Motivos estructurales de polipéptidos asociados con la actividad de señalización celular.

Un polipéptido de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) aislado que consiste en 60-300 residuos de aminoácido

, en donde el polipéptido de AARS comprende tres hebras ß antiparalelas flanqueadas en cada extremo por una hélice α y muestra una actividad de señalización celular, en donde el polipéptido comprende los residuos 325-410 del SEQ ID NO: 6 o un fragmento activo o variante que muestra una identidad de al menos 90% con los residuos 325-410 del SEQ ID NO: 6, y en donde el polipéptido tiene actividad quimioquina.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2010/025642.

Solicitante: Atyr Pharma, Inc.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 3565 General Atomics Court, Suite 103 San Diego, CA 92121 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: GREENE,LESLIE ANN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/68 (en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/63 (Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K38/00 (Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00))
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/15 (preparaciones medicinales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Procedimientos generales de preparación de péptidos > C07K1/113 (sin cambio de la estructura primaria)
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Ilustración 1 de Motivos estructurales de polipéptidos asociados con la actividad de señalización celular.
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Motivos estructurales de polipéptidos asociados con la actividad de señalización celular.

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DESCRIPCIÓN

Motivos estructurales de polipéptidos asociados con la actividad de señalización celular

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente descripción se refiere en general a polipéptidos que contienen motivos estructurales asociados con la señalización celular y otras actividades biológicamente relevantes, a las composiciones que comprenden tales polipéptidos, y a los métodos de identificación y uso de los mismos.

Descripción de la técnica relacionada

Las proteínas aminoacil-ARNt sintetasas (AARS), que catalizan la aminoácilación de moléculas de ARNt, son esenciales para descodificar la información genética durante el proceso de traducción. Cada una de las ARNt sintetasas eucarióticas consiste en una enzima núcleo, que está íntimamente relacionada con las ARNt sintetasas procariótica, así como con dominios adicionales que están agregados al extremo amino terminal, al extremo carboxilo terminal o insertados a una región interna de la enzima núcleo. La tirosil-ARNt sintetasa (TyrRS) humana, por ejemplo, tiene un dominio carboxilo terminal que no es parte de moléculas de TyrRS procarióticas ni eucarióticas inferiores. Se ha demostrado que varias aminoacil-ARNt sintetasas tienen funciones no canónicas distintas de su implicación en la traducción. Por ejemplo, la mini-tirosil ARNt sintetasa (mini-TyrRS), el dominio N-terminal de TyrRS que corresponde a los residuos de aminoácido 1-364 y es escindido por la elastasa y la plasmina de las células polimorfonucleares, muestra actividades no canónicas no encontradas en la proteína completa. In vitro, se ha demostrado que la mini-TyrRS estimula la activación y la quimiotaxis de neutrófilos, la proliferación y migración de las células endoteliales, y es pro-angiogénica en la membrana corioalantoica de pollo (CAM) y en análisis de matrigel de ratón. La mini-TyrRS tiene un motivo ELR que, como las quimioquinas CXC tales como IL-8, está implicado en muchas de sus actividades quimioquina y angiogénicas. Como en otras citoquinas que contienen ELR, la mutación de este motivo inhibe la unión de mini-TyrRS y la estimulación de leucocitos y la angiogénesis.

Además, se ha demostrado que las formas truncadas de TrpRS tienen propiedades anti-angiogénicas. En células humanas normales, existen dos formas de TrpRS que pueden ser detectadas: una forma principal que consiste en la molécula completa (residuos de aminoácido 1-471) y una forma minoritaria truncada. La forma minoritaria se genera por deleción de un dominio amino terminal a través de un corte y empalme alternativo del pre-ARNm y se denomina mini-TrpRS. Se ha determinado que el extremo amino de miniTrpRS es el residuo de metionina de la posición 48 de la molécula de TrpRS completa. Alternativamente, la TrpRS truncada puede ser generada por proteolisis. Por ejemplo, la TrpRS bovina es altamente expresada en el páncreas y es secretada en el jugo pancreático, dando como resultado de ese modo la producción de una molécula de TrpRS truncada. Otros estudios indican que la miniTrpRS inhibe la proliferación y la migración celulares inducidas por VEGF (Wakasugi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 173- 177 (2002)). En particular, un análisis de CAM de pollo demuestra que la miniTrpRS bloquea la actividad angiogénica de VEGF. En contraste, la TrpRS completa no inhibe la angiogénesis. De este modo, la eliminación de los primeros 48 residuos de aminoácido expone la actividad anti-angiogénica de TrpRS. Por lo tanto, como con TyrRS, ciertas formas de TrpRS poseen actividades distintas de la aminoacilación de ARNt.

