Nuevas etiquetas de ferroceno para ensayo electroquímico y su uso en métodos analíticos.

El uso de una etiqueta en un ensayo electroquímico de un compuesto de la fórmula general I:

**Fórmula**

en la que:

Fc es un resto de ferrocenilo sustituido o no sustituido,

Fc' es un resto de ferrocenilo sustituido o no sustituido, y puede ser el mismo o diferente de Fc;

X es una cadena de alquileno C1 a C6 que está opcionalmente interrumpida por - O -, - S-, o - NR5 -, en la que R5 representa hidrógeno o alquilo C1 a C6;

Y es una cadena de alquileno C1 a C6 que está opcionalmente interrumpida por - O -, - S-, o - NR5 -, en la que R5 representa hidrógeno o alquilo C1 a C6;

Z es una cadena de alquileno C1 a C12 que puede estar opcionalmente sustituida y/o puede estar opcionalmente interrumpida por - O -, - S -, cicloalquilo, - CO -, CON R1 -, - NR1 CO- o - NR1 - en la que R1 representa hidrógeno o alquilo C1 a C4; y

R es un grupo conector.

CAMPO DE LA INVENCION

La invención se refiere a métodos de detección electroquímicos. Mas especialmente, la invención se refiere a ensayos electroquímicos, a etiquetas electroquímicamente activas para su uso en métodos de detección electroquímicos, y a su uso.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La detección de ciertas moléculas biológicas juega una parte importante en muchos aspectos de la vida. Por ejemplo, en el campo médico, hay una necesidad siempre presente de detectar patógenos bacterianos o virales,

o moléculas biológicas. Otros campos en los que son esenciales ensayos sensibles incluyen las industrias de comida y bebida.

La WO 03/074731 divulga un método de sondeo de un ácido nucleico. Una solución de ácido nucleico se pone en contacto con una sonda de oligonucleótidos con un marcador electroquímicamente activo. Se provoca que la sonda hibride al menos parcialmente con cualquier secuencia diana complementaria que pueda estar presente en la solución de ácidos nucleicos. Después de la degradación enzimática de la sonda de ácidos nucleicos, la información se determina electroquímicamente en relación al marcador. También se divulgan los compuestos para su uso en el método.

La WO2005/05657 divulga un método para detectar actividad de proteasa en el que una solución de muestra se pone en contacto con un sustrato de proteasa con un marcador electroquímicamente activo, proporcionando condiciones bajo la que cualquier proteasa que pueda estar presente en la muestra pueda degradar el sustrato de proteasa y la información relativa al marcador electroquímicamente activo se determina electroquímicamente. También se divulgan ciertos compuestos nuevos para su uso en el proceso.

Hay una necesidad continua de desarrollar etiquetas que permitan la detección de la presencia en concentraciones pequeñas de sustratos o indicadores biológicos, por ejemplo, ácidos nucleicos (en forma aislada o en la forma de moléculas más grandes, por ejemplo, oligonucleótidos naturales o sintéticos) , o aminoácidos ( en forma aislada o en la forma de moléculas más grandes, por ejemplo, péptidos naturales o sintéticos) . En particular, hay una necesidad continua de nuevas etiquetas con diferentes potenciales de oxidación ampliando de esta manera el intervalo de ensayos disponibles posibles y aumentando el ámbito para el desarrollo de reacciones múltiplex.

RESUMEN DE LA INVENCION

La invención proporciona el uso como una etiqueta en un ensayo electroquímico de un compuesto de la fórmula general I:

en la que:

Fc es un resto de ferrocenilo sustituido o no sustituido, Fc' es un resto de ferrocenilo sustituido o no sustituido, y puede ser el mismo o diferente de Fc; X es una cadena de alquileno C1 a C6 que está opcionalmente interrumpida por -O -, -S-, o -NR5 -, en la que R5 representa hidrógeno o alquilo C1 a C6; Y es una cadena de alquileno C1 a C6 que está opcionalmente interrumpida por -O -, -S-, o -NR5 -, en la que R5 representa hidrógeno o alquilo C1 a C6; Z es una cadena de alquileno C1 a C12 que puede estar opcionalmente sustituida y/o puede estar opcionalmente interrumpida por -O -, -S -, cicloalquilo, -CO -, CON R1 -, -NR1 CO-o -NR1 -en la que R1 representa hidrógeno o alquilo C1 a C4; y R es un grupo conector.

