NUEVA SUBUNIDAD DEL RECEPTOR NICOTÍNICO DE LA ACETILCOLINA, SU AISLAMIENTO Y SU USO.

Un método para identificar agonistas del receptor nicotínico de acetilcolina alfa9/alfa10,

que comprende: (a) poner en contacto una célula hospedante modificada con un compuesto candidato; y (b) determinar si el compuesto candidato tiene o no algún efecto sobre una señal generada por activación del receptor alfa9/alfa10; en el que la célula hospedante modificada contiene un sistema de expresión que comprende una molécula de DNA o RNA que constituye un vector recombinante, que comprende un sistema de expresión que es capaz de producir un polipéptido HNARA10 y un polipéptido alfa9 cuando dicho sistema de expresión está presente en una célula hospedante compatible, y en el que el sistema de expresión que es capaz de producir un polipéptido HNARA10 comprende: (a) la secuencia nucleotídica presentada en la SEQ ID NO: 1; (b) una secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido HNARA10 presentada en la SEQ ID NO: 2; (c) la secuencia nucleotídica que comprende la secuencia localizada entre los nucleótidos números 43 a 1392 presentada en la SEQ ID NO: 1; (d) la secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos desde aproximadamente 179 hasta aproximadamente 196 presentada en la SEQ ID NO: 2; (e) la secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos desde aproximadamente 357 hasta aproximadamente 374 presentada en la SEQ ID NO: 2; (f) una secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido HNARA10 expresada por el clon cDNA contenido en la ATCC número de depósito PTA-315; (g) una secuencia nucleotídica capaz de hibridarse con la secuencia nucleotídica presentada en la SEQ ID NO: 1 o con el clon cDNA contenido en la ATCC número de depósito PTA-315; (h) una secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido HNARA10 maduro expresada por el clon cDNA contenido en la ATCC número de depósito PTA-315; o (i) una secuencia nucleotídica complementaria de cualquiera de las secuencias nucleotídicas definidas en los puntos (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) o (h) anteriores, así como fragmentos, variantes, derivados y formas mutadas de estas secuencias nucleotídicas

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2000/007918.

Solicitante: SANOFI-AVENTIS.

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: 174, AVENUE DE FRANCE 75013 PARIS FRANCIA.

Inventor/es: BESNARD,François, CHARPANTIER,Eric, SGARD,Frédéric.

Fecha de Publicación: 9 de Mayo de 2011.

Fecha Solicitud PCT: 8 de Agosto de 2000.

Clasificación Internacional de Patentes:

C07K14/705K

Clasificación PCT:

A61K31/70 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 31/00 Preparaciones medicinales que contienen ingredientes orgánicos activos. › Hidratos de carbono; Azúcares; Sus derivados (sorbitol A61K 31/047).
A61K38/17 A61K […] › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › que provienen de animales; que provienen de humanos.
A61P25/00 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES. › Medicamentos para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso.
C07K14/705 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Receptores; Antígenos celulares de superficie; Determinantes celulares de superficie.
C07K16/28 C07K […] › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra receptores, antígenos celulares de superficie o determinantes celulares de superficie.
C12N15/12 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Genes que codifican proteínas animales.
C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
G01N33/50 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre o de orina; Ensayos mediante métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Ensayos inmunológicos (procedimientos de medida o ensayos diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto, procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
G01N33/566 G01N 33/00 […] › utilizando un soporte específico o proteínas receptoras como reactivos para la formación de uniones por ligando.

Clasificación antigua:

A61K31/70 A61K 31/00 […] › Hidratos de carbono; Azúcares; Sus derivados (sorbitol A61K 31/047).
A61K38/17 A61K 38/00 […] › que provienen de animales; que provienen de humanos.
A61P25/00 A61P […] › Medicamentos para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso.
C07K14/705 C07K 14/00 […] › Receptores; Antígenos celulares de superficie; Determinantes celulares de superficie.
C07K16/28 C07K 16/00 […] › contra receptores, antígenos celulares de superficie o determinantes celulares de superficie.
C12N15/12 C12N 15/00 […] › Genes que codifican proteínas animales.
C12N5/10 C12N 5/00 […] › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
C12Q1/68 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen ácidos nucleicos.
G01N33/50 G01N 33/00 […] › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre o de orina; Ensayos mediante métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Ensayos inmunológicos (procedimientos de medida o ensayos diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto, procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
G01N33/566 G01N 33/00 […] › utilizando un soporte específico o proteínas receptoras como reactivos para la formación de uniones por ligando.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

PDF original: ES-2358317_T3.pdf

Fragmento de la descripción:

Nueva subunidad del receptor nicotínico de la acetilcolina, su aislamiento y su uso.