También se ha demostrado que otras proteínas citoplásmicas tienen isoformas con actividades biológicas extracelulares. Por ejemplo, la tiorredoxina (Hu-Trx) humana cumple un papel clave en las actividades rédox en el citoplasma de las células, pero tiene una forma secretada truncada que es una citoquina mitogénica (Arner, 2000; Eur J biochem 267:6102-6109).

Desafortunadamente, no hay métodos fiables para pronosticar o identificar qué proteínas citoplásmicas o fragmentos polipeptídicos derivados de proteínas AARS y/u otras proteínas pueden tener actividades novedosas y previamente no apreciadas. La presente descripción aborda estas necesidades y ofrece otras ventajas relacionadas.

Park et al. 2005 (Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 6356-6361) describen que el polipéptido lisil-ARNt humano induce la secreción de TNF-alfa.

El documento US 2006/078553 describe composiciones que comprenden fragmentos de ARNt sintetasas, tales como Trp-ARNt sintetasa para inhibir la angiogénesis.

Yang et al. 2002 (Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 15369-15374) describen la estructura de un fragmento de tyr-ARNt sintetasa que tiene tres hebras beta antiparalelas y dos hélices alfa y que tiene actividad citoquina.

Xie et al. 2007 (Proc. Natl. Acad. Sci. 104: 9976-9981) describen la estructura de GlyRS, que comprende tres hebras beta antiparalelas flanqueadas por dos hélices alfa.

Yadong et al. 2004 (J. Biol. Chem. 279: 8378-8388), Guijarro et al. 2002 (Structure 10: 311-317) y Goldgur et al. 1997 (Structure 5: 59-68) describen polipéptidos que contienen varias láminas beta y hélices alfa que muestran una actividad de señalización celular.

Datson et al. 2007 (BMC Genomics vol. 8, núm. 1, pág. 190) describen un fragmento de 180 aminoácidos de Lys- ARNt sintetasa.

Compendio de la invención

La presente descripción se refiere a polipéptidos aislados que comprenden o consisten esencialmente en motivos estructurales concretos, como se describe en la presente memoria, que muestran al menos una actividad de señalización celular y/u otra actividad no canónica de relevancia biológica. La presente descripción se refiere adicionalmente a polinucleótidos que codifican tales polipéptidos, agentes de unión que se unen a tales polipéptidos, análogos, variantes y fragmentos de tales polipéptidos, etc., así como composiciones y métodos de identificación y uso de cualquiera de los anteriores.

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente descripción, se proporcionan polipéptidos aislados que comprenden o consisten esencialmente en tres láminas β y dos hélices α, en donde los polipéptidos muestran una actividad de señalización celular y/u otra actividad no canónica relativa a la proteína de la cual se obtuvieron. El orden y la orientación precisos de las láminas β y las hélices α requeridas dentro de un polipéptido de la presente descripción pueden variar al tiempo que todavía originan las actividades de señalización celular y/u otras actividades no canónicas deseadas. Sin embargo, en una realización particularmente ilustrativa, un polipéptido de la presente descripción consiste esencialmente en tres láminas β antiparalelas flanqueadas en cada extremo por una hélice α.

El tamaño de un polipéptido de la presente descripción puede variar al tiempo que todavía conserva los rasgos estructurales y funcionales deseados descritos en la presente memoria. No obstante, en ciertas realizaciones ilustrativas de la presente descripción, un polipéptido aislado descrito en la presente memoria tendrá un tamaño en el intervalo de aproximadamente 40-400, 50-300 o 60-200 residuos de aminoácido.

