glu Ala Glu Met 290 295 300

Glu Leu Glu Glu Asn Arg Glu Lys Leu Lys Glu Pro Met His Gly Val 305 310 315 320

Tyr Tyr Gln Pro Asp Lys Asp Leu Trp Val Asn Ile Gln Lys Gln Gly 325 330 335

Glu Gly Gln Trp Thr Tyr Gln Ile Tyr Gln Asp Glu His Lys Asn Leu 340 345 350

Lys Thr Gly Lys Tyr Thr Arg Gln Lys Ala Ser His Thr Asn Asp Ile 355 360 365

Arg Gln Leu Ala Glu Val Ile Gln Lys Val Ser Gln Glu Ser Ile Val 370 375 380

Ile Trp Gly Lys Leu Pro Lys Phe Lys Leu Pro Val Thr Arg Glu Thr 385 390 395 400

Trp Asp Tyr Val Ser Thr Pro Pro Leu Ile Lys Leu Trp Tyr Arg Leu 420 425 430

Glu Ser Glu Pro Ile Arg Gly Ala Glu Thr Tyr Tyr Val Asp Gly Ala 435 440 445

Ala Asn Arg Asp Thr Lys Leu Gly Lys Ala Gly Tyr Val Thr Glu Gln 450 455 460

Gly Lys Gln Lys Ile Ile Lys Leu Asp Glu Thr Thr Asn Gln Lys Ala 465 470 475 480

Glu Leu Met Ala Val Leu Leu Ala Leu Gln Asp Ser Lys Glu Lys Val 485 490 495

Asn Ile Val Thr Asp Ser Gln Tyr Val Leu Gly Ile Ile Ser Ser Gln 500 505 510

Pro Thr Gln Ser Glu Ser Pro Ile Val Gln Gln Ile Ile Glu Glu Leu 515 520 525

Thr Lys Lys Glu Gln Val Tyr Leu Thr Trp Val Pro Ala His Lys Gly 530 535 540

Ile Gly Gly Asn Glu Lys Ile Asp Lys Leu Val Ser Lys Asp Ile Arg 545 550 555 560

Arg Val Leu Glu Ser Thr His His His His His His 565 570

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> 0ligonucleotido mutagºnicoº cebador ºsentidoº empleado para introducir la mutacion K65R en la subunidad p66 de la RT del VIH-1 de Grupo 0

<400> 7 ctttgctata aaaaggaaag atagtactaa gtgg 34

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> 0ligonucleotido mutagºnicoº cebador ºantisentidoº empleado para introducir la mutacion K65R en la subunidad p66 de la RT del VIH-1 de Grupo 0

<400> 8 ccacttagta ctatctttcc tttttatagc aaag 34

<210> 9

<211> 1720

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de nucleotidos del inserto portador de la region codificante de la subunidad p66 de la RT del VIH-1 de Grupo 0 modificada mediante la mutacion K65R, y nucleotidos adicionales que codifican para aminoacidos en sus extremos N- y C-terminales.

<400> 9 gaattctcct ataagcccca tagccccagt gccagtaaag ctaaaaccag gaatggatgg 60 accaaaagta aaacaatggc ccctatctaa agaaaaaata gaagccttaa cagcaatatg 120 ccaggaaatg gaacaagaag gaaaaatttc aagaatagga cctgaaaatc cttataatac 180 acctatcttt gctataaaaa ggaaagatag tactaagtgg agaaagctgg tagactttag 240 ggaattaaac aagagaacac aagatttttg ggaggtacag ttaggtatcc cacatccggg 300 gggtttaaag caaaagcgat ctgttacagt cttagatgta ggagatgcct atttctcatg 360 ccccttagac ccagatttta gaaaatatac tgctttcact attcctagtg taaacaatga 420 gaccccagga ataagatacc agtacaatgt cctcccgcaa ggatggaaag gttcgccagc 480 catattccaa agttcaatga caaaaatttt agatccattt aggaaagaca acccagaatt 540 agaaatttgt cagtacatgg atgacctata tgtaggatca gatttacccc tggcagaaca 600 tagaaaaagg gttgaattgc ttagagaaca cttatatcag tggggattca ctacccctga 660 taaaaagcat caaaaggaac ctccctttat gtggatgggg tatgagctcc atccagataa 720 atggacagta cagcccatca aattgcctaa caaagatgtg tggacagtaa atgatataca 780 aaaactaata ggaaagttaa attgggcaag tcaaatctat caaggaatta gagtaagaga 840 attgtgtaag ttaattagag gcaccaagtc attaacagaa gtagtaccat taagcaaaga 900 ggcagagatg gaattagagg agaacagaga gaaattaaaa gaaccaatgc atggtgtata 960 ctatcaacct gataaagact tatgggttaa tattcagaag caaggagaag ggcaatggac 1020 ttaccagata tatcaggatg aacataagaa cctcaaaaca gggaaatata ctaggcaaaa 1080 ggcctcccac acaaatgaca taagacaatt agcagaagta atccagaagg tgtctcaaga 1140 atctatagtt atctggggaa aattgcctaa atttaagctg ccagtcacta gagaaacttg 1200 ggaaacatgg tgggcagatt attggcaagc cacctggatc ccagaatggg attatgtcag 1260 cacaccccca ttgatcaaat tatggtaccg gttagaaagt gaacctatta ggggggcaga 1320 aacctattat gtagatggag cagctaatag agatacaaaa ttaggaaaag caggatatgt 1380 tacagaacaa gggaaacaga aaataataaa attagatgag accaccaatc aaaaggctga 1440 attaatggca gtattattag ccttacagga ttccaaagaa aaagtaaata tagtaacaga 1500 ctcacaatat gtattgggca ttatctcctc ccagcctaca cagagtgaat cccctatagt 1560

