MUTEÍNAS DE LIPOCALINA LACRIMAL Y PROCEDIMIENTOS PARA OBTENER LAS MISMAS.

Un procedimiento para la generación de una muteína de lipocalina lacrimal humana,

en el que la muteína se une a un ligando no natural dado de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión detectable, que comprende: (a) someter a una molécula de ácido nucleico que codifica una lipocalina lacrimal humana a mutagénesis en al menos 12, 14 ó 16 de los codones de cualquiera de las posiciones de la secuencia de aminoácidos 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 y 108 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura nativa, en la que al menos uno de los codones que codifica restos de cisteína en las posiciones de secuencia 61 y 153 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura se ha mutado para codificar cualquier otro resto aminoacídico, obteniendo de este modo una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican muteínas de lipocalina lacrimal humana, (b) expresar las una o más moléculas de ácido nucleico de muteína obtenidas en (a) en un sistema de expresión, obteniendo de este modo una o más muteínas y (c) enriquecer las una o más muteínas obtenidas en la etapa (b) y que tienen afinidad de unión detectable por un ligando no natural dado de lipocalina lacrimal humana por medio de selección y/o aislamiento, A condición de que el ligando no natural de la lipocalina lacrimal humana no sea el correceptor de linfocitos T humanos CD4

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos Nº 60/821.073 presentada el 1 de agosto de 2006 y de la solicitud provisional de Estados Unidos Nº 60/912.013 presentada el 16 de abril de 2007.

La presente invención se refiere a nuevas muteínas derivadas de lipocalina lacrimal humana que se unen a un 5 ligando no natural dado con afinidad detectable. La invención también se refiere a las moléculas de ácido nucleico correspondientes que codifican dicha muteína y a un procedimiento para su generación. La invención se refiere adicionalmente a un procedimiento para producir dicha muteína. Finalmente, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende dicha muteína de lipocalina, así como a diversos usos de la muteína.

Los miembros de la familia de proteínas de la lipocalina (Pervaiz, S., y Brew, K. (1987) FASEB J. 1, 209-214) son 10 típicamente proteínas secretadas pequeñas que se caracterizan por una serie de diferentes propiedades de reconocimiento molecular: su capacidad para unirse a diversas moléculas principalmente hidrófobas (tales como retinoides, ácidos grasos, colesteroles, prostagladinas, biliverdinas, feromonas, saborizantes y odorizantes), su unión a receptores de superficie celular específicos y su formación de complejos macromoleculares. Aunque en el pasado se han clasificado principalmente como proteínas de transporte, está claro ahora que las lipocalinas cumplen una diversidad de 15 funciones fisiológicas. Éstas incluyen papeles en el transporte de retinol, olfacción, señalización con feromonas y síntesis de prostaglandinas. Las lipocalinas también se han implicado en la regulación de la respuesta inmune y la mediación de la homeostasis celular (revisado, por ejemplo, por Flower, D. R. (1996) Biochem J. 318, 1-14 y Flower, D. R. y col. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 9-24).

Las lipocalinas comparten niveles inusualmente bajos de conservación de secuencia global, con frecuencia con 20 identidades de secuencia de menos del 20%. Muy por el contrario, su patrón de plegamiento global está altamente conservado. La parte central de la estructura de la lipocalina consiste en una única lámina  de ocho cadenas antiparalelas cerrada sobre sí misma para formar un barril  unido por enlaces de hidrógeno de forma continua. Un extremo del barril está bloqueado estéricamente por el segmento peptídico N-terminal que atraviesa su parte inferior, así como tres bucles peptídicos que conectan las cadenas . El otro extremo del barril  está abierto al disolvente y abarca un 25 sitio de unión a diana, que está formado por cuatro bucles peptídicos. Es esta diversidad de los bucles en el armazón de lipocalina que de otro modo sería rígido lo que da origen a una diversidad de diferentes modos de unión, cada uno capaz de alojar dianas de diferente tamaño, forma y carácter químico (revisado, por ejemplo, por Flower, D. R. (1996), mencionado anteriormente; Flower, D. R. y col. (2000), mencionado anteriormente o Skerra, A. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 337-350). 30