En muchas realizaciones descritas en la presente memoria, un polipéptido de la presente descripción será un fragmento contiguo de una proteína de mamífero (p. ej., una proteína humana), o una secuencia que comparte una identidad estructural sustancial (p. ej., al menos 70%, 80% o 90%) con dicho fragmento contiguo. No obstante, en otras realizaciones de la presente descripción, se entenderá que el polipéptido puede estar formado por dos o más fragmentos no contiguos de una proteína, o secuencias que comparten una identidad de secuencia sustancial con dichos fragmentos no contiguos.

En una realización específica de la presente descripción, un polipéptido aislado descrito en la presente memoria es un polipéptido GlyRS (GRS) que comprende o consiste esencialmente en los residuos 345-438 del SEQ ID NO: 1, cuyo fragmento ha sido identificado en la presente memoria por contener un motivo estructural de la presente descripción y por tener una actividad de señalización celular. En una realización relacionada, el polipéptido asilado es un fragmento activo o una variante de un polipéptido que comprende los residuos 345-438 del SEQ ID NO: 1, p. ej., un fragmento del polipéptido que conserva la misma actividad de señalización celular o una actividad similar o una variante que comparte una identidad de secuencia sustancial con éste (p. ej., al menos 80% o 90%) y que conserva la misma actividad de señalización celular o una actividad similar.

En otra realización específica de la presente descripción, el polipéptido es un polipéptido AspRS (DRS) que comprende o consiste esencialmente en los residuos 367-448 de SEQ ID NO: 2 o un fragmento activo o una variante del mismo.

En otra realización específica de la presente descripción, el polipéptido es un polipéptido HisRS (HRS) que comprende o consiste esencialmente en los residuos 294-372 del SEQ ID NO: 3 o un fragmento activo o una variante del mismo.

En otra realización específica más de la presente descripción, el polipéptido es un polipéptido ThrRS (TRS) que comprende o consiste esencialmente en los residuos 469-586 del SEQ ID NO: 4 o un fragmento activo o una variante del mismo.

En otra realización específica de la presente descripción, el polipéptido es un polipéptido GluProRS (EPRS) que comprende o consiste esencialmente en los residuos 1171-1253 del SEQ ID NO: 5 o un fragmento activo o una variante del mismo.

En otra realización específica más de la presente descripción, el polipéptido es un polipéptido SerRS (SRS) que comprende o consiste esencialmente en los residuos 325-410 del SEQ ID NO: 6 o un fragmento activo o una variante del mismo.

En otra realización específica más de la presente descripción, el polipéptido es un polipéptido PheRS (FRS) que comprende o consiste esencialmente en los residuos 380-449 del SEQ ID NO: 7 o un fragmento activo o una variante del mismo.

En otra realización específica más de la presente descripción, el polipéptido es un polipéptido LysRS (KRS) que comprende o consiste esencialmente en los residuos 425-523 del SEQ ID NO: 8 o un fragmento activo o una variante del mismo.

En otra realización específica más de la presente descripción, el polipéptido es un polipéptido AspRS (NRS) que comprende o consiste esencialmente en los residuos 416-494 del SEQ ID NO: 9 o un fragmento activo o una variante del mismo.

En otra realización específica más de la presente descripción, el polipéptido es un polipéptido AlaRS (ARS) que comprende o consiste esencialmente en los residuos 148-258 del SEQ ID NO: 10 o un fragmento activo o una variante del mismo.

En otra realización específica de la presente descripción, el polipéptido es un polipéptido de tiorredoxina que comprende o consiste esencialmente en los residuos 20-105 del SEQ ID NO: 11 o un fragmento activo o una variante del mismo. En otra realización, el polipéptido es un polipéptido Trx80 que comprende o consiste esencialmente en los residuos 20-84 del Trx80, que es una forma secretada de tiorredoxina que contiene los 84 residuos de aminoácido N-terminales de la tiorredoxina.

En otra realización específica de la presente descripción, el polipéptido es un polipéptido del factor inhibidor de macrófagos que comprende o consiste esencialmente en los residuos 1-90 del SEQ ID NO: 12 o un fragmento activo o una variante del mismo.

En otra realización específica más de la presente descripción, el polipéptido es un polipéptido de isoforma B de peroxirredoxina 5 humana que comprende o consiste esencialmente en los residuos 32-68 y 125-161 del SEQ ID NO: 13 o un fragmento activo o una variante del mismo.