tcagcagata atagaggaac taacaaaaaa ggaacaggtg tatcttacat gggttcctgc 1620 tcataaaggc ataggaggaa atgaaaaaat agataaatta gtaagcaagg atattagaag 1680 agtcctcgag tcgactcacc accaccacca ccactgataa 1720

<210> 10

<211> 1720

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de nucleotidos del inserto portador de la region codificante para p66 de la RT del VIH-1 de Grupo 0 modificada con las mutaciones K65R y V75I, y nucleotidos adicionales que codifican para aminoacidos en sus extremos N- y C-terminales.

<400> 10 gaattctcct ataagcccca tagccccagt gccagtaaag ctaaaaccag gaatggatgg 60 accaaaagta aaacaatggc ccctatctaa agaaaaaata gaagccttaa cagcaatatg 120 ccaggaaatg gaacaagaag gaaaaatttc aagaatagga cctgaaaatc cttataatac 180 acctatcttt gctataaaaa ggaaagatag tactaagtgg agaaagctga tagactttag 240 ggaattaaac aagagaacac aagatttttg ggaggtacag ttaggtatcc cacatccggg 300 gggtttaaag caaaagcgat ctgttacagt cttagatgta ggagatgcct atttctcatg 360 ccccttagac ccagatttta gaaaatatac tgctttcact attcctagtg taaacaatga 420 gaccccagga ataagatacc agtacaatgt cctcccgcaa ggatggaaag gttcgccagc 480 catattccaa agttcaatga caaaaatttt agatccattt aggaaagaca acccagaatt 540 agaaatttgt cagtacatgg atgacctata tgtaggatca gatttacccc tggcagaaca 600 tagaaaaagg gttgaattgc ttagagaaca cttatatcag tggggattca ctacccctga 660 taaaaagcat caaaaggaac ctccctttat gtggatgggg tatgagctcc atccagataa 720 atggacagta cagcccatca aattgcctaa caaagatgtg tggacagtaa atgatataca 780 aaaactaata ggaaagttaa attgggcaag tcaaatctat caaggaatta gagtaagaga 840 attgtgtaag ttaattagag gcaccaagtc attaacagaa gtagtaccat taagcaaaga 900 ggcagagatg gaattagagg agaacagaga gaaattaaaa gaaccaatgc atggtgtata 960 ctatcaacct gataaagact tatgggttaa tattcagaag caaggagaag ggcaatggac 1020 ttaccagata tatcaggatg aacataagaa cctcaaaaca gggaaatata ctaggcaaaa 1080 ggcctcccac acaaatgaca taagacaatt agcagaagta atccagaagg tgtctcaaga 1140 atctatagtt atctggggaa aattgcctaa atttaagctg ccagtcacta gagaaacttg 1200 ggaaacatgg tgggcagatt attggcaagc cacctggatc ccagaatggg attatgtcag 1260 cacaccccca ttgatcaaat tatggtaccg gttagaaagt gaacctatta ggggggcaga 1320 aacctattat gtagatggag cagctaatag agatacaaaa ttaggaaaag caggatatgt 1380 tacagaacaa gggaaacaga aaataataaa attagatgag accaccaatc aaaaggctga 1440 attaatggca gtattattag ccttacagga ttccaaagaa aaagtaaata tagtaacaga 1500 13

<210> 11

<211> 572

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de aminoacidos de la subunidad p66 de la RT del VIH-1 de Grupo 0 modificada mediante la mutacion K65R, con modificaciones que incluyen tres aminoacidos en el extremo N-terminal y una cola de 6 residuos de histidina <400> 11