La prealbúmina lacrimal humana, llamada ahora lipocalina lacrimal (TLPC o Tlc), se describió originalmente como una proteína principal del fluido lacrimal humano (aproximadamente un tercio del contenido proteico total), pero también se ha identificado recientemente en varios otros tejidos secretores incluyendo próstata, mucosa nasal y mucosa traqueal. Se han encontrado proteínas homólogas en rata, cerdo, perro y caballo. La lipocalina lacrimal es un miembro de lipocalina inusual debido a su alta promiscuidad para lípidos relativamente indisolubles y a sus características de unión, 35 que difieren de otros miembros de esta familia de proteínas (revisado por Redl, B. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 241-248). Una cantidad notable de compuestos lipófilos de diferentes clases químicas tales como ácidos grasos, alcoholes grasos, fosfolípidos, glucolípidos y colesterol son ligandos endógenos de esta proteína. De forma interesante, al contrario que otras lipocalinas, la fuerza de la unión al ligando (diana) está correlacionada con la longitud de la cola de hidrocarbono tanto para alquilamidas como para ácidos grasos. De este modo, la lipocalina lacrimal se une más fuertemente a los 40 lípidos menos solubles (Glasgow, B. J. y col. (1995) Curr. Eye Res. 14, 363-372; Gasymov, O. K. y col. (1999) Biochim. Biophys. Acta 1433, 307-320).

La función biológica precisa de la lipocalina lacrimal humana no se ha aclarado completamente hasta el momento y aún es un tema controvertido. En el fluido lacrimal, parece ser la más importante para la integridad de la película lacrimal, eliminando los lípidos de la superficie mucosa del ojo a la fase líquida (revisado por Gasymov, O. K. y col. 45 (1999), mencionado anteriormente). Sin embargo, presenta actividades adicionales in vitro que son muy inusuales entre las lipocalinas, en concreto la inhibición de proteinasas de cisteína, así como actividad endonucleasa inespecífica (van't Hof, W. y col. (1997) J. Biol. Chem. 272, 1837-1841; Yusifov, T. N. y col. (2000) Biochem. J. 347, 815-819). Recientemente, se ha demostrado que la lipocalina lacrimal es capaz de unirse a varios productos de peroxidación lipídica in vitro, dando como resultado la hipótesis de que podría funcionar como eliminador de moléculas lipófilas potencialmente 50 nocivas inducido por estrés oxidativo fisiológico (Lechner, M. y col. (2001) Biochem. J. 356, 129-135).

Las proteínas, que se unen selectivamente a sus diales correspondientes por medio de interacciones no covalentes, desempeñan un papel crucial como reactivos en biotecnología, medicina, bioanalítica, así como en las ciencias biológicas y de la vida en general. Los anticuerpos, es decir, las inmunoglobulinas, son un ejemplo prominente de esta clase de proteínas. A pesar de las múltiples necesidades para estas proteínas junto con el reconocimiento, unión y/o 55 separación de ligandos/dianas, actualmente se usan casi exclusivamente inmunoglobulinas. La aplicación de otras proteínas con características de unión a ligando definidas, por ejemplo las lectinas, ha permanecido restringida a casos

especiales.

Muy recientemente, los miembros de la familia de la lipocalina se han convertido en sujetos de investigación con respecto a proteínas que tienen propiedades de unión a ligando definidas. La publicación PCT WO 99/16873 desvela polipéptidos de la familia de la lipocalina con posiciones de aminoácidos mutadas en la región de los cuatro bucles peptídicos, que se disponen al final de la estructura de barril  cilíndrica que abarca el bolsillo de unión, y que 5 corresponden a los segmentos de la secuencia polipeptídica lineal que comprenden las posiciones de aminoácidos 28 a 45, 58 a 69, 86 a 99 y 114 a 129 de la proteína de unión a bilina de Pieris brassicae.

La publicación PTC WO 00/75308 desvela muteínas de la proteína de unión a bilina, que se unen específicamente a digoxigenina, mientras que las solicitudes de Patente Internacional WO 03/029463 y WO 03/029471 se refieren a muteínas de la lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilo humana (hNGAL) y apolipoproteína D, 10 respectivamente. Para mejorar adicionalmente y ajustar con exactitud la afinidad a ligando, la especificidad, así como la estabilidad de plegamiento de una variante de lipocalina, se han propuesto diversos enfoques usando diferentes miembros de la familia de la lipocalina (Skerra, A. (2001) Rev. Mol. Biotechnol. 74, 257-275; Schlehuber, S. y Skerra, A. (2002) Biophys. Chem. 96, 213-228), tales como el reemplazo de restos de aminoácidos adicionales. La publicación PCT WO 2006/56464 desvela muteínas de la lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilo humana con afinidad de unión por 15 CTLA-4 en un intervalo nanomolar bajo.