Se ha descubierto que los compuestos usados de acuerdo con la invención son etiquetas efectivas para su uso en ensayos electroquímicos. En particular, los compuestos pueden ser usados para formar sustratos etiquetados. Las moléculas de interés como sustratos que pueden ser etiquetadas incluyen, pero no están limitadas a aminoácidos, nucleótidos, nucleósidos, azúcares, péptidos, proteínas, oligonucleótidos, polinucleótidos, carbohidratos y derivados de cualquiera de estas moléculas. Otros sustratos que podrían ser etiquetados usando los

compuestos de la invención incluyen micropartículas y nanopartículas de látex/paramagnéticas. Los compuestos de etiquetado de la fórmula general I y moléculas etiquetadas que incluyen etiquetas derivadas de compuestos de etiquetado que son potencialmente útiles en técnicas electroquímicas en las que las características electroquímicas pueden ser utilizadas para derivar información sobre las etiquetas o su ambiente. Por ejemplo, los compuestos de la invención pueden tener uso en un método como se describe en la WO 03/074731 o en un método como se describe en la WO2005/05657.

En los compuestos usados de acuerdo con la invención se prefiere que X represente alquileno C1 a C6 interrumpido opcionalmente por oxígeno; Y represente alquileno C1 a C6 interrumpido opcionalmente por oxígeno; y Z represente alquileno C1 a C8 interrumpido opcionalmente por oxígeno. X es preferiblemente - (CH2) x -en donde x es de 1 a 6, preferiblemente, de 1 a 4, especialmente 1 ó 2; o alquileno C1 a C6 interrumpido por oxígeno, por ejemplo (CH2) 3 -O -CH2-, - (CH2) 2 -O - (CH2) 2 -, o -CH2 -O - (CH2) 3 -. Y es preferiblemente - (CH2) y -en donde y es de 1 a 6, preferiblemente de 1 a 4, especialmente 1 ó 2; o Alquileno C1 a C6 interrumpido por oxígeno, por ejemplo (CH2) 3. O -CH2 -, - (CH2) 2 -O - (CH2) 2 -o -CH2 -O - ( (CH2) 3 -. Preferiblemente X e Y son el mismo. Preferiblemente Fc y Fc' son el mismo y X e Y son el mismo. Preferiblemente Z es - (CH2) Z-en donde z es de 1 a 8, con z representando preferiblemente de 1 a 6, especialmente de 2 a 6; o es alquileno C1 a C8 interrumpido por oxígeno, por ejemplo - ( (CH2) 2-O- (CH2) 3-o - (CH2) 2-O- (CH2) 3-. En una realización preferida, X es - (CH2) X en donde x es 1 ó 2; Y es - (CH2) y-en donde y es 1 ó 2; y Z es (CH2) Z -en donde z es de 1 a 8. Cuando X e Y representan una cadena de alquileno interrumpida por -NR5-, R5 representa preferiblemente hidrógeno o alquilo C1 a C4, más preferiblemente hidrógeno.

En una realización preferida, la invención proporciona el uso, como una etiqueta electroquímica, de un compuesto de la fórmula general II:

en la que:

Fc es un resto de ferrocenilo sustituido o no sustituido Fc' es un resto de ferrocenilo sustituido o no sustituido, y puede ser el mismo o diferente de Fc; xes 1 ó 2; y es 1ó 2 zes de1 a 8; y R es un grupo conector.

Preferiblemente, x e y son cada uno iguales a 1.

Los restos de ferrocenilo en los compuestos de la fórmula general I o la fórmula general II pueden ser ferrocenilo no sustituido o uno o ambos pueden estar sustituidos como se describe con más detalle a continuación. Se prefiere que los restos de ferrocenilo sean lo mismo, y se prefiere por lo tanto que donde Fc está sustituido con uno o más sustituyentes, Fc' lleve los mismos sustituyentes en las mismas posiciones.