La invención se refiere a polinucleótidos identificados recientemente, a polipéptidos codificados por ellos y al uso de tales polinucleótidos y polipéptidos. La invención se refiere también a la producción de los mismos. Más particularmente, los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención se refieren a un nuevo miembro de la familia de receptores nicotínicos de acetilcolina, de aquí en adelante denominado HNARA10. La invención se refiere también a la inhibición o activación de la acción de tales polinucleótidos y polipéptidos.

Los receptores nicotínicos de acetilcolina (los nAChR) son miembros de la familia del canal iónico dependiente de ligando que comprende también los receptores GABA_A, de glicina y 5-HT₃ (Bamard, E. (1992) TIBS 17, 368-374). Se cree que estos receptores se forman por la asociación de cinco subunidades homólogas orientadas alrededor de un canal catiónico, determinando el dominio extracelular N-terminal de cada subunidad los sitios naturales de unión al ligando (Galzi, J.-L. & Changeux, J. -P. (1995) Neuropharmacol. 34 (6), 563-582). Véase también el documento WO 96/03504 que describe ácidos nucleicos aislados que codifican la subunidad alfa9 de nAChR. Este dominio extracelular, así como otras partes del receptor, puede ser también el objetivo de muchos ligandos naturales y sintéticos capaces de modular la actividad del receptor (Williams, M. et al. (1994) Drugs News Perspect. 7, 205-223). Estos nAChR forman uno de los receptores neurotransmisores excitatorios predominantes sobre los músculos y nervios del sistema nervioso periférico y están expresados también en las neuronas por todo el sistema nervioso central. En adición, también se han descrito los mismos en células no excitatorias tales como linfocitos o queratinocitos. Los nAChR se asocian con un gran número de enfermedades (Lindstrom, J. (1997) Mol. Neurobiol. 15 (2), 193-222). Varias respuestas autoinmunes a los nAChR de los músculos pueden causar parálisis muscular. Se ha demostrado que mutaciones en los nAChR neuronales causan la epilepsia y se ha sugerido que defectos genéticos de algunos nAChR pueden ser responsables de la esquizofrenia. Se ha detectado también una importante pérdida de los nAChR en los cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson. Los nAChR median también en el efecto adictivo de la nicotina. Además, se ha publicado que la nicotina tiene un efecto beneficioso sobre los pacientes con la enfermedad de Tourette y varios estudios sugieren también que los agonistas nicotínicos pueden tener efectos neuroprotectores. Los agonistas nicotínicos tienen también efectos analgésicos y se ha demostrado que los anestésicos pueden actuar también sobre los nAChR. La nicotina puede modular también el ritmo cardíaco y la tensión arterial a través de los nAChR neuronales y se ha demostrado también que es un agente mitógeno que podría estimular ciertas formas de cáncer.

Esto indica que estos receptores tienen una historia establecida y probada como dianas terapéuticas. Existe claramente la necesidad de identificación y caracterización de otros receptores que puedan desempeñar un papel en la prevención, alivio o corrección de disfunciones o enfermedades, incluyendo, pero sin limitarse a ellas, la enfermedad de Alzheimer, trastornos de la memoria, epilepsia, esquizofrenia, corea, síndrome de Tourette, depresión, dependencia de la nicotina, distrofia muscular, enfermedad de Parkinson, dolor, cáncer, úlcera gastrointestinal, trastorno de motilidad gastrointestinal, disfunción endocrina, enfermedad neuronal degenerativa, ictus y trastorno del apetito, acúfenos y disfunción auditiva, y en la producción de analgesia o anestesia.

En un aspecto, la descripción se refiere a polipéptidos y polinucleótidos del "Nombre del receptor" y a materiales y métodos recombinantes para su producción. Otro aspecto de la descripción se refiere a métodos para utilizar tales polipéptidos y polinucleótidos HNARA10 en asociación con otras subunidades de la familia de los receptores nicotínicos de acetilcolina, por ejemplo en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, trastornos de memoria, epilepsia, esquizofrenia, corea, síndrome de Tourette, depresión, dependencia de la nicotina, distrofia muscular, enfermedad de Parkinson, dolor, cáncer, úlcera gastrointestinal, trastorno de la motilidad gastrointestinal, disfunción endocrina, enfermedad neuronal degenerativa, ictus o trastornos del apetito, acúfenos y disfunción auditiva y en la producción de analgesia o anestesia, entre otros. En otro aspecto más, la descripción se refiere a métodos para identificar agonistas y antagonistas que utilizan los materiales proporcionados por la invención, y condiciones de tratamiento asociadas con el uso de tales compuestos. Otro aspecto más de la descripción se refiere a ensayos de diagnóstico para detectar enfermedades asociadas con actividad o niveles inapropiados de HNARA10.