La publicación PCT WO 2005/19256 desvela muteínas de lipocalina lacrimal con al menos un sitio de unión para el mismo o diferentes ligandos diana, y proporciona un procedimiento para la generación de dichas muteínas de lipocalina lacrimal humana. De acuerdo con esta solicitud PCT, ciertas extensiones de aminoácidos dentro de la secuencia primaria de la lipocalina lacrimal, en particular las regiones de bucle que comprenden los aminoácidos 7-14, 24-36, 41-49, 53-66, 20 69-77, 79-84, 87-98 y 103-110 de la lipocalina lacrimal humana madura, se someten a mutagénesis para generar muteínas con afinidades de unión. Las muteínas resultantes tienen afinidades de unión por el ligando seleccionado (KD) en el intervalo nanomolar, en la mayoría de los casos >100...

1. Un procedimiento para la generación de una muteína de lipocalina lacrimal humana, en el que la muteína se une a un ligando no natural dado de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión detectable, que comprende:

(a) someter a una molécula de ácido nucleico que codifica una lipocalina lacrimal humana a mutagénesis en al menos 12, 14 ó 16 de los codones de cualquiera de las posiciones de la secuencia de aminoácidos 26-34, 56-58, 80, 5 83, 104-106 y 108 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura nativa, en la que al menos uno de los codones que codifica restos de cisteína en las posiciones de secuencia 61 y 153 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura se ha mutado para codificar cualquier otro resto aminoacídico, obteniendo de este modo una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican muteínas de lipocalina lacrimal humana, 10

(b) expresar las una o más moléculas de ácido nucleico de muteína obtenidas en (a) en un sistema de expresión, obteniendo de este modo una o más muteínas y

(c) enriquecer las una o más muteínas obtenidas en la etapa (b) y que tienen afinidad de unión detectable por un ligando no natural dado de lipocalina lacrimal humana por medio de selección y/o aislamiento,

A condición de que el ligando no natural de la lipocalina lacrimal humana no sea el correceptor de linfocitos T humanos 15 CD4.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los 18 codones de las posiciones de la secuencia de aminoácidos 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 56, 57, 58, 80, 83, 104, 105, 106 y 108 de la secuencia de polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura están mutados.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que al menos uno de los codones que codifican las 20 posiciones de la secuencia de aminoácidos 61 y 153 de la secuencia polipeptídica lineal de lipocalina lacrimal humana madura está mutado para codificar en la posición la 61 una alanina, fenilalanina, lisina, arginina, treonina, asparagina, tirosina, metionina, serina, prolina o triptófano y/o en la posición 153 una serina o alanina.

4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende adicionalmente someter el ácido nucleico a mutagénesis en los codones que codifican las posiciones de la secuencia de aminoácidos 111 y 114 de la 25 secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura para codificar en la posición 111 una arginina y en la posición 114 un triptófano.

5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende adicionalmente someter el ácido nucleico a mutagénesis en el codón que codifica la cisteína en la posición 101 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura para codificar cualquier otro aminoácido. 30

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el codón que codifica la cisteína en la posición 101 de la secuencia polipeptídica lineal de lipocalina lacrimal humana madura está mutado para codificar una serina.

7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la etapa (c) comprende adicionalmente:

(a) proporcionar como un ligando dado un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un compuesto 35 químico en forma libre o conjugada que muestra características de un hapteno inmunológico, un péptido, una proteína u otra macromolécula,

(b) poner en contacto la pluralidad de muteínas con dicho ligando para permitir la formación de complejos entre dicho ligando y muteínas que tienen afinidad de unión por dicho ligando y

(c) eliminar las muteínas que no tienen afinidad de unión o que no tienen una afinidad de unión sustancial. 40

8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el ligando es una proteína o un fragmento de la misma.

9. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la selección en la etapa (c) se lleva a cabo en condiciones competitivas.

10. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que un ácido nucleico que codifica 45 la pluralidad de muteínas de lipocalina lacrimal humana, dicho ácido nucleico resulta de mutagénesis, se fusiona operativamente en el extremo 3' con un gen que codifica la proteína de cubierta pIII de un bacteriófago filamentoso de la familia M13 o un fragmento de esta proteína de cubierta, para seleccionar al menos una muteína para la unión de un ligando dado.

11. Una muteína de la lipocalina lacrimal humana que tiene afinidad de unión detectable hacia un ligando no natural dado 50 de lipocalina lacrimal humana, en la que los restos de cisteína que aparecen en las posiciones de secuencia 61 y 153 de

la lipocalina lacrimal de tipo silvestre se reemplazan por otros aminoácidos, y en la que al menos 12, 14 ó 16 restos aminoacídicos mutados están presentes en cualquiera de las posiciones de secuencia 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 y 108 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura, con a condición de que el ligando no natural de lipocalina lacrimal humana no sea el correceptor de linfocitos T humanos CD4.

12. La muteína de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la muteína comprende restos aminoacídicos mutados en las 5 18 posiciones de secuencia 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 56, 57, 58, 80, 83, 104, 105, 106 y 108.

13. La muteína de acuerdo con las reivindicaciones 11 ó 12, en la que la muteína al menos una de las sustituciones de aminoácidos Cys61  Ala, Phe, Lys, Arg, Thr, Asn, Tyr, Met, Ser, Pro o Trp y Cys 153  Ser o Ala.

14. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en la que la muteína al menos una sustitución de aminoácidos adicional seleccionada de Arg 111  Pro y Lys 114  Trp. 10

15. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-14, en la que la muteína comprende adicionalmente una sustitución de aminoácidos adicional del resto de cisteína en la posición 101 de la secuencia de la lipocalina lacrimal humana madura.

16. La muteína de acuerdo con la reivindicación 15, en la que la muteína comprende la mutación Cys 101  ser 15

17. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en la que la muteína está en su extremo N-terminal o C-terminal fusionada operativamente con una enzima, una proteína o un dominio proteico, un péptido, una secuencia señal y/o una etiqueta de afinidad.

18. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17, en la que la muteína está fusionada con un resto que prolonga la semivida en suero de la muteína. 20

19. La muteína de acuerdo con la reivindicación 18, en la que el resto que prolonga la semivida en suero se selecciona del grupo que consiste en una parte Fc de una inmunoglobulina, un dominio CH3 de una inmunoglobulina, un dominio CH4 de una inmunoglobulina, albúmina o un fragmento de albúmina, un péptido de unión a albúmina, una proteína de unión a albúmina y transferrina.

20. La muteína de acuerdo con la reivindicación 19, en la que la proteína de unión a albúmina es una proteína de unión a 25 albúmina bacteriana, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo dirigido contra albúmina o una muteína de lipocalina con actividad de unión por albúmina.

21. La muteína de acuerdo con la reivindicación 20, en la que el dominio de albúmina bacteriana es un dominio de unión a albúmina de la proteína G estreptocócica.

22. La muteína de acuerdo con la reivindicación 19, en la que el péptido de unión a albúmina tiene la fórmula Cys-Xaa1-30 Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys, en la que Xaa1 es Asp, Asn, Ser, Thr o Trp; Xaa2 es Asn, Gln, His, Ile, Leu o Lys; Xaa3 es Ala, Asp, Phe, Trp o Tyr; y Xaa4 es Asp, Gly, Leu, Phe, Ser o Thr.

23. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-16, en la que la muteína está conjugada con un marcador seleccionado del grupo que consiste en moléculas orgánicas, marcadores enzimáticos, marcadores radiactivos, marcadores fluorescentes, marcadores cromogénicos, marcadores luminiscentes, haptenos, digoxigenina, biotina, 35 complejos metálicos, metales, oro coloidal y un resto que prolonga la semivida en suero de la muteína.

24. La muteína de acuerdo con la reivindicación 23, en la que el resto que prolonga la semivida en suero se selecciona del grupo que consiste en una molécula de polialquilenglicol, hidroxietil almidón, ácido palmítico u otras moléculas de ácidos grasos, una parte Fc de una inmunoglobulina, un dominio CH3 de una inmunoglobulina, un dominio CH4 de una inmunoglobulina, albúmina o un fragmento de albúmina, un péptido de unión a albúmina, una proteína de unión albúmina 40 y transferrina.

25. La muteína de acuerdo con la reivindicación 24, en la que la proteína de unión a albúmina es una proteína de unión a albúmina bacteriana o una muteína de lipocalina con actividad de unión por albúmina.

26. La muteína de acuerdo con la reivindicación 25, en la que el dominio de albúmina bacteriana es un dominio de unión a albúmina de la proteína G estreptocócica. 45

27. La muteína de acuerdo con la reivindicación 24, en la que el polialquilenglicol es polietilenglicol (PEG) o un derivado activado del mismo.

28. La muteína de acuerdo con la reivindicación 24, en la que el péptido de unión a albúmina tiene la fórmula Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys, en la que Xaa1 es Asp, Asn, Ser, Thr o Trp; Xaa2 es Asn, Gln, His, Ile, Leu o Lys; Xaa3 es Ala, Asp, Phe, Trp o Tyr; y Xaa4 es Asp, Gly, Leu, Phe, Ser o Thr. 50

29. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-28, en la que dicho ligando no natural es una proteína o un fragmento de la misma, a condición de que el ligando no natural no sea el correceptor de linfocitos T

humanos CD4.

30. La muteína de la reivindicación 29, en la que la proteína o fragmento de la misma se selecciona del grupo de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF-R2) y cadena alfa del receptor de interleucina 4 (receptor alfa de IL-4).