En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, la actividad de señalización celular de un polipéptido de la presente descripción es una actividad quimioquina y/o citoquina y se puede determinar y/o confirmar utilizando cualquiera de una variedad de análisis ilustrativos conocidos y establecidos en la técnica. En realizaciones específicas descritas en la presente memoria, la actividad de señalización celular se puede determinar utilizando esencialmente cualquier análisis que mida la actividad citoquina, la actividad quimioquina, la quimiotaxis, la migración celular, la liberación de citoquina, la diferenciación celular y/o la toxicidad celular. En realizaciones más específicas descritas en la presente memoria, la actividad citoquina se puede determinar, por ejemplo, utilizando un análisis que mide la quimiotaxis de monocitos, la liberación de interleuquinas, y/o la apoptosis dependientes de GPCR.

Ciertas realizaciones descritas en la presente memoria incluyen métodos de modulación de la actividad quimioquina, tales como la secreción de TNF-α. Las realizaciones específicas descritas en la presente memoria incluyen métodos de inducción de la secreción de TNF-α. Ciertas realizaciones descritas en la presente memoria incluyen métodos de modulación de la quimiotaxis de las células inmunitarias. Las realizaciones específicas descritas en la presente memoria incluyen métodos de inducción de la quimiotaxis de monocitos. Ciertas realizaciones descritas en la presente memoria incluyen métodos de modulación de la señalización de receptores de tipo Toll. Las realizaciones específicas descritas en la presente memoria incluyen métodos de inducción de la señalización de receptores 2 de tipo Toll.

De acuerdo con otro aspecto de la presente descripción, se proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido descrito en la presente memoria.

De acuerdo con otro aspecto más, la presente descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende un polipéptido como se describe en la presente memoria, o un polinucleótido que codifica un polipéptido como se describe en la presente memoria.

De acuerdo con otro aspecto, la presente descripción proporciona a vector que comprende un polinucleótido aislado como se describe en la presente memoria, así como también una célula anfitriona que comprende semejante vector.

De acuerdo con otro aspecto más, la presente descripción proporciona métodos de escrutinio para identificar proteínas que contienen un motivo estructural como se describe en la presente memoria y de ese modo identificar fragmentos de polipéptidos novedosos dentro de dichas proteínas que poseen actividades de señalización celular y/u otras actividades no canónicas. Por ejemplo, en una realización, la presente descripción proporciona un método para identificar un fragmento de polipéptido que tiene una actividad citoquina identificando una secuencia de proteína que contiene un motivo estructural como se describe en la presente memoria, p. ej., formado por dos hélices α y tres láminas β, determinando los límites de los residuos de aminoácido del motivo estructural dentro de dicha proteína, e identificando de ese modo un fragmento de polipéptido de la proteína que tiene una actividad citoquina.

En ciertas realizaciones de los métodos de escrutinio descritos, la etapa de identificación de una secuencia de proteína que contiene un motivo estructural formado por dos hélices α y tres láminas β anti-paralelas se lleva a cabo utilizando un método de predicción de la estructura secundaria conocido y disponible en la técnica, que puede incluir de manera ilustrativa, pero no limitado a, PHDsec, NSSP, SOPM, DSC, SSPRED, MultiPredict, PSA, NNPREDICT, APSSP, GOR, HNN, HTMSRAP, Jpred, JUFO, nnPredict, Porter, PredictProtein, Prof, PSIpred, SOPMA, SSpro y DLP-SVM.