En particular, la invención se refiere a un método para identificar agonistas (y antagonistas respectivamente) del receptor nicotínico de acetilcolina alfa9/alfa10 que comprende poner en contacto una célula hospedante modificada con un compuesto candidato; y determinar si el compuesto candidato tiene o no algún efecto sobre una señal generada por activación del receptor alfa9/alfa10 (determinando respectivamente si la señal generada por dicho agonista disminuye o no en presencia de un compuesto candidato); en el que la célula hospedante modificada contiene un sistema de expresión que comprende una molécula de DNA o RNA que constituye un vector recombinante, que comprende un sistema de expresión que es capaz de producir un polipéptido HNARA10 y un polipéptido alfa9 cuando dicho sistema de expresión está presente en una célula hospedante compatible, y en el que el sistema de expresión que es capaz de producir un polipéptido HNARA10 comprende:

(a) la secuencia nucleotídica presentada en la SEQ ID NO: 1;

(b) una secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido HNARA10 presentada en la SEQ ID NO: 2;

(c) la secuencia nucleotídica que comprende la secuencia localizada entre los nucleótidos números 43 a 1392 presentada en la SEQ ID NO: 1;

(d) la secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos desde aproximadamente 179 hasta aproximadamente 196 presentada en la SEQ ID NO: 2;

(e) la secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos desde aproximadamente 357 hasta aproximadamente 374 presentada en la SEQ ID NO: 2;

(f) una secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido HNARA10 expresada por el clon cDNA contenido en la ATCC número de depósito PTA-315;

(g) una secuencia nucleotídica capaz de hibridarse con la secuencia nucleotídica presentada en la SEQ ID NO: 1 o con el clon cDNA contenido en la ATCC número de depósito PTA-315;

(h) una secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido HNARA10 maduro expresada por el clon cDNA contenido en la ATCC número de depósito PTA-315; o

(i) una secuencia nucleotídica complementaria de cualquiera de las secuencias nucleotídicas definidas en los puntos (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) o (h) anteriores, así como fragmentos, variantes, derivados y formas mutadas de estas secuencias nucleotídicas.

En una realización, la secuencia nucleotídica tiene al menos un 80% de identidad con la contenida en la SEQ ID NO: 1.

En otra realización, la secuencia nucleotídica es el polinucleótido de la SEQ ID NO: 1.

La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos codificada por el cDNA de HNARA10. La escisión del péptido señal se predice entre las posiciones de aminoácidos 24 y 25 (utilizando el software de análisis SignaIP versión 1,1, CBS) y la secuencia del péptido señal prevista está subrayada con una línea de puntos. Las regiones previstas que se extienden en la membrana (MSR I-IV) (utilizando el software de análisis TMHMM versión 1.0, CBS) están subrayadas con una línea sólida. Los asteriscos indican residuos de cisteína en las posiciones 154, 168, 218 y 219 conservados en todas las subunidades alfa de nAChR.

La Figura 2 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de HNARA10 con un nAChR conocido, la secuencia de proteína alfa 9 de rata, utilizando el software MEGALIGN (versión 3.13) de DNASTAR con el algoritmo de Jotun-Hein.

... [Seguir leyendo]

Reivindicaciones:

1. Un método para identificar agonistas del receptor nicotínico de acetilcolina alfa9/alfa10, que comprende:

(a) poner en contacto una célula hospedante modificada con un compuesto candidato; y

(b) determinar si el compuesto candidato tiene o no algún efecto sobre una señal generada por activación del receptor alfa9/alfa10;

en el que la célula hospedante modificada contiene un sistema de expresión que comprende una molécula de DNA o RNA que constituye un vector recombinante, que comprende un sistema de expresión que es capaz de producir un polipéptido HNARA10 y un polipéptido alfa9 cuando dicho sistema de expresión está presente en una célula hospedante compatible,

y en el que el sistema de expresión que es capaz de producir un polipéptido HNARA10 comprende: