Mutante de la propionil CoA transferasa de Clostridium propionicum y método de preparación de PLA o copolímeros de PLA utilizando el mismo.

Propionil-CoA transferasa que suministra lactil-CoA, que posee la secuencia génica del identificador de secuencia nº 3,

en el que T669C, A1125G y T1158C están mutados, en la que la propionil-CoA transferasa posee: a) la secuencia génica del identificador de secuencia nº 3, en el que T68C, T669C, A1125G y T1158C están mutados, b) la secuencia génica del identificador de secuencia nº 3, en el que T669C, A1125G y T1158C están mutados y en la que se introduce al menos una mutación adicional del ácido nucleico para provocar la mutación de Asp65Gly; c) la secuencia génica del identificador de secuencia nº 3, en el que T669C, A1125G y T1158C están mutados y en la que se introduce al menos una mutación adicional del ácido nucleico para provocar la mutación de Asp65Asn; o d) la secuencia génica del identificador de secuencia nº 3, en el que T669C, A1125G y T1158C están mutados y en la que se introduce al menos una mutación adicional del ácido nucleico para provocar la mutación de Thr199Ile.

Mutante de la propionil CoA transferasa de Clostridium propionicum y método de preparación de PLA o copolímeros de PLA utilizando el mismo.

Sector técnico La presente invención se refiere a un mutante de la propionil-CoA transferasa de Clostridium propionicum, que puede convertir el lactato en lactil-CoA con alta eficiencia en un método de preparación de polilactatos (PLA) o copolímeros de PLA utilizando microorganismos.

Técnica anterior

El polilactato (PLA) es un polímero biodegradable típico derivado del lactato de gran aplicabilidad comercial y biomédica. Aunque en la actualidad la preparación de PLA supone la polimerización del lactato producido por microorganismos fermentadores, de la polimerización directa del lactato solamente se obtiene PLA de bajo peso molecular entre 1.000 y 5.000 Daltons. Para sintetizar PLA de un peso molecular de 100.000 Daltons o superior, puede polimerizarse el PLA de bajo peso molecular obtenido mediante la polimerización directa del lactato utilizando un agente acoplador de cadenas. Sin embargo, en este método, todo el proceso se complica debido a la adición de un solvente orgánico o un agente acoplador de cadenas, que no es fácil de eliminar. Un proceso comercialmente disponible en la actualidad de preparación de PLA de alto peso molecular puede incluir convertir el lactato en lactido y sintetizar PLA utilizando una policondensación con apertura de anillo de los anillos lactido.

Cuando se sintetiza PLA mediante síntesis química de lactato, se obtiene fácilmente un homopolímero de PLA, sin embargo, un copolímero de PLA compuesto de varios tipos de monómeros es difícil de sintetizar y no se dispone del mismo a nivel comercial.

Por otro lado, el polihidroxialcanoato (PHA) es un poliéster almacenado por los microorganismos como fuente de energía o de carbono cuando existe un exceso de fuentes de carbono y falta de otros nutrientes, tales como el fósforo (P) , nitrógeno (N) , magnesio (Mg) y oxígeno (O) , etc. Dado que el PHA posee unas propiedades físicas similares a un polímero sintético convencional obtenido del petróleo y muestra una biodegradabilidad completa, se está reconociendo como un substituto de los plásticos sintéticos convencionales.

Para producir PHA utilizando microorganismos, se necesita un enzima para convertir productos metabólicos microbianos en monómeros de PHA y una PHA sintasa para sintetizar el polímero de PHA a partir de los monómeros de PHA. Cuando se sintetizan PLA y copolímeros de PLA utilizando microorganismos, se necesita el mismo sistema, necesitándose un enzima para proporcionar lactil-CoA además de un enzima para proporcionar hidroxiacil-CoA, que es un substrato original de la sintasa de PHA.

Por lo tanto, para obtener lactil-CoA, los presentes inventores han utilizado la propionil-CoA transferasa de Clostridium propionicum y un mutante de la PHA sintasa de Pseudomonas sp. 6-19 que utiliza la propionil-CoA transferasa como substrato, pudiendo de este modo sintetizar con éxito PLA y copolímeros de PLA tal como se da a conocer en la solicitud de patente coreana nº 10-2006-0116234.