En otros aspectos más de la presente descripción, los polipéptidos, anticuerpos y/u otras composiciones descritos en la presente memoria se pueden utilizar esencialmente en cualquier tipo de análisis de escrutinio conocido y disponible en la técnica. Por ejemplo, las composiciones de la presente descripción (p. ej., polipéptidos, polinucleótidos y/o anticuerpos) se pueden utilizar junto con cualquier metodología de escrutinio esencialmente conocida con el fin de identificar tipos de células adecuados y/o estados de enfermedad susceptibles de tratamiento de acuerdo con la presente descripción. En otros ejemplos, las composiciones de la presente descripción (p. ej., polipéptidos, polinucleótidos y/o anticuerpos) se pueden utilizar junto con metodologías de escrutinio bien conocidas con el fin de identificar compañeros de unión, inhibidores competitivos, efectores celulares, y similares, que median o modulan, bien directamente bien indirectamente, las actividades de señalización celular y/o actividades no canónicas de las composiciones de la presente memoria. Por ejemplo, en una realización concreta, se proporciona un método de escrutinio para identificar compuestos de ensayo como inhibidores, o alternativamente, potenciadores, de una interacción entre una composición de la presente descripción y uno o más de sus compañeros de unión, efectores celulares y/o tipos de células sujetos a modulación. Esto puede incluir, por ejemplo, etapas de formación de una mezcla de reacción que incluye: (i) una composición de la presente descripción, (ii) un compañero de unión, un efector celular y/o un tipo de célula que se sabe que están modulados por dicha composición, y (iii) un compuesto de ensayo; y detectar la interacción del compuesto de ensayo con el compañero de unión, el efector celular y/o el tipo de célula. Un cambio estadísticamente significativo (potenciación o inhibición) en la actividad o la modulación en presencia del compuesto de ensayo, con respecto a la interacción en ausencia del compuesto de ensayo, indica un agonista potencial (mimético o potenciador) o antagonista (inhibidor) de la actividad.

Breve descripción de los identificadores de secuencia

SEQ ID NO: 1 es la secuencia de aminoácidos completa de la glicil-ARNt sintetasa (GlyRS) humana.

SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos completa de aspartil-ARNt sintetasa (AspRS) humana.

SEQ ID NO: 3 es la secuencia de aminoácidos completa de la histidil-ARNt sintetasa (HisRS) humana.

SEQ ID NO: 4 es la secuencia de aminoácidos completa de la treonil-ARNt sintetasa (ThrRS) humana.

SEQ ID NO: 5 es la secuencia de aminoácidos completa de la glutamil/prolil-ARNt sintetasa (GluProRS) humana.

SEQ ID NO: 6 es la secuencia de aminoácidos completa de la seril-ARNt sintetasa (SerRS) humana.

SEQ ID NO: 7 es la secuencia de aminoácidos completa de la fenilalanil-ARNt sintetasa (FRSa) humana.

SEQ ID NO: 8 es la secuencia de aminoácidos completa de la lisil-ARNt sintetasa (KRS) humana.

SEQ ID NO: 9 es la secuencia de aminoácidos completa de la asparraginil-ARNt sintetasa (NRS) humana.

SEQ ID NO: 10 es la secuencia de aminoácidos completa de la alanil-ARNt sintetasa (ARS) humana.

SEQ ID NO: 11 es la secuencia de aminoácidos completa de la tiorredoxina humana.

SEQ ID NO: 12 es la secuencia de aminoácidos completa del factor inhibidor de macrófagos humano.

SEQ ID NO: 13 es la secuencia de aminoácidos completa de la isoforma B de la peroxirredoxina 5 humana.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 muestra un motivo estructural ilustrativo de la presente descripción que comprende tres láminas β antiparalelas flanqueadas por una hélice α en cada extremo.

Las FIG. 2A-2C muestran la identificación de un fragmento de GlyRS humana que contiene un motivo estructural de la presente descripción y la demostración de que el fragmento tiene actividad quimioquina. La FIG. 2A muestra la localización del fragmento G6 y el motivo estructural dentro de GlyRS completa. La FIG. 2B muestra un modelo estructural de los residuos 344-420 de GlyRS. La FIG. 2C muestra que el fragmento G6 induce la migración de monocitos THP-1 dependiente de GPCR.

La FIG. 3 muestra que el motivo estructural identificado se encuentra en otras proteínas AARS de clase II, que incluye GlyRS (GRS), ThrRS (TRS), HisRS (HRS), AspRS (DRS), GluProRS (EPRS), SerRS (SRS), AsnRS (NRS), AlaRS (ARS), PheRS (FRS) y LysRS (KRS).

La FIG. 4 muestra la conservación estructural de un motivo de la presente descripción a través de múltiples proteínas AARS de clase II, a pesar de su relativamente baja conservación de secuencia.

La FIG. 5 muestra que el motivo estructural de la presente descripción también se encuentra en proteínas que no son AARS, incluyendo (A) tiorredoxina humana, (B) proteína inhibidora de macrófagos (residuos 1-90), y (C) isoforma B de peroxirredoxina 5 (residuos 32-68 y 125-161). Una característica de las proteínas que comparten este motivo estructural es que se secretan de una manera no convencional.