31. La muteína de acuerdo con la reivindicación 30, en la que la proteína es el receptor alfa de IL-4. 5

32. La muteína de acuerdo con la reivindicación 31, en la que la proteína es el receptor alfa de IL-4 humano.

33. La muteína de acuerdo con la reivindicación 31 ó 32, en la que la proteína es una región o dominio extracelular del receptor alpha de IL-4.

34. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, en la que la muteína actua como un antagonista de IL-4. 10

35. La muteína de acuerdo con la reivindicación 34, en la que la muteína actua como un antagonista de IL-4 humana.

36. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 31-35, en la que la muteína actua como un antagonista de IL-13.

37. La muteína de acuerdo con la reivindicación 36, en la que la muteína actua como un antagonista de IL-13 humana.

38. La muteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 31-37, reaccionando de forma cruzada la muteína con el 15 receptor alfa de IL-4 de cynomolgus.

39. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 31-38, en la que la muteína comprende al menos dos sustituciones de aminoácidos de aminoácidos nativos por restos de cisteína en cualquiera de las posiciones 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 y 108 con respecto a la secuencia de aminoácidos de lipocalina lacrimal humana madura.

40. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 31-39, en la que la muteína se une a una región 20 extracelular o un dominio del receptor alfa de IL-4 con una KD de 200 nM o menor.

41. La muteína de acuerdo con la reivindicación 40, en la que la muteína se une a una región extracelular o un dominio del receptor alfa de IL-4 con una KD de 100 nM o menor, o en la que la muteína se une a una región extracelular o un dominio del receptor alfa de IL-4 con una KD de 20 nM o menos, o en la que la muteína se une a una región extracelular o un dominio del receptor alfa de IL-4 con una KD de 1 nM o menor. 25

42. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 41, en la que la muteína comprende al menos 12, 14 ó 16 sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de la lipocalina lacrimal humana madura, que se seleccionan del grupo que consiste en Arg 26  Ser, Pro; Glu 27  Arg; Phe 28  Cys; Glu 30  Arg; Met 31  Ala; Asn 32  Tyr, His; Leu  33, Tyr; Glu 34  Gly, Ser, Ala, Asp, Lys, Asn, Thr, Arg; Leu 56  Gln; Ile 57  Arg; Ser 58  Ile, Ala, Arg, Val, Thr, Asn, Lys, Tyr, Leu, Met; Asp 80  Ser; Lys 83  Arg; Glu 104  Leu; Leu  105 30 Cys; His 106  Pro; y Lys 108  Gln.

43. La muteína de acuerdo con la reivindicación 42, que comprende adicionalmente al menos una sustitución de aminoácido adicional seleccionada del grupo que consiste en Met 39  Val; Thr 42  Met, Ala; Thr 43  Ile, Pro, Ala; Glu 45  Lys, Gly; Asn 48  Asp, His, Ser, Thr; Val 53  Leu, Phe, Ile, Ala, Gly, Ser; Thr 54  Ala, Leu; Met 55  Leu, Ala, Ile, Val, Phe, Gly, Thr, Tyr; Glu 63  Lys, Gln, Ala, Gly, Arg; Val 64  Gly, Tyr, Met, Ser, Ala, Lys, Arg, Leu, Asn, His, Thr, 35 Ile; Ala 66  Ile, Leu, Val, Thr, Met; Glu 69  Lys, Gly; Lys 70  Arg, Gln, Glu; Thr 78  Ala; Ile 89  Val; Asp 95  Asn, Ala, Gly; y Tyr 100  His.

44. La muteína de acuerdo con la reivindicación 42 ó 43, en la que la muteína comprende las sustituciones de aminoácidos: Arg 26  Ser, Glu 27  Arg, Phe 28  Cys, Glu 30  Arg; Met 31  Ala, Leu  33 Tyr, Leu 56  Gin, Ile 57  Arg, Asp 80  Ser, Lys 83  Arg, Glu 104  Leu, Leu 105  Cys, His 106  Pro y Lys 108  Gln. 40

45. La muteína de una cualquiera de las reivindicaciones 42 a 44, en la que la muteína comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:

(1) Arg 26  Ser; Glu 27  Arg; Phe 28  Cys; Glu 30  Arg; Met 31  Ala; Asn 32  Tyr; Leu 33  Tyr; Glu 34  Gly; Leu 56  Gln; Ile 57  Arg; Ser 58  Ile; Asp 80  Ser; Lys 83  Arg; Glu 104  Leu; Leu 105  Cys; His 106  Pro; Lys 108  Gln; 45