Sin embargo, se ha notificado que cuando la propionil-CoA transferasa de Clostridium propionicum, que es un enzima que suministra lactil-CoA, se expresa a niveles elevados en E. Coli mediante un promotor muy potente, se produce una alteración metabólica grave, que inhibe el crecimiento celular (Selmer y otros, notificado en Eur. J. Biochem. 269:372, 2002) . También, dado que la utilización de codones de un gen que codifica la propionil-CoA transferasa de Clostridium propionicum es bastante diferente a la de E. Coli, puede ser muy difícil expresar de forma normal la propionil-CoA transferasa. Por lo tanto, para sintetizar PLA y copolímeros de PLA de forma más eficiente que en los sistemas convencionales, es muy importante introducir la propionil-CoA transferasa, de manera que proporcione lactil-CoA poco a poco y que se exprese de forma suficiente sin inhibir de forma importante el crecimiento celular.

En Selmert y otros “Gen pct de la propionato CoA-transferasa y gen IcdB parcial de la sub-unidad beta de la lactoil-CoA dehidratasa de Clostridium propionicum” Base de datos Genbank [En línea] NCBI, de 12 de febrero de 2002, se ofrece la secuencia del identificador de secuencia nº: 3 depositado con el nº de acceso AJ276553.

WO 2008/062995 A1 también hace referencia a dicha secuencia en el ejemplo 1.

Problema técnico La presente invención está dirigida a un método de preparación de polilactatos (PLA) o copolímeros de polilactato con elevada eficiencia, dando a conocer una enzima suministradora de monómeros capaz de suministrar lactil-CoA de forma eficiente.

Solución técnica Los presentes inventores han observado que cuando se utiliza un mutante de la propionil-CoA transferasa de Clostridium propionicum, pueden prepararse PLA y copolímeros de PLA con elevada eficiencia al suministrarse lactil-CoA de forma eficiente sin inhibir mucho el crecimiento celular. Ello les llevó a completar la presente invención.

Por consiguiente, la presente invención da a conocer una propionil-CoA transferasa que funciona como enzima suministradora de lactil-CoA, que posee una secuencia génica del identificador de secuencia nº: 3, en la cual T669C, A1125G y T1158C están mutados según la reivindicación 1 y un gen que codifica dicho mutante.

La presente invención también da a conocer un vector recombinante para sintetizar polilactatos (PLA) o copolímeros de PLA, que contiene cualquiera de los genes descritos anteriormente.

Preferentemente, el vector recombinante para la síntesis de polilactatos (PLA) o copolímeros de PLA contiene cualquiera de los genes anteriormente descritos que codifica un mutante de la propionil-CoA transferasa y un gen de polihidroxialcanoato sintasa (PHA) (phaC1Ps6-i9300) del identificador de secuencia nº: 4, que es capaz de sintetizar PLA o copolímeros de PLA utilizando lactil-CoA como substrato.

La presente invención también da a conocer una bacteria transformada con uno de los vectores recombinantes previamente descritos. En este caso, también se hallan dentro del alcance de la presente invención las bacterias obtenidas mediante la transformación de bacterias que carecen de gen para la propionil-CoA transferasa con uno de los vectores recombinantes previamente descritos.