La FIG. 6 muestra que un motivo estructural de la presente descripción se encuentra dentro del fragmento de una seril ARNt sintetasa (SerRS) humana que muestra actividad de señalización celular. Esta figura muestra la localización del fragmento S3 (residuos 253-484 de la SerRS completa) y el motivo estructural (residuos 325-410) dentro de la secuencia de polipéptidos de SerRS completa.

Las FIG. 7A-7C muestran que el fragmento S3 (residuos 253-484 de SerRS completa) que contiene un motivo estructural de la presente descripción se une a monocitos y células B humanos y estimula la secreción de TNF-α procedente de una línea celular monocítica humana. La FIG. 7A muestra la unión de S3 a monocitos humanos, la FIG. 7B muestra la unión de S3 a células B humanas, y la FIG. 7C muestra la inducción de la secreción de TNF-α procedente de una línea celular monocítica (THP-1) humana en comparación con un control de LPS.

La Figura 8 muestra que el fragmento S3 señalizaba a través de un receptor 2 de tipo Toll para lograr una secreción fuerte de fosfatasa alcalina de una manera dependiente de la dosis (eje x = dosificación en nM; eje y = DO600).

La Figura 9 muestra que la señalización mediada por S3 a través del receptor 2 de tipo Toll (TLR2) era inhibida por el pre-tratamiento con un anticuerpo monoclonal que bloquea la unión a mTLR2.

Descripción detallada de la invención

La presente invención es como se proporciona en las reivindicaciones.

La práctica de la presente descripción empleará, a no ser que se indique específicamente lo contrario, métodos convencionales de biología molecular y técnicas de ADN recombinante que están dentro del conocimiento práctico de la técnica, muchos de los cuales se describen más adelante con fines ilustrativos. Dichas técnicas se explican totalmente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª Edición, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); ADN Cloning: A Practical Approach, vol. I y II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames y S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames y S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal, ed., 1984).

Según se utiliza en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un," "una", "uno" y "el" y "la" incluyen las referencias en plural a menos que el contenido dicte claramente lo contrario.

A lo largo de esta memoria descriptiva, a no ser que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que las palabras "comprenden", "comprende", y "que comprende" implican la inclusión de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos indicado pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos.

Por "consiste en" se quiere significar que incluye, y se limita a, lo que sea que sigue la expresión "que consiste en".

Así, la expresión "que consiste en" indica que los elementos listados se requieren o son obligatorios, y que no pueden estar presentes otros elementos. Por "consiste esencialmente en" se quiere significar que incluye cualesquiera elementos listados después de la expresión, y que está limitado a otros elementos que no interfieren con o contribuyen a la actividad o acción especificada en la descripción para los elementos listados. Así, la expresión "que consiste esencialmente en" indica que los elementos listados se requieren o son obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar presentes dependiendo de si afectan o no materialmente a la actividad o acción de los elementos listados.

Un "agonista" se refiere a una molécula que intensifica o imita la actividad biológica no canónica de una AARS. Los agonistas pueden incluir proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, pequeñas moléculas, o cualquier otro compuesto o composición que module la actividad de una AARS o bien interaccionando directamente con la AARS o su compañero de unión, o bien actuando sobre componentes de la ruta biológica en la cual participa la AARS. Se incluyen los agonistas parciales y totales.

El término "antagonista" se refiere a una molécula que inhibe o atenúa la actividad biológica no canónica de una AARS. Los antagonistas pueden incluir proteínas tales como anticuerpos, ácidos nucleicos, carbohidratos, moléculas pequeñas, o cualquier otro compuesto o composición que module la actividad de una AARS o su compañero de unión, o bien interaccionando directamente con la AARS o su compañero de unión o bien actuando sobre los componentes de la ruta biológica en la cual participa la AARS. Se incluyen los antagonistas parciales y totales.