Met Asn Ser Pro Ile Ser Pro Ile Ala Pro Val Pro Val Lys Leu Lys 1 5 10 15

Pro Gly Met Asp Gly Pro Lys Val Lys Gln Trp Pro Leu Ser Lys Glu 20 25 30

Lys Ile Glu Ala Leu Thr Ala Ile Cys Gln Glu Met Glu Gln Glu Gly 35 40 45

Lys Ile Ser Arg Ile Gly Pro Glu Asn Pro Tyr Asn Thr Pro Ile Phe 50 55 60

Ala Ile Lys Arg Lys Asp Ser Thr Lys Trp Arg Lys Leu Val Asp Phe 65 70 75 80

Arg Glu Leu Asn Lys Arg Thr Gln Asp Phe Trp Glu Val Gln Leu Gly 85 90 95

Ile Pro His Pro Gly Gly Leu Lys Gln Lys Arg Ser Val Thr Val Leu 100 105 110

Asp Val Gly Asp Ala Tyr Phe Ser Cys Pro Leu Asp Pro Asp Phe Arg 115 120 125

Lys Tyr Thr Ala Phe Thr Ile Pro Ser Val Asn Asn Glu Thr Pro Gly 130 135 140

Ile Arg Tyr Gln Tyr Asn Val Leu Pro Gln Gly Trp Lys Gly Ser Pro 145 150 155 160

Ala Ile Phe Gln Ser Ser Met Thr Lys Ile Leu Asp Pro Phe Arg Lys 165 170 175

Gly Ser Asp Leu Pro Leu Ala Glu His Arg Lys Arg Val Glu Leu Leu 195 200 205

Arg Glu His Leu Tyr Gln Trp Gly Phe Thr Thr Pro Asp Lys Lys His 210 215 220

Gln Lys Glu Pro Pro Phe Met Trp Met Gly Tyr Glu Leu His Pro Asp 225 230 235 240

Lys Trp Thr Val Gln Pro Ile Lys Leu Pro Asn Lys Asp Val Trp Thr 245 250 255

Val Asn Asp Ile Gln Lys Leu Ile Gly Lys Leu Asn Trp Ala Ser Gln 260 265 270

Ile Tyr Gln Gly Ile Arg Val Arg Glu Leu Cys Lys Leu Ile Arg Gly 275 280 285

Thr Lys Ser Leu Thr Glu Val Val Pro Leu Ser Lys Glu Ala Glu Met 290 295 300

Glu Leu Glu Glu Asn Arg Glu Lys Leu Lys Glu Pro Met His Gly Val 305 310 315 320

Tyr Tyr Gln Pro Asp Lys Asp Leu Trp Val Asn Ile Gln Lys Gln Gly 325 330 335

Glu Gly Gln Trp Thr Tyr Gln Ile Tyr Gln Asp Glu His Lys Asn Leu 340 345 350

Lys Thr Gly Lys Tyr Thr Arg Gln Lys Ala Ser His Thr Asn Asp Ile 355 360 365

Arg Gln Leu Ala Glu Val Ile Gln Lys Val Ser Gln Glu Ser Ile Val 370 375 380

Ile Trp Gly Lys Leu Pro Lys Phe Lys Leu Pro Val Thr Arg Glu Thr 385 390 395 400

Trp Glu Thr Trp Trp Ala Asp Tyr Trp Gln Ala Thr Trp Ile Pro Glu 405 410 415

Trp Asp Tyr Val Ser Thr Pro Pro Leu Ile Lys Leu Trp Tyr Arg Leu 420 425 430

Glu Ser Glu Pro Ile Arg Gly Ala Glu Thr Tyr Tyr Val Asp Gly Ala 435 440 445

Gly Lys Gln Lys Ile Ile Lys Leu Asp Glu Thr Thr Asn Gln Lys Ala 465 470 475 480

Glu Leu Met Ala Val Leu Leu Ala Leu Gln Asp Ser Lys Glu Lys Val 485 490 495

Asn Ile Val Thr Asp Ser Gln Tyr Val Leu Gly Ile Ile Ser Ser Gln 500 505 510

Pro Thr Gln Ser Glu Ser Pro Ile Val Gln Gln Ile Ile Glu Glu Leu 515 520 525

Thr Lys Lys Glu Gln Val Tyr Leu Thr Trp Val Pro Ala His Lys Gly 530 535 540

Ile Gly Gly Asn Glu Lys Ile Asp Lys Leu Val Ser Lys Asp Ile Arg 545 550 555 560

Arg Val Leu Glu Ser Thr His His His His His His 565 570

<210> 12

<211> 572

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia de aminoacidos de la subunidad p66 de la RT del VIH-1 de Grupo 0 modificada mediante las mutaciones K65R y V75I, con modificaciones que incluyen tres aminoacidos en el extremo N-terminal y una cola de 6 residuos de histidina <400> 12