(2) Arg 26  Ser; Glu 27  Arg; Phe 28  Cys; Glu 30  Arg; Met 31  Ala; Asn 32  Tyr; Leu 33  Tyr; Glu 34  Lys; Leu 56  Gln; Ile 57  Arg; Ser 58  Asn; Asp 80  Ser; Lys 83  Arg; Glu 104  Leu; Leu 105  Cys; His 106  Pro; Lys 108  Gln;

(3) Arg 26  Ser; Glu 27  Arg; Phe 28  Cys, Glu 30  Arg; Met 31  Ala; Asn 32  Tyr; Leu 33  Tyr; Leu 56  Gln; Ile 57  Arg; Ser 58  Arg; Asp 80  Ser; Lys 83  Arg; Glu 104  Leu; Leu 105  Cys; His 106  Pro; 50 Lys 108  Gln;

(4) Arg 26  Ser; Glu 27  Arg; Phe 28  Cys; Glu 30  Arg; Met 31  Ala; Asn 32  Tyr; Leu 33  Tyr; Glu 34  Ser; Leu 56  Gln; Ile 57  Arg; Asp 80  Ser; Lys 83  Arg; Glu 104  Leu; Leu 105  Cys; His 106  Pro; Lys 108  Gln;

(5) Arg 26  Ser; Glu 27  Arg; Phe 28  Cys; Glu 30  Arg; Met 31  Ala; Asn 32  His; Leu 33  Tyr; Glu 34  Ser; Leu 56  Gln; Ile 57  Arg; Ser 58  Ala; Asp 80  Ser; Lys 83  Arg; Glu 104  Leu; Leu 105  Cys; 5 His 106  Pro; Lys 108  Gln;

(6) Arg 26  Ser; Glu 27  Arg; Phe 28  Cys; Glu 30  Arg; Met 31  Ala; Asn 32  Tyr; Leu 33  Tyr; Glu 34  Asp; Leu 56  Gln; Ile 57  Arg; Ser 58  Lys; Asp 80  Ser; Lys 83  Arg; Glu 104  Leu; Leu 105  Cys; His 106  Pro; Lys 108  Gln; y

(7) Arg 26  Ser; Glu 27  Arg; Phe 28  Cys; Glu 30  Arg; Met 31  Ala; Asn 32  0 Tyr; Leu 33  Tyr; Glu 10 34  Gly; Leu 56  Gln; Ile 57  Arg; Asp 80  Ser; Lys 83  Arg; Glu 104  Leu; Leu 105  Cys; His 106  Pro; Lys 108  Gln.

46. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 45, en la que la muteína tiene una secuencia de aminoácidos como se define en una cualquiera de las SEC ID Nº: 2-8 o de un fragmento de las mismas.

47. La muteína de acuerdo con la reivindicación 46, en la que la muteína tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID 15 Nº: 5 o de un fragmento de la misma, o en la que la muteína tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 6 o de un fragmento de la misma.

48. La muteína de acuerdo con la reivindicación 30, en la que el ligando es VEGF-R2.

49. La muteína de acuerdo con la reivindicación 48, en la que el ligando es una región extracelular o un dominio de VEGF-R2. 20

50. La muteína de acuerdo con la reivindicación 48 ó 49, en la que dicha muteína actua como un antagonista de VEGF.

51. La muteína de una cualquiera de las reivindicaciones 48 a 50, en la que la muteína está undia a VEGF-R2 con una KD de 200 nM o menor, o en la que la muteína está unida a VEGF-R2 con una KD de 100 nM o menor, o en la que la muteína está unida a VEGF-R2 con una KD de 20 nM o menor, o en la que la muteína está unida a VEGF-R2 con una KD de 1 nM o menor. 25

52. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 48 a 51, en la que la muteína comprende al menos 12, 14 ó 16 sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de la lipocalina lacrimal humana madura, que se seleccionan del grupo que consiste en Arg 26  Ser; Glu 27  Ile; Glu 30  Ser; Met 31  Gly; Asn 32  Arg; Leu 33  Ile; Glu 34  Tyr; Leu 56  Lys, Glu, Ala, Met; Ile 57  Phe; Ser 58  Arg; Asp 80  Ser, Pro; Lys 83  Glu, Gly; Glu 104  Leu; Leu 105  Ala; His 106  Val; y Lys 108  Thr. 30

53. La muteína de acuerdo con la reivindicación 52, que comprende adicionalmente al menos una sustitución de aminoácido adicional seleccionada del grupo que consiste en Leu 41Phe; Glu 63  Lys; Val 64  Met; Asp 72  Gly; Lys 76  Arg, Glu; Ile 88  Val, Thr; Ile 89  Thr; Arg 90  Lys; Asp 95  Gly; Phe 99  Leu; y Gly 107  Arg, Lys, Glu.