Excepto cuando lo contrario sea aparente del contexto, el término "sustrato" se usa durante el resto de este documento para incluir tanto sustratos de origen natural como sustratos sintéticos. Los sustratos sintéticos incluyen análogos sintéticos de sustratos de origen natural. Los sustratos incluyen nucleótidos individuales y aminoácidos individuales. En el caso de un ensayo basado en la escisión de un sustrato, por ejemplo por un encima, un aminoácido individual puede ser considerado como un sustrato ya que, aunque carece de un enlace interno capaz de ser escindido por un enzima de proteasa, dicho enlace puede formarse a través de la unión de un marcador.

La invención proporciona un método para detectar una entidad química que usa un compuesto de acuerdo con la invención. El uso en un ensayo electroquímico de acuerdo con la invención puede ser por ejemplo en un ensayo para detectar un sustrato etiquetado electroquímicamente. El ensayo electroquímico puede ser por ejemplo un ensayo para la determinación de la cantidad de un sustrato etiquetado electroquímicamente. El ensayo puede ser ventajosamente para detectar o determinar la cantidad de un sustrato etiquetado en donde el sustrato etiquetado es seleccionado de aminoácidos, nucleótidos, nucleósidos, azúcares, péptidos, proteínas, oligonucleótidos, polinucleótidos, carbohidratos, micropartículas y nanopartículas. En ciertas realizaciones preferidas, el ensayo es para detectar o determinar la cantidad de un sustrato etiquetado en el que el sustrato etiquetado es seleccionado de nucleótidos, nucleósidos, oligonucleótidos y polinucleótidos. En otra realización ventajosa, el ensayo es para detectar o determinar la cantidad de un sustrato etiquetado en el que el sustrato etiquetado es seleccionado de aminoácidos, péptidos y proteínas.

Para el propósito de la unión a sustratos, la etiqueta puede ser funcionalizada por la adición de un grupo de funcionalización. Así, la invención proporciona además derivados funcionalizados que comprenden un resto derivado

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1. El uso de una etiqueta en un ensayo electroquímico de un compuesto de la fórmula general I:

en la que:

Fc es un resto de ferrocenilo sustituido o no sustituido, Fc' es un resto de ferrocenilo sustituido o no sustituido, y puede ser el mismo o diferente de Fc; X es una cadena de alquileno C1 a C6 que está opcionalmente interrumpida por -O -, -S-, o -NR5 -, en la que R5 representa hidrógeno o alquilo C1 a C6; Y es una cadena de alquileno C1 a C6 que está opcionalmente interrumpida por -O -, -S-, o -NR5 -, en la que R5 representa hidrógeno o alquilo C1 a C6; Z es una cadena de alquileno C1 a C12 que puede estar opcionalmente sustituida y/o puede estar opcionalmente interrumpida por -O -, -S -, cicloalquilo, -CO -, CON R1 -, -NR1 CO-o -NR1 -en la que R1 representa hidrógeno o alquilo C1 a C4; y R es un grupo conector.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde:

X representa alquileno C1 a C6 interrumpido opcionalmente por oxígeno; Y representa alquileno C1 a C6 interrumpido opcionalmente por oxígeno; Z representa alquileno C1 a C6 interrumpido opcionalmente por oxígeno;

preferiblemente, en donde:

X es - (CH2) x-en la que x es 1 ó 2; Y es - (CH2) y -en la que y es 1 ó 2; Z es - (CH2) z -en la que z es de 1 a 8.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde Fc y Fc' son el mismo y X e Y son el mismo.

4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el ensayo es para detectar un sustrato electroquímicamente etiquetado, preferiblemente un sustrato biológico seleccionado de nucleótidos, nucleósidos, oligonucleótidos y polinucleótidos o un sustrato biológico seleccionado de aminoácidos, péptidos y proteínas.

5. Un método para fabricar un compuesto de etiquetado funcionalizado que comprende un resto de etiqueta para su uso en un ensayo electroquímico, que comprende reaccionar un compuesto de la fórmula general I:

en la que:

