N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa precursora, métodos de tratamiento usando dicha enzima y métodos para producir y purificar dicha enzima.

Composición que comprende N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora producida mediante unproceso de perfusión,

en la que dicha N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora tiene una pureza almenos igual al o mayor del 99,5% basándose en la proteína total, en la que dicha pureza se mide usando el métodode fase inversa (RP-HPLC) y en la que la composición está libre de bandas detectables de aproximadamente 47-48kDa tras la electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) con tinción de Coomassie.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2003/035510.

Solicitante: BIOMARIN PHARMACEUTICAL INC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 371 BEL MARIN KEYS BOULEVARD, SUITE 210 NOVATO, CA 94949 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: WENDT, DAN, J., QIN, MINMIN, CHEN, LIN, FITZPATRICK, PAUL A., ZECHERLE, GARY N., STARR, CHRISTOPHER M., HENSTRAND,JOHN M, CHAN,WAI-PAN, SWIEDLER,STUART.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K38/46 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › Hidrolasas (3).
  • C12N9/16 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre los enlaces éster (3.1).

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Fragmento de la descripción:

N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa precursora, métodos de tratamiento usando dicha enzima y métodos para producir y purificar dicha enzima 5

Campo de la invención La presente invención se encuentra en el campo de la medicina clínica, la bioquímica y la biología molecular. La presente invención presenta agentes terapéuticos y métodos para tratar la mucopolisacaridosis VI así como procedimientos de producción y purificación para producir tales agentes terapéuticos.

Antecedentes de la invención La MPS VI (síndrome de Maroteaux-Lamy) es una enfermedad de almacenamiento lisosómico en la que los pacientes afectados carecen de la enzima N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa (ASB) . La enzima metaboliza el resto sulfato del glicosaminoglicano (GAG) sulfato de dermatano (Neufeld, et al., “The mucopolysaccharidoses” The Metabolic Basis of Inherited Disease, eds. Scriver et al., New York:McGraw-Hill, 1989, págs. 1565-1587) . En ausencia de la enzima, se bloquea la degradación gradual del sulfato de dermatano y el sustrato se acumula intracelularmente en el lisosoma en una amplia variedad de tejidos. La acumulación produce un trastorno progresivo con implicación de múltiples órganos y tejidos en el que el bebé parece normal en el nacimiento, pero habitualmente muere antes de la pubertad. El diagnóstico de MPS VI se realiza habitualmente a los 6-24 meses de edad cuando los niños muestran desaceleración progresiva del crecimiento, hígado y bazo agrandados, deformidades esqueléticas, rasgos faciales indeterminados, obstrucción de las vías aéreas superiores y deformidades articulares. Pueden desarrollarse opacificación progresiva de la córnea, hidrocefalia comunicante o enfermedad cardiaca en niños con MPS VI. Habitualmente la muerte resulta de infección respiratoria o enfermedad cardiaca. A diferencia de la MPS I, la MPS VI normalmente no se asocia con afectación progresiva del estado mental, aunque las limitaciones físicas pueden afectar al aprendizaje y el desarrollo. Aunque la mayoría de los pacientes con MPS VI tienen la forma grave de la enfermedad que habitualmente es letal hacia la adolescencia, se han descrito pacientes afectados con una forma menos grave de la enfermedad que pueden sobrevivir durante décadas.

Varias publicaciones proporcionan estimaciones de la incidencia de MPS VI. Un estudio de 1990 de British Columbia de todos los nacimientos entre 1952 y 1986 publicado por Lowr y et al (Lowr y , et al., Human Genet 85:389-390 (1990) ) estima una incidencia de sólo 1:1.300.000. Un estudio austriaco (Meikle et al., JAMA 281 (3) :249-54) de los nacimientos entre 1980-1996 encontró 18 pacientes para una incidencia de 1:248.000. Un estudio en Irlanda del

Norte (Nelson, et al., Hum. Genet. 101:355-358 (1997) ) estimó una incidencia de 1:840.000. Finalmente, un estudio de los Países Bajos de 1970-1996 calculó una prevalencia de 0, 24 por 100.000 (Poorthuis, et al., Hum. Genet. 105:151-156 (1999) ) . Basándose en estos estudios, se estima que hay entre 50 y 300 pacientes en los EE.UU. a los que se ha diagnosticado con todas las formas de este síndrome.

