Nueva sialidasa.

Un polipéptido aislado que presenta actividad sialidasa y que presenta una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad de secuencias de aminoácidos con los aminoácidos 1 a 407 de la SEC ID Nº 3 o que presenta una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad de secuencias de aminoácidos con los aminoácidos 34 a 407 de la SEC ID Nº 3.

Nueva sialidasa.

Campo de la invención

La invención se refiere a una nueva sialidasa.

Antecedentes de la invención

Los ácidos siálicos comprenden una familia de aproximadamente 4 derivados del ácido neuramínico, azúcar de nueve carbonos. Es un ácido orgánico fuerte con un pKa de alrededor de 2,2. La forma no sustituida, ácido neuramínico, no existe en la naturaleza. El grupo amino se acetila normalmente para proporcionar ácido N-acetilneuramínico, la forma más extendida de ácido siálico, pero también existen otras formas (Traving et al Cell Mol Life Sci (1.998) 54, 1.33-1.349). Se han encontrado ácidos siálicos en el reino animal, de los equinodermos hasta los seres humanos mientras no hay indicio de su existencia en animales inferiores del linaje protostomate o en las plantas. La única excepción conocida es la existencia de ácido polisiálico en larvas del insecto Drosophila. Además hay ácidos siálicos en algunos protozoos, virus y bacterias. Los sialoglucoconjugados están presentes en superficies celulares así como en membranas intracelulares. En animales superiores también son importantes componentes del suero y de sustancias mucosas.

Los ácidos siálicos presentan una variedad de funciones biológicas. Debido a su carga negativa los ácidos siálicos están implicados en la unión y el transporte de moléculas cargadas de manera positiva como los iones calcio, así como en fenómenos de atracción y repulsión entre células y moléculas. Su posición terminal expuesta en cadenas de carbohidratos, además de su tamaño y carga negativa les permite una función como cubierta protectora para la parte sub-terminal de la molécula o la célula. Pueden evitar porej., que las glicol-proteínas se degraden por proteasas o la infección bacteriana de la capa mucosa del sistema respiratorio. Un fenómeno interesante es el efecto extendedor que se ejerce sobre moléculas que contienen ácido siálico debido a las fuerzas repulsivas que actúan entre sus cargas negativas. Esto estabiliza la correcta conformación de enzima o (gluco)-proteínas de membrana y es importante para el carácter viscoso y la función deslizante y protectora resultante de sustancias mucosas, tales como sobre la superficie del ojo o sobre el epitelio de la mucosa (Traving et al Cell Mol Life Sci (1.998) 54, 1.33-1.349). Claramente, el tratamiento de dichas sustancias que contienen ácido siálico con una sialidasa adecuada puede afectar espectacularmente a las propiedades biológicas y las características físicas de dichas sustancias. El tratamiento de proteínas que contienen ácido siálico con una sialidasa puede hacer que sean mucho más fáciles de degradar por las proteasas, el tratamiento de sustancias mucosas con sialidasa podía reducir enormemente o eliminar sus características viscosas. Dichos cambios serían interesantes en caso de que dichas proteínas requieran procedimientos industriales de elaboración (por ej., proteolisis) para por ej., hidrolizados de proteínas.

Los ácidos siálicos forman parte de una variedad de procedimientos de reconocimiento entre células y moléculas. Así, el sistema inmunitario puede distinguir entre autoestructuras y no autoestructuras según su modelo de ácido siálico. El azúcar representa un determinante antigénico, por ejemplo sustancias del grupo sanguíneo y es un componente necesario de los receptores para muchas sustancias endógenas tales como hormonas y citocinas. Además, muchos agentes patógenos tales como las toxinas (por ej., toxina del cólera), virus (por ej., influenza) bacterias (por ej., Escheríchia coli, Helicobacter pylorí) y protozoos (por ej., Trypanosome cruzi) también unen células huésped vía receptores que contienen ácido siálico. Otro grupo importante de moléculas que reconocen el ácido siálico pertenece a las lectinas, que son normalmente glucoproteínas oligómeras de las plantas, animales e invertebrados que se unen a restos azúcar específicos. Ejemplos son aglutinina de germen de trigo, aglutinina de Limulus polyphemus, aglutinina de Sambucas negra y aglutinina de Matacía enuresis. Estas lectinas parecen ayudar a la planta en su defensa contra los microorganismos que contienen ácido siálico o los mamíferos que comen plantas. Las contrapartes de los mamíferos de las lectinas incluyen selectivas y siglas (Traving ef al Cell Mol Life Sci (1.998) 54, 1.33-1.349) y presentan una variedad de funciones fisiológicas. Los ácidos siálicos también pueden ayudar a enmascarar células y moléculas. Los eritrocitos están cubiertos por una capa densa de moléculas de ácido siálico, que se retira escalonadamente durante el ciclo de vida de la célula sanguínea. El penúltimo resto galactosa que representa señales para la degradación llega a ser visible y las células sanguíneas no enmascaradas se unen a macrófagos y fagocitados. Se conocen otros diversos ejemplos de dicha estrategia de enmascaramiento. El enmascaramiento también puede presentar en efecto perjudicial, como se puede observar de algunos de los tumores que se salían a un grado mucho mayor que los correspondientes tejidos. Por consiguiente, las células enmascaradas son invisibles para el sistema inmunitario de defensa y el alto contenido en ácido siálico también puede desempeñar una función en la ausencia de inhibición de crecimiento celular adicional y en la extensión. El efecto de enmascaramiento de los ácidos siálicos también ayuda a esconder sitios antigénicos sobre células parásitas, haciéndolas invisibles para el sistema. Este es el caso para especies microbianas como ciertas cepas E coli y gonococo (Miseria gonorrhoeae). El tratamiento de dichas especies con una sialidasa afectaría a las posibilidades de esconderse del sistema inmunitario.