La presente invención también da a conocer un método para la preparación de polilactatos (PLA) o copolímeros de PLA, que comprende el cultivo o crecimiento de las bacterias anteriormente descritas. Para preparar copolímeros de PLA, el cultivo o crecimiento de las bacterias puede realizarse en un ambiente que contenga hidroxialcanoato. El hidroxialcanoato puede ser al menos uno seleccionado del grupo formado por 3-hidroxibutirato, 3-hidroxivalerato, 4-hidroxibutirato, ácido (D) -3-hidroxicarboxílico de cadena media con 6 a 14 átomos de carbono, ácido 2-hidroxipropiónico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido 3-hidroxihexanoico, ácido 3-hidroxiheptanoico, ácido 3 hidroxioctanoico, ácido 3-hidroxinonanoico, ácido 3-hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxiundecanoico, ácido 3-hidroxidodecanoico, ácido 3-hidroxitetradecanoico, ácido 3-hidroxihexadecanoico, ácido 4-hidroxivalérico, ácido 4-hidroxihexanoico, ácido 4-hidroxiheptanoico, ácido 4-hidroxioctanoico, ácido 4-hidroxidecanoico, ácido 5-hidroxi valérico, ácido 5-hidroxihexanoico, ácido 6-hidroxidodecanoico, ácido 3-hidroxi-4-pentenoico, ácido 3-hidroxi-4-transhexenoico, ácido 3-hidroxi-4-cis-hexenoico, ácido 3-hidroxi-5-hexenoico, ácido 3-hidroxi-6-trans-octenoico, ácido 3-hidroxi-6-cis-octenoico, ácido 3-hidroxi-7-octenoico, ácido 3-hidroxi-8-nonenoico, ácido 3-hidroxi-9-decenoico, ácido 3-hidroxi-5-cis-dodecenoico, ácido 3-hidroxi-6-cis-dodecenoico, ácido 3-hidroxi-5-cis-tetradecenoico, ácido 3-hidroxi-7-cis-tetradecenoico, ácido 3-hidroxi-5, 8-cis-cis-tetradecenoico, ácido 3-hidroxi-4-metilvalérico, ácido 3-hidroxi-4-metilhexanoico, ácido 3-hidroxi-5-metilhexanoico, ácido 3-hidroxi-6-metilheptanoico, ácido 3-hidroxi4-metiloctanoico, ácido 3-hidroxi-5-metiloctanoico, ácido 3-hidroxi-6-metiloctanoico, ácido 3-hidroxi-7-metiloctanoico, ácido 3-hidroxi-6-metilnonanoico, ácido 3-hidroxi-7-metilnonanoico, ácido 3-hidroxi-8-metilnonanoico, ácido 3-hidroxi7-metildecanoico, ácido 3-hidroxi-9-metildecanoico, ácido 3-hidroxi-7-metil-6-octenoico, ácido málico, metiléster del ácido 3-hidroxisuccínico, metiléster del ácido 3-hidroxiadipínico, metiléster del ácido 3-hidroxisubérico, metiléster del ácido 3-hidroxiazelaico, metiléster del ácido 3-hidroxisebácico, etiléster del ácido 3-hidroxisubérico, etiléster del ácido 3-hidroxisebácico, propiléster del ácido 3-hidroxipimélico,... [Seguir leyendo]

1. Propionil-CoA transferasa que suministra lactil-CoA, que posee la secuencia génica del identificador de secuencia nº 3, en el que T669C, A1125G y T1158C están mutados,

en la que la propionil-CoA transferasa posee:

a) la secuencia génica del identificador de secuencia nº 3, en el que T68C, T669C, A1125G y T1158C están mutados,

b) la secuencia génica del identificador de secuencia nº 3, en el que T669C, A1125G y T1158C están mutados y en la que se introduce al menos una mutación adicional del ácido nucleico para provocar la mutación de Asp65Gly;

c) la secuencia génica del identificador de secuencia nº 3, en el que T669C, A1125G y T1158C están mutados y en la que se introduce al menos una mutación adicional del ácido nucleico para provocar la mutación de Asp65Asn; o d) la secuencia génica del identificador de secuencia nº 3, en el que T669C, A1125G y T1158C están mutados y en la que se introduce al menos una mutación adicional del ácido nucleico para provocar la 15 mutación de Thr199Ile.

2. Gen que codifica un mutante de la propionil-CoA transferasa, según la reivindicación 1.

3.Vector recombinante para sintetizar polilactatos (PLA) o copolímeros de PLA que contiene el gen, según la reivindicación 2.

4. Vector recombinante, según la reivindicación 3, que contiene además un gen de la polihidroxialcanoato (PHA)

sintasa (phaC1Ps6-19300) del identificador de secuencia nº 4, el cual es capaz de sintetizar PLA o copolímeros de PLA utilizando lactil-CoA como substrato.

5. Bacteria transformada con el vector recombinante según la reivindicación 3 o 4.

6. Procedimiento de preparación de polilactatos (PLA) o copolímeros de PLA, que comprende cultivar o hacer crecer la bacteria, según la reivindicación 5.

7. Procedimiento, según la reivindicación 6, el cultivo o crecimiento se realiza en un ambiente que contiene hidroxialcanoato.