No hay tratamiento satisfactorio para la MPS VI aunque algunos pacientes se han beneficiado de trasplante de médula ósea (BMT) (Krivit, et al., N. Enol. J. Med. 311 (25) :1606-11 (1954) ; Krivit, et al., Int. Pediat. 7:47-52 (1992) ) . El BMT no está disponible de manera universal por la falta de un donante adecuado y se asocia con morbimortalidad sustancial. El Grupo Europeo para Trasplante de Médula Ósea notificó mortalidad relacionada con el trasplante del 10% (HLA idéntico) al 20-25% (HLA erróneo) para 63 casos de trasplante de trastornos lisosómicos (Hoogerbrugge,

et al., Lancer 345: 1398-1402 (1995) ) . Aparte del BMT, la mayoría de los pacientes reciben tratamiento sintomático por problemas específicos como única forma de atención. Un objeto de la presente invención es proporcionar terapia de sustitución enzimática con N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana recombinante (rhASB) . No se han realizado intentos para tratar seres humanos con rhASB. Asimismo, no se han proporcionado formulaciones médicas ni dosificaciones clínicas aceptables. Se han realizado varios ensayos de sustitución enzimática del modelo felino de MPS VI. El documento WO01/83722 se refiere a un método de purificar ASB. Gibson et al Biochem. J. (1987) 248, 755-764 enseñan una purificación inicial de ASB a partir de homogeneizados de hígado humano y anticuerpos monoclonales específicos frente a ASB. Anson et al. Biochem. J. (1992) 284, 789-794 dan a conocer corrección de fibroblastos de mucopolisacaridosis de tipo VI humanos con N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa.

Sumario de la invención La presente invención engloba la producción, purificación y el uso de una composición que comprende una Nacetilgalactosamina-4-sulfatasa altamente purificada en forma de precursor. El ADN y la secuencia codificada de aminoácidos de la forma precursora se exponen en las SEQ ID NOS: 1 y 2, respectivamente. Se prevé que la secuencia señal son los aminoácidos 1-38 de la SEQ ID NO: 2, y la producción recombinante ha dado como resultado un producto que comienza en el residuo de aminoácido o bien 39 o bien 40 de la SEQ ID NO: 2.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende N-acetilgalactosamina-4sulfatasa humana precursora producida mediante un proceso de perfusión, en la que dicha N-acetilgalactosamina-465 sulfatasa humana precursora tiene una pureza al menos igual al o mayor del 99, 5% basándose en la proteína total, en la que dicha pureza se mide usando el método de fase inversa (RP-HPLC) y en la que la composición está libre de bandas detectables de aproximadamente 47-48 kDa tras la electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) con tinción de Coomassie.

En un segundo aspecto, la presente invención presenta usos novedosos de tratamiento de enfermedades y

composiciones para su uso en el tratamiento de enfermedades producidas en su totalidad o en parte por una deficiencia en N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa (ASB) . En este sentido, la presente invención da a conocer la composición farmacéutica según la presente invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad producida en su totalidad o en parte por una deficiencia en N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa y el uso de una Nacetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora que tiene una pureza al menos igual al o mayor del 99, 5% basándose en la proteína total según la presente invención, para la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad producida en su totalidad o en parte por una deficiencia en N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa. El sujeto padece una enfermedad producida en su totalidad o en parte por una deficiencia de N-acetilgalactosamina-4sulfatasa. Las realizaciones preferidas incluyen optimizar la dosificación a las necesidades del organismo que va a tratarse, preferiblemente mamíferos o seres humanos, para mejorar eficazmente los síntomas de la enfermedad. En realizaciones preferidas, la enfermedad es mucopolisacaridosis Vl (MPS V1) o síndrome de Maroteaux-Lamy.