54. La muteína de acuerdo con la reivindicación 52 ó 53, en la que la muteína comprende las sustituciones de 35 aminoácidos: Arg 26  Ser, Glu 27  Ile, Glu 30  Ser, Met 31  Gly, Asn 32  Arg, Leu 33  Ile, Glu 34  Tyr, lle 57  Phe, Ser 58  Arg, Lys 83  Glu, Glu 104  Leu, Leu 105  Ala, His 106  Val y Lys 108  Thr.

55. La muteína de una cualquiera de las reivindicaciones 52 a 54, en la que la muteína comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:

(1) Arg 26  Ser, Glu 27  Ile, Glu 30  Ser, Met 31  Gly, Asn 32  Arg, Leu 33  Ile, Glu 34  Tyr, Leu 56  40 Lys, Ile 57Phe, Ser 58  Arg, Asp 80  Ser, Lys 83  Glu, Glu 104  Leu, Leu 105  Ala, His 106  Val, Lys 108  Thr;

(2) Arg 26  Ser, Glu 27  Ile, Glu 30  Ser, Met 31  Gly, Asn 32  Arg, Leu 33  Ile, Glu 34  Tyr, Leu 56  Glu, Ile 57  Phe, Ser 58  Arg, Asp 80  Ser, Lys 83  Glu, Glu 104  Leu, Leu 105  Ala, His 106  Val, Lys 108  Thr; 45

(3) Arg 26  Ser, Glu 27  Ile, Glu 30  Ser, Met 31  Gly, Asn 32  Arg, Leu 33  Ile, Glu 34  Tyr, Leu 56  Ala, Ile 57  Phe, Ser 58  Arg, Asp 80  Ser, Lys 83  Glu, Glu 104  Leu, Leu 105  Ala, His 106  Val, Lys 108  Thr; y

(4) Arg 26  Ser, Glu 27  Ile, Glu 30  Ser, Met 31  Gly, Asn 32  Arg, Leu 33  Ile, Glu 34  Tyr, Leu 56  Glu, Ile 57  Phe, Ser 58  Arg, Asp 80  Pro, Lys 83  Glu, Glu 104  Leu, Leu 105  Ala, His 106  Val, Lys 50 108  Thr.

56. La muteína de cualquiera de las reivindicaciones 48 a 55, en la que la muteína tiene una secuencia de aminoácidos

como se define en las SEC ID Nº: 34-39.

57. La muteína de acuerdo con la reivindicación 30, en la que el ligando es VEGF o un fragmento del mismo.

58. La muteína de acuerdo con la reivindicación 57, en la que dicha muteína actua como un antagonista de VEGF mediante la inhibición de la unión de VEGF a su receptor, en la que el receptor de VEGF se selecciona del grupo que consiste en VEGF-R1, VEGF-R2 y Neuropilina-I. 5

59. La muteína de acuerdo con la reivindicación 58, en la que el receptor de VEGF es VEGF-R2.

60. La muteína de una cualquiera de las reivindicaciones 57 a 59, en la que la muteína está unida a VEGF con una KD de 200 nM o menor, en la que la muteína está unida a VEGF con una KD de 100 nM o menor, en la que la muteína está unida a VEGF con una KD de 20 nM o menor o en la que la muteína está unida a VEGF con una KD de 1 nM o menor.

61. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 57 a 60, en la que la muteína comprende al menos 10 12, 14, 16 sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de la lipocalina lacrimal humana madura, que se seleccionan del grupo que consiste en Arg 26  Ser, Pro, Val, Leu, Ile; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His, Arg, Tyr, Gln; Ile 57  Val, Thr, Leu; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile, Val; Glu 104  Cys; His 106  Asn, Ser, Asp; y Lys 108  Ala, Val. 15

62. La muteína de acuerdo con la reivindicación 61, que comprende adicionalmente al menos una sustitución de aminoácidos adicional seleccionada del grupo que consiste en Val 36  Met; Thr 37  Ala; Met 39  Thr; Thr 40  Ala, Ser; Asn 48  Asp; Ala 51  Val; Lys 52  Arg; Thr 54  Val; Met 55  Val; Ser 61  Pro; Lys 65  Arg; Ala 66  Val; Val 67  Ile; Glu 69  Gly, Ser, Thr; Lys 76  Arg, Ile, Ala, Met, Pro; Tyr 87  Arg, His, Lys, Gln; Ile 89  Thr, Val, Gly, His, Met, Lys; Arg 90  Gly; Ile 98  Val; y Gly 107  Glu. 20

63. La muteína de acuerdo con la reivindicación 61 ó 62, en la que la muteína comprende las sustituciones de aminoácidos: Glu 27  Gly, Phe 28  Ala, Pro 29  Leu, Glu 30  Arg, Met 31  Cys, Asn 32  Leu, Leu 33  Ala, Glu 34  Gly, Asp 80  Ile, Lys 83  Ile, Glu 104  Cys y Lys 108  Val.