El término "modular" incluye "incrementar" o "estimular", así como también "disminuir" o "reducir", típicamente en una cantidad estadísticamente significativa o fisiológicamente significativa en comparación con un control. Una cantidad "incrementada" o "aumentada" es típicamente una cantidad "estadísticamente significativa", y puede incluir un incremento que es 1,1, 1,2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 o más veces (p. ej., 500, 1000 veces) (incluyendo todos los números enteros y puntos decimales intermedios y superiores a 1, p. ej., 1,5, 1,6, 1,7. 1,8, etc.) la cantidad producida sin composición (en ausencia de un agente o compuesto) o una composición de control. Una cantidad "disminuida" o reducida es típicamente una cantidad "estadísticamente significativa", y puede incluir un descenso de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18% , 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 100% en la cantidad producida sin composición (en ausencia de un agente o compuesto) o una composición de control, incluyendo todos los números enteros intermedios.

Un "sujeto", según se utiliza en la presente memoria, incluye cualquier animal que muestra un síntoma, o se encuentra en riesgo de mostrar un síntoma, que puede ser tratado o diagnosticado con una composición de la presente descripción. Los sujetos adecuados (pacientes) incluyen animales de laboratorio (tales como ratón, rata, conejo, o cobaya), animales de granja, y animales domésticos o mascotas (tales como un gato o perro). Están incluidos los primates no humanos y, preferiblemente, los pacientes humanos.

"Tratamiento" o "tratar", según se utiliza en la presente memoria, incluye cualquier efecto deseable sobre los síntomas o la patología de una enfermedad o afección que se puede ver afectada por las actividades moduladoras de la célula de una composición como se describe en la presente memoria, y puede incluir incluso cambios mínimos o mejoras en uno o más marcadores medibles de la enfermedad o afección que están siendo tratadas. "Tratamiento" o "tratar" no indican necesariamente la erradicación completa o cura de la enfermedad o afección, o síntomas asociados de ésta. El sujeto que recibe este tratamiento es cualquier sujeto que lo necesite. Los marcadores ilustrativos de mejora clínica serán evidentes para los expertos en la técnica.

Según se utilizan en la presente memoria, los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan de acuerdo con el significado convencional, es decir, como una secuencia de aminoácidos. Los polipéptidos no se limitan a una longitud específica, pero, en el contexto de la presente descripción, representan típicamente un fragmento de una proteína completa, y pueden incluir modificaciones post-traduccionales, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares, así como también otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto de origen natural como de origen no natural. Los polipéptidos y proteínas de la presente descripción se pueden preparar utilizando cualquiera de una variedad de mecanismos recombinantes y/o sintéticos bien conocidos, cuyos ejemplos ilustrativos se comentan adicionalmente más abajo.

La presente descripción se refiere en general a la identificación de motivos estructurales de polipéptidos asociados con actividades biológicas inesperadas de relevancia terapéutica. Por ejemplo, como se describe adicionalmente en la presente memoria, se identificó un motivo estructural de proteína dentro de un fragmento aislado de la proteína glicil-ARNt sintetasa (GRS) humana, y se cree que este motivo estructural es responsable de la actividad de señalización celular inesperada que se ha encontrado que es inducida por el fragmento GlyRS. Otro análisis del motivo estructural identificado reveló su presencia no solamente en otras proteínas AARS humanas, sino también en otras proteínas no relacionadas con la síntesis de ARNt. De este modo, basándose en este descubrimiento, la presente descripción proporciona un medio para identificar fragmentos de polipéptidos que tenían actividades de señalización celular y/u otras actividades biológicas no reconocidas previamente, y proporciona adicionalmente los fragmentos de polipéptidos identificados de ese modo. Por ejemplo, en una realización ilustrativa, al identificar la presencia de un motivo estructural como se describe en la presente memoria dentro de proteínas citoplásmicas que están siendo escrutadas, es posible delinear fragmentos de polipéptidos secretados novedosos de esas proteínas citoplásmicas que tienen actividades no apreciadas previamente no relacionadas con sus actividades citoplásmicas canónicas.

Por consiguiente, la presente descripción proporciona en sentido amplio polipéptidos aislados que contienen un motivo estructural como se describe en la presente memoria, en donde los polipéptidos muestran al menos una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica (p. ej., una actividad que no se observa para la proteína completa a partir de la cual se obtuvo el polipéptido o una actividad que es significativamente diferente (p. ej., incrementada o disminuida) con respecto a la proteína completa de la cual se obtuvo).