Este segundo aspecto de la invención proporciona específicamente composiciones para su uso en el tratamiento de seres humanos que padecen enfermedades producidas en su totalidad o en parte por una deficiencia en la actividad de ASB mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de ASB humana, preferiblemente ASB humana recombinante. Por tanto, la invención contempla el uso de ASB humana en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una deficiencia en la actividad de ASB, así como una composición farmacéutica que contiene ASB humana para su uso en el tratamiento de una deficiencia en la actividad de ASB. La deficiencia en la actividad de ASB puede observarse, por ejemplo, como niveles de actividad del 50% o menos, el 25% o menos o el 10% o menos en comparación con los niveles normales de actividad de ASB y puede manifestarse como una 25 mucopolisacaridosis, por ejemplo mucopolisacaridosis VI (MPS V1) o síndrome de Maroteaux-Lamy. La cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad suficiente para proporcionar un efecto beneficioso en el paciente humano y preferiblemente proporciona mejoras en uno cualquiera de los siguientes: movilidad, dolor o rigidez articular, ya sea subjetiva u objetivamente; tolerancia o resistencia al ejercicio, por ejemplo, tal como se mide por la capacidad para caminar o subir; función pulmonar, por ejemplo, tal como se mide mediante FVC, FEVI o FET; agudeza visual; o actividades de la vida diaria, por ejemplo, tal como se mide por la capacidad para levantarse desde la posición sentada, ponerse o quitarse ropa o recoger pequeños objetos. La ASB... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Composición que comprende N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora producida mediante un proceso de perfusión, en la que dicha N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora tiene una pureza al

menos igual al o mayor del 99, 5% basándose en la proteína total, en la que dicha pureza se mide usando el método de fase inversa (RP-HPLC) y en la que la composición está libre de bandas detectables de aproximadament.

4. 48 kDa tras la electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) con tinción de Coomassie.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que dicho proceso de perfusión comprende las etapas de:

(a) hacer crecer una célula de ovario de hámster chino (CHO) transfectada con un ADN que codifica para Nacetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora;

(b) introducir las células de CHO transfectadas en un biorreactor; 15

(c) suministrar un medio de crecimiento al biorreactor;

(d) recoger dicho medio que contiene dicha N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora; y

(e) retirar sustancialmente las células transfectadas de dicho medio de recogida.

3. Composición según la reivindicación 2, en la que dichas células de CHO transfectadas se hacen crecer en un biorreactor durante hasta aproximadamente 35 días.

4. Composición según la reivindicación 2 ó 3, en la que dicha N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora se purifica a partir del fluido de dicho medio mediante:

(a) concentrar el fluido hasta aproximadamente 20x;

(b) reducir la actividad proteolítica de una proteasa en el fluido que puede escindir dicha N-acetilgalactosamina-4sulfatasa precursora, en la que dicha reducción no daña a dicha N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa precursora;

(c) hacer pasar el fluido a través de una resina de cromatografía de interacción con el colorante azul Cibracon; 35 (d) hacer pasar el fluido a través de una resina de cromatografía de quelación de cobre;

(e) hacer pasar el fluido a través de una resina de cromatografía de interacción hidrófoba con fenilo; y

(f) recuperar dicha N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa precursora.

5. Composición según la reivindicación 4, en la que en la etapa (b) dicha reducción comprende ajustar el pH del fluido a de aproximadamente 4, 8 a 5, 2.

6. Composición según la reivindicación 4, en la que en la etapa (c) dicha columna de cromatografía de interacción 45 con el colorante azul Cibracon es una columna Blue Sepharose 6 Fast Flow.

7. Composición según la reivindicación 4, en la que en la etapa (d) dicha columna de cromatografía de quelación de cobre es una columna Chelating Sepharose Fast Flow.

8. Composición según la reivindicación 4, en la que en la etapa (e) dicha columna de cromatografía de interacción hidrófoba con fenilo es una columna Phenyl Sepharose 6 Fast Flow High Sub.

9. Composición según la reivindicación 4, en la que la secuencia temporal de las etapas (c) , (d) y (e) es etapa (c) ,

etapa (d) y etapa (e) . 55

10. Composición según la reivindicación 4, en la que en la etapa (f) dicha recuperación comprende diafiltrar el fluido, filtrar el fluido para eliminar el ADN y filtrar el fluido para eliminar virus.