Fc es un resto de ferrocenilo sustituido o no sustituido, Fc' es un resto de ferrocenilo sustituido o no sustituido, y puede ser el mismo o diferente de Fc; X es una cadena de alquileno C1 a C6 que está opcionalmente interrumpida por -O -, -S-, o -NR5 -, en la que R5 representa hidrógeno o alquilo C1 a C6; Y es una cadena de alquileno C1 a C6 que está opcionalmente interrumpida por -O -, -S-, o -NR5 -, en la que R5 representa hidrógeno o alquilo C1 a C6; Z es una cadena de alquileno C1 a C12 que puede estar opcionalmente sustituida y/o puede estar opcionalmente interrumpida por -O -, -S -, cicloalquilo, -CO -, CON R1 -, -NR1 CO-o -NR1 -en la que R1 representa hidrógeno o alquilo C1 a C4; y R es un grupo conector que comprende un átomo de oxígeno con un compuesto de funcionalización para obtener un compuesto de etiquetado funcionalizado de la fórmula general III:

A-L-F III en la que A representa en donde Fc, Fc', X, Y y Z son como se ha definido anteriormente, F representa un resto de funcionalización; y L representa un resto conector.

6. Un método para la fabricación de un sustrato etiquetado, que comprende reaccionar un compuesto de la fórmula general III:

A-L-F III

en donde A, F y L son como se define en la reivindicación 5; con un sustrato para formar un sustrato etiquetado.

7. Un compuesto de etiquetado funcionalizado para su uso en el método de la reivindicación 6, el compuesto de etiquetado funcionalizado teniendo la fórmula general III: A-L-F III

en la que A representa un resto de etiquetado de la fórmula general Ia;

en la que:

Fc es un resto de ferrocenilo sustituido o no sustituido, Fc` es un resto de ferrocenilo sustituido o no sustituido, y puede ser el mismo o diferente de Fc; X es una cadena de alquileno C1 a C6 que está opcionalmente interrumpida por -O -, -S-, o -NR5 -, en la que R5 representa hidrógeno o alquilo C1 a C6; Y es una cadena de alquileno C1 a C6 que está opcionalmente interrumpida por -O -, -S-, o -NR5 -, en la que R5 representa hidrógeno o alquilo C1 a C6; Z es una cadena de alquileno C1 a C12 que puede estar opcionalmente sustituida y/o puede estar opcionalmente interrumpida por -O -, -S -, cicloalquilo, -CO -, CON R1 -, -NR1 CO-o -NR1 -en la que R1 representa hidrógeno o alquilo C1 a C4;

L representa un resto conector; y en la que F represente un resto de funcionalización para reaccionar con un sustrato para la unión del resto de etiquetado con el sustrato.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 6 o un compuesto de etiquetado funcionalizado de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el mencionado sustrato es seleccionado de aminoácidos, nucleótidos, nucleósidos, azúcares, péptidos, proteínas, oligonucleótidos, polinucleótidos, carbohidratos, micropartículas y nanopartículas.

9. Un compuesto de etiquetado funcionalizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, en donde (I) el resto de funcionalización F es seleccionado de grupos éster de succinimidilo, grupos fosforamidita, grupos maleimida, grupos de biotina y azida y/o (ii) el resto de funcionalización es o es derivable de un resto de fosforamidita.

10. Un sustrato etiquetado para su uso en un ensayo electroquímico, el sustrato etiquetado siendo de la fórmula

general IIIa:

A-L-F'-[S] IIIa en la que A representa en la que:

Fc es un resto de ferrocenilo sustituido o no sustituido, Fc` es un resto de ferrocenilo sustituido o no sustituido, y puede ser el mismo o diferente de Fc; X es una cadena de alquileno C1 a C6 que está opcionalmente interrumpida por -O -, -S-, o -NR5 -, en la que R5 representa hidrógeno o alquilo C1 a C6; Y es una cadena de alquileno C1 a C6 que está opcionalmente interrumpida por -O -, -S-, o -NR5 -, en la que R5 representa hidrógeno o alquilo C1 a C6; Z es una cadena de alquileno C1 a C12 que puede estar opcionalmente sustituida y/o puede estar opcionalmente interrumpida por -O -, -S -, cicloalquilo, -CO -, CON R1 -, -NR1 CO-o -NR1 -en la que R1 representa hidrógeno o alquilo C1 a C4;

L-F' representa un resto conector; y

[S] representa un sustrato.