En una realización concreta de la presente descripción, se proporcionan polipéptidos aislados que contienen un motivo estructural formado por dos hélices α y tres láminas β, en donde los polipéptidos muestran al menos una actividad de señalización u otra actividad no canónica. En una realización específica de la presente descripción, se proporcionan polipéptidos aislados que contienen un motivo estructural formado por dos hélices α y tres láminas β antiparalelas, en donde los polipéptidos muestran al menos una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización incluso más específica de la presente descripción, se proporcionan polipéptidos aislados que contienen un motivo estructural formado por tres láminas β antiparalelas flanqueadas por una hélice α en cada extremo (p. ej., como se representa ilustrativamente en la FIG.1), en donde los polipéptidos muestran al menos una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica.

Un motivo estructural de la presente descripción, p. ej., que tiene tres láminas β y dos hélices α, se puede identificar dentro de una proteína utilizando esencialmente cualquiera de una variedad de metodologías establecidas y bien conocidas disponibles en la técnica para la predicción de la estructura secundaria de una proteína. La predicción de la estructura secundaria consiste en un conjunto de técnicas que pueden predecir con una elevada exactitud las estructuras secundarias locales de las proteínas basándose en el conocimiento de su secuencia de aminoácidos primaria y/u otros parámetros. Para las proteínas, una predicción consiste generalmente en la asignación de regiones de la secuencia de aminoácidos que es probable que adopten una estructura secundaria concreta, p. ej., hélices α, hebras β, láminas β, etc. El éxito de la predicción se puede evaluar, por ejemplo, comparándola con los resultados del algoritmo DSSP aplicado a la estructura cristalina de la proteína (si estuviera disponible). Se han desarrollado algoritmos especializados para la detección de estos y otros patrones bien definidos en las proteínas.

Por consiguiente, utilizando tales metodologías, se puede predecir con gran exactitud la presencia de motivos estructurales de la presente descripción dentro de las proteínas que están siendo escrutadas utilizando cualquiera de los numerosos programas disponibles públicamente y bien conocidos y/o herramientas de modelado para la predicción de la estructura secundaria, de los cuales se exponen varios ejemplos ilustrativos más abajo:  ESyPred3D (http://www.fundp.ac.be/sciences/biologie/urbm/bioinfo/esypred/), Lambert C, Leonard N, De Bolle X, Depiereux E. ESyPred3D: Prediction of proteins 3D structures. Bioinformatics. 2002 Sep;18(9):1250-1256, que es un programa de modelado por homología automatizado;  I_Tasser (http://zhang.bioinformatics.ku.edu/I-TASSER/), que construye modelos basados en alineamientos múltiples por diseño de homología remota;  Bhageerath (http://www.scfbio-iitd.res.in/bhageerath/index.jsp) un servidor de predicción de la estructura de proteínas basado en la energía; 

PHDsec (http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/), que es un sistema de red neuronal basado en el alineamiento múltiple; 

NSSP (http://dot.imgen.bcm.tmc.edu:9331/pssprediction/pssp.html), que es un método del vecino más próximo basado en el alineamiento múltiple; 

SOPM (http://www.ibcp.fr/predict.html), que es un método basado en el alineamiento múltiple que combina diversos programas de predicción; 

DSC (http://bonsai.lif.icnet.uk/bmm/dsc/dsc-read_align.htmi), que es un programa basado en el alineamiento múltiple que utiliza la estadística; 

SSPRED: (http://www.embl-heidelberg.de/sspred/ssp_mul.htmi), que es un programa basado en el alineamiento múltiple que utiliza la estadística; 

MultiPredict (http://kestrel.ludwig.ucl.ac.uk/zpred.html), que es un método basado en el alineamiento múltiple que utiliza la información fisicoquímica de un conjunto de secuencias alineadas y constantes de decisión estadísticas de la estructura secundaria; 

PSA (http://bmerc-www.bu.edu/psa/), que analiza las secuencias de aminoácidos para predecir las estructuras secundarias y las clases de plegamientos; 

NNPREDICT (http://www.cmpharm.ucsf.edu/~nomi/nnpredict.html), que es una predicción de red neuronal basada en la secuencia individual; 

APSSP (http://imtech.res.in/raghava/apssp/), que es conocido como Advanced Protein Secondary