Las sialidasas (neuraminidasas, EC 3.2.1.18) hidrolizan la unión de ácido siálico, no reductora, terminal, en glucoproteínas, glucolípidos, gangliósidos, polisacáridos y moléculas sintéticas. Algunas sialidasas, denominadas transsialidasas, también pueden realizar reacciones de transferencia en que transfieren el resto ácido siálico de una a otra molécula. Las sialidasas son comunes en animales del linaje deuterostomate (Echinodermata por Mammalia) y

también en diversos microrganismos que existen en su mayoría como comensales o patógenos de animales. Las sialidasas y sus sialil-sustratos, parecen estar ausentes en las plantas y la mayoría de otros metazoarios. Incluso entre las bacterias, la sialidasa se encuentra de manera irregular a fin de que las especies relacionadas o incluso cepas de una especie difieran en esta propiedad. También se han encontrado sialidasas en virus y protozoos (Traving et al Cell Mol Life Sc¡ (1.998) 54, 1.33-1.349). Los micro-organismos que contienen sialidasas con frecuencia viven en contacto con animales superiores como huéspedes, por ejemplo como parásitos. Aquí pueden presentar una función nutricional que permite que sus propietarios eliminen ácidos siálicos del huésped para usar como una fuente de carbono. Para algunos patógenos microbianos, se cree que las sialidasas actúan como factores de virulencia. Sin embargo, la fundón de las sialidasas como factores en patogénesis es controvertida. Por una parte confirman el impacto de especies microbianas patogénicas como Clostridium perfringens. Por otra parte, estas enzimas son factores comunes en el catabolismo de los carbohidratos de muchas especies no patógenas, incluyendo animales superiores. No ejercen, sin embargo, un efecto tóxico directo (Traving et al Cell Mol Life Sci (1.998) 54, 1.33-1.349). En su lugar, su efecto perjudicial depende de la cantidad masiva de enzima que se libera en el huésped junto con otros factores tóxicos en la inducción por ácidos siálicos del huésped en condiciones no fisiológicas.

Las sialidasas de mamíferos tienen un tamaño normalmente de aproximadamente 4-45 kDa. No se han indicado intentos para sobreexpresar y producir sialidasas de mamíferos para cantidades industrialmente interesantes. Las sialidasas humanas pueden ser enzimas lisosomales, sitosólicas o ligadas a las membranas (Achyuthan y Achyuthan (2.1) Comp. Biochem. Phys. Parte B, 129, 29-64). Las sialidasas lisosomales son enzimas glucosiladas. Las sialidasas contienen unidades conservadas. La unidad conservada más destacada es la denominada caja Aspa, que es un segmento de aminoácidos de la fórmula general -S-X-D-X-G-X-T-W- donde X representa un resto variable. Esta unidad se encuentra cuatro a cinco veces por todas las secuencias microbianas con la excepción de las sialidasas víricas, en el caso de que se encuentre solamente una vez o dos veces o esté incluso ausente. La tercera caja Aspa se conserva más fuertemente que las cajas Aspa 2 y 4. El espacio entre dos cajas Aspa secuenciales también se conserva entre diferentes... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido aislado que presenta actividad sialidasa y que presenta una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 7% de identidad de secuencias de aminoácidos con los aminoácidos 1 a 47 de la SEC ID N° 3 o que presenta una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 7% de identidad de secuencias de aminoácidos con los aminoácidos 34 a 47 de la SEC ID N° 3.

2. El polipéptido según la reivindicación 1, que presenta un PM (peso molecular) menor que 55 kDa (SDS-Page), más preferiblemente el polipéptido presenta un PM (peso molecular) menor que 52 kDa (SDS-Page) o el polipéptido presenta un PM (peso molecular) menor que 5 kDa (calculado en base a la secuencia de aminoácidos), más preferiblemente el polipéptido presenta un PM (peso molecular) menor que 45 kDa (calculado en base a la secuencia de aminoácidos).

3. El polipéptido según la reivindicación 1, que es una enzima extracelular.

4. El polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que presenta una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 8%, preferiblemente al menos 9%, más preferiblemente al menos 95%, incluso más preferiblemente al menos 97% de identidad con los aminoácidos 1 a 47 de la SEC ID N° 3 o con los aminoácidos 34 a 47 de la SEC ID N° 3.

5. El polipéptido según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de los aminoácidos de la SEC ID N° 3.

6. El polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que se obtiene de un hongo, preferiblemente un Penicillium, más preferiblemente de Penicilium chrysogenum.

7. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Una construcción de ácidos nucleicos que comprende el polinucleótido de la reivindicación 7, unida de manera operable a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión adecuado.

9. Un vector de expresión recombinante que comprende la construcción de ácidos nucleicos según la reivindicación 8.

1. Una célula huésped recombinante que comprende el vector de expresión recombinante de la reivindicación 9 o la construcción de ácidos nucleicos de la reivindicación 8.

11. Un método para producir el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende cultivar una cepa / célula huésped recombinante según la reivindicación 1, para producir un sobrenadante y/o células que comprenden el polipéptido y recuperar el polipéptido.

12. Uso de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de alimento o alimentación.