64. La muteína de una cualquiera de las reivindicaciones 61 a 63, en la que la muteína comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos: 25

(1) Arg 26  Ser; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Asn; Lys 108  Val;

(2) Arg 26  Pro; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His; Ser 58  Glu; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Ser; Lys 30 108  Val;

(3) Arg 26  Pro; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Asn; Lys 108  Val;

(4) Arg 26  Pro; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33 35  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  Arg; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Ser; Lys 108  Val;

(5) Arg 26  Pro; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Ser; Lys 108  Val; 40

(6) Arg 26  Ser; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Ser; Lys 108  Val;

(7) Arg 26  Val; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Ser; Lys 45 108  Val;

(8) Arg 26  Leu; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Ser; Lys 108  Val; y

(9) Arg 26  Ile; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33 50  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Ser; Lys 108  Val.

65. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 57 a 64, en la que la muteína tiene una secuencia de aminoácidos como se define en las SEC ID Nº: 26-33 ó 44-47.

66. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una muteína de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 65.

67. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 66, comprendida en un vector. 5

68. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 67, comprendida en un vector fagémido.

69. Una célula huésped que contiene una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 66 a 68.

70. Una composición farmacéutica que comprende una muteína de lipocalina lacrimal humana, como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 30, y un excipiente farmacéuticamente aceptable, o que comprende una muteína de lipocalina lacrimal humana, como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 45, y un 10 excipiente farmacéuticamente aceptable, o que comprende una muteína de lipocalina lacrimal humana, como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 46 a 65, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

71. Un procedimiento para producir una muteína de lipocalina lacrimal humana, como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 11 a 65, en la que la muteína se produce a partir del ácido nucleico que codifica la muteína por medio de procedimientos de ingeniería genética en un organismo huésped bacteriano o eucariota y aislándose de este organismo 15 huésped o su cultivo.

72. Una muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 65, para su uso como un medicamento.

73. Uso de una muteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 65, para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad o trastorno, en el que la enfermedad o trastorno está asociado con un aumento de la respuesta inmune de Th2 o en el que la enfermedad es cáncer. 20

74. El uso de la reivindicación 73, en el que la enfermedad o trastorno es una reacción alérgica o una inflamación alérgica.

75. El uso de la reivindicación 74, en el que la inflamación alérgica está asociada con asma alérgica, rinitis, conjuntivitis o dermatitis.

76. Uso de una muteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 65 para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad o trastorno, en el que la enfermedad o trastorno se selecciona del 25 grupo que consiste en enfermedades o trastornos que están causados o promovidos por un aumento de la vascularización.

77. El uso de acuerdo con la reivindicación 76, en el que la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste en cáncer, degeneración macular húmeda neovascular relacionada con la edad (AMD), retinopatía diabética, edema macular, retinopatía de prematuridad y oclusión de la vena retiniana. 30

78. El uso de acuerdo con la reivindicación 77, en el que dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en carcinomas del tracto gastrointestinal, recto, colon, próstata, ovario, páncreas, mama, vejiga, riñón, endometrio y pulmón, leucemia y melanoma.

79. Uso de una muteína de lipocalina lacrimal humana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-65 para la detección de un ligando no natural dado de lipocalina lacrimal humana en una muestra, que comprende las etapas de 35

(a) poner en contacto la muteína con una muestra sospechosa de contener el ligando dado en condiciones adecuadas, permitiendo de este modo la formación de un complejo entre la muteína y el ligando dado, y

(b) detectar la muteína en complejo mediante una señal adecuada.

80. Uso de una muteína de lipocalina lacrimal humana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-65 para la separación de un ligando no natural dado de lipocalina lacrimal humana, que comprende las etapas de 40

(a) poner en contacto la muteína con una muestra que se supone contiene dicho ligando en condiciones adecuadas, permitiendo de este modo la formación de un complejo entre la muteína y el ligando dado, y

(b) separar el complejo de muteína/ligando de la muestra.

81. El uso de acuerdo con la reivindicación 79 u 80, en el que el complejo de muteína/ligando está unido a un soporte sólido. 45

82. Uso de una muteína de lipocalina lacrimal humana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-65 para la formación de un complejo in vitro con un ligando no natural dado de lipocalina lacrimal humana.