Met Asn Ser Pro Ile Ser Pro Ile Ala Pro Val Pro Val Lys Leu Lys 1 5 10 15

Pro Gly Met Asp Gly Pro Lys Val Lys Gln Trp Pro Leu Ser Lys Glu 20 25 30

Lys Ile Glu Ala Leu Thr Ala Ile Cys Gln Glu Met Glu Gln Glu Gly 35 40 45

Lys Ile Ser Arg Ile Gly Pro Glu Asn Pro Tyr Asn Thr Pro Ile Phe 50 55 60

Ala Ile Lys Arg Lys Asp Ser Thr Lys Trp Arg Lys Leu Ile Asp Phe 65 70 75 80

Arg Glu Leu Asn Lys Arg Thr Gln Asp Phe Trp Glu Val Gln Leu Gly 85 90 95 16

Ile Pro His Pro Gly Gly Leu Lys Gln Lys Arg Ser Val Thr Val Leu 100 105 110

Asp Val Gly Asp Ala Tyr Phe Ser Cys Pro Leu Asp Pro Asp Phe Arg 115 120 125

Lys Tyr Thr Ala Phe Thr Ile Pro Ser Val Asn Asn Glu Thr Pro Gly 130 135 140

Ile Arg Tyr Gln Tyr Asn Val Leu Pro Gln Gly Trp Lys Gly Ser Pro 145 150 155 160

Ala Ile Phe Gln Ser Ser Met Thr Lys Ile Leu Asp Pro Phe Arg Lys 165 170 175

Asp Asn Pro Glu Leu Glu Ile Cys Gln Tyr Met Asp Asp Leu Tyr Val 180 185 190

Gly Ser Asp Leu Pro Leu Ala Glu His Arg Lys Arg Val Glu Leu Leu 195 200 205

Arg Glu His Leu Tyr Gln Trp Gly Phe Thr Thr Pro Asp Lys Lys His 210 215 220

Gln Lys Glu Pro Pro Phe Met Trp Met Gly Tyr Glu Leu His Pro Asp 225 230 235 240

Lys Trp Thr Val Gln Pro Ile Lys Leu Pro Asn Lys Asp Val Trp Thr 245 250 255

Val Asn Asp Ile Gln Lys Leu Ile Gly Lys Leu Asn Trp Ala Ser Gln 260 265 270

Ile Tyr Gln Gly Ile Arg Val Arg Glu Leu Cys Lys Leu Ile Arg Gly 275 280 285

Thr Lys Ser Leu Thr Glu Val Val Pro Leu Ser Lys Glu Ala Glu Met 290 295 300

Glu Leu Glu Glu Asn Arg Glu Lys Leu Lys Glu Pro Met His Gly Val 305 310 315 320

Tyr Tyr Gln Pro Asp Lys Asp Leu Trp Val Asn Ile Gln Lys Gln Gly 325 330 335

Glu Gly Gln Trp Thr Tyr Gln Ile Tyr Gln Asp Glu His Lys Asn Leu 340 345 350

Lys Thr Gly Lys Tyr Thr Arg Gln Lys Ala Ser His Thr Asn Asp Ile 355 360 365 17

Arg Gln Leu Ala Glu Val Ile Gln Lys Val Ser Gln Glu Ser Ile Val 370 375 380

Ile Trp Gly Lys Leu Pro Lys Phe Lys Leu Pro Val Thr Arg Glu Thr 385 390 395 400

Trp Glu Thr Trp Trp Ala Asp Tyr Trp Gln Ala Thr Trp Ile Pro Glu 405 410 415

Trp Asp Tyr Val Ser Thr Pro Pro Leu Ile Lys Leu Trp Tyr Arg Leu 420 425 430

Glu Ser Glu Pro Ile Arg Gly Ala Glu Thr Tyr Tyr Val Asp Gly Ala 435 440 445

Ala Asn Arg Asp Thr Lys Leu Gly Lys Ala Gly Tyr Val Thr Glu Gln 450 455 460

Gly Lys Gln Lys Ile Ile Lys Leu Asp Glu Thr Thr Asn Gln Lys Ala 465 470 475 480

Glu Leu Met Ala Val Leu Leu Ala Leu Gln Asp Ser Lys Glu Lys Val 485 490 495

Asn Ile Val Thr Asp Ser Gln Tyr Val Leu Gly Ile Ile Ser Ser Gln 500 505 510

Pro Thr Gln Ser Glu Ser Pro Ile Val Gln Gln Ile Ile Glu Glu Leu 515 520 525

Thr Lys Lys Glu Gln Val Tyr Leu Thr Trp Val Pro Ala His Lys Gly 530 535 540

Ile Gly Gly Asn Glu Lys Ile Asp Lys Leu Val Ser Lys Asp Ile Arg 545 550 555 560

Arg Val Leu Glu Ser Thr His His His His His His 565 570