11. Composición farmacéutica que comprende la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un portador farmacéuticamente aceptable.

12. Composición farmacéutica según la reivindicación 11, que comprende además una disolución de cloruro de sodio y un detergente no iónico.

13. Composición farmacéutica según la reivindicación 11, en la que la N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora está presente a una concentración de aproximadamente 1-5 mg/ml o de aproximadamente 50 a aproximadamente 250 unidades por ml.

14. Composición farmacéutica según la reivindicación 11, en la que el tampón es un tampón fosfato de sodio a una concentración de aproximadamente 10-50 mM. 5

15. Composición farmacéutica según la reivindicación 11, en la que el pH de la disolución se mantiene a aproximadamente 5, 8.

16. Composición farmacéutica según la reivindicación 11, que comprende un polioxietilensorbitano.

17. Composición farmacéutica según la reivindicación 16, en la que el polioxietilensorbitano es polioxietilensorbitano 20 u 80 y la concentración de dicho polioxietilensorbitano 20 u 80 es de aproximadamente el 0, 005% (peso/volumen) .

18. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17 para su uso en el tratamiento de una enfermedad producida en su totalidad o en parte por una deficiencia en N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa.

19. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 18, en la que la enfermedad es mucopolisacaridosis, MPS VI o síndrome de Maroteaux-Lamy.

20. Uso de una N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora que tiene una pureza al menos igual al o mayor del 99, 5% basándose en la proteína total según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad producida en su totalidad o en parte por una deficiencia en N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa.

21. Uso según la reivindicación 20, en el que la enfermedad es una mucopolisacaridosis.

22. Uso según la reivindicación 21, en el que la enfermedad es MPS VI.

23. Uso según la reivindicación 20, en el que la enfermedad es síndrome de Maroteaux-Lamy.

24. Uso según la reivindicación 20 o composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 18, en donde dicho paciente tiene aproximadamente un 10% o menos de una actividad de N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa normal.

25. Uso según la reivindicación 20 o composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 18, en donde han de administrarse al menos aproximadamente 50 unidades/kg o al menos aproximadamente 1 mg/kg de dicha Nacetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora semanalmente a dicho paciente.

26. Uso según la reivindicación 20 o composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 18, en donde han de administrarse al menos aproximadamente 100 unidades o 2, 0 mg/kg de dicha N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora semanalmente a dicho paciente.

27.Composición farmacéutica que comprende una composición según la reivindicación 1 y un polioxietilensorbitano 45 a una concentración que oscila entre aproximadamente el 0, 002% y aproximadamente el 0, 008% (peso/volumen) .

28. Composición farmacéutica según la reivindicación 27, en la que dicho polioxietilensorbitano es polioxietilensorbitano 80 a una concentración del 0, 005% (peso/volumen) .

29. Uso según la reivindicación 20 o composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 18, en donde el medicamento es para el tratamiento de un ser humano y la cantidad de dicha N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora es eficaz para proporcionar uno o más efectos beneficiosos seleccionados del grupo que consiste en movilidad articular, dolor articular, rigidez articular, tolerancia al ejercicio, resistencia al ejercicio, función pulmonar, agudeza visual y actividades de la vida diaria.

30. Uso según la reivindicación 20 o composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 18, en donde el medicamento es para el tratamiento de un ser humano y dicha N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora ha de administrarse a una dosis de al menos 0, 2 mg/kg por semana.

31. Uso o composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 30, en donde dicha N-acetilgalactosamina4-sulfatasa humana precursora ha de administrarse a una dosis de al menos 1 mg/kg por semana.

32. Uso o composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 30, en donde dicha N-acetilgalactosamina

4. sulfatasa humana precursora ha de administrarse a una dosis de 1 mg/kg por semana. 65

33. Uso según la reivindicación 20 o composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 18, en donde

dicha N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora ha de administrarse a través de una infusión una vez a la semana a lo largo de un periodo de 2 a 4 horas.

34. Uso de o composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 33, en donde dicha Nacetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora ha de administrarse a través de una infusión una vez a la semana a lo largo de un periodo de 4 horas.


 

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