11. Un sustrato etiquetado de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el sustrato es seleccionado de moléculas biológicas, micropartículas y nanopartículas, preferiblemente en donde el sustrato es una molécula biológica seleccionada de aminoácidos, nucleótidos, nucleósidos, azúcares, péptidos, proteínas, oligonucleótidos, polinucleótidos y carbohidratos, más preferiblemente en donde el sustrato es seleccionado de nucleótidos, nucleósidos, oligonucleótidos y polinucleótidos o aminoácidos, azúcares, péptidos y proteínas, preferiblemente en donde el sustrato es o comprende un oligonucleótido.

12. Un kit de ensayo para determinar la presencia de una diana del ensayo, en donde le kit de ensayo comprende un sustrato etiquetado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11.

13. Un compuesto de acuerdo con la fórmula general I

en la que a) :

Fc es un resto de ferrocenilo sustituido, Fc` es un resto de ferrocenilo sustituido, y puede ser el mismo o diferente de Fc; X es una cadena de alquileno C1 a C6 que está opcionalmente interrumpida por -O -, -S-, o -NR5 -, en la que R5 representa hidrógeno o alquilo C1 a C6; Y es una cadena de alquileno C1 a C6 que está opcionalmente interrumpida por -O -, -S-, o -NR5 -, en la que R5 representa hidrógeno o alquilo C1 a C6; Z es una cadena de alquileno C1 a C12 que puede estar opcionalmente sustituida y/o puede estar opcionalmente interrumpida por -O -, -S -, cicloalquilo, -CO -, CON R1 -, -NR1 CO-o -NR1 -en la que R1 representa hidrógeno o alquilo C1 a C4; y R es un grupo conector opcionalmente en donde cada resto ferrocenilo está sustituido por al menos un sustituyente seleccionado de halo, alquilo C1 a C4, haloalquilo, arilo, alquenilo C1 a C4 y ciano; o b) :

Fc y Fc' son cada uno un resto de ferrocenilo sustituido, X es una cadena de alquileno C1 a C6 que está opcionalmente interrumpida por -O -, -S-, o -NR5 -, en la que R5 representa hidrógeno o alquilo C1 a C6;

Y es una cadena de alquileno C1 a C6 que está opcionalmente interrumpida por -O -, -S-, o -NR5 -, en la que R5 representa hidrógeno o alquilo C1 a C6; Z es una cadena de alquileno C6 a C12 o es un alquileno C1 a C12 que puede estar opcionalmente sustituida y/o puede estar opcionalmente interrumpida por un resto seleccionado de -O -, -S -, cicloalquilo, -CO -,

CON R1 -, -NR1 CO-o -NR1 -en la que R1 representa hidrógeno o alquilo C1 a C4; y R es un grupo conector

14. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 13, en donde:

(i) X representa - (CH2) x-en la que x es de 1 a 6; e Y representa - (CH2) y -en la que y es de 1 a 6, o

(ii) Z representa alquileno C6 a C8 interrumpido opcionalmente por oxígeno.

15. EL uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o el método de la reivindicación 5, o el compuesto de la reivindicación 13 ó 14, en la que el grupo conector R comprende un grupo capaz de reaccionar con un grupo compatible de un resto de funcionalización o de un sustrato para unir el compuesto a dicho resto de funcionalización o dicho sustrato.

16. Un compuesto seleccionado de

17. N, N-diferrocenilmetil-6-aminohexanol o un análogo del mismo en el que ambos grupos ferrocenilo están sustituidos por uno o más sustituyentes; o, un sustrato etiquetado que comprende un resto de etiquetación derivado de N, N-diferrocenilmetil-6-aminohexanol o de un análogo del mismo en el que ambos grupos ferrocenilo están sustituidos por uno o más sustituyentes.

18. Un método de detectar:

(i) un ácido nucleico que comprende poner en contacto el ácido nucleico con una sonsa de ácido nucleico complementaria bajo condiciones para permitir la hibridación entre la sonda y el amplicón, seguido por el paso de degradar selectivamente la sonda hibridada o sin hibridar, en donde dicha sonda está etiquetada con un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17 y en donde el método proporciona el paso de medir la actividad electroquímica del compuesto que etiqueta la sonda o en donde dicha actividad electroquímica es dependiente o cuantitativamente o cualitativamente de la extensión de la degradación de la sonda; o,

(ii) un aminoácido, péptido o proteína etiquetados con un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, que comprende el paso de medir la actividad electroquímica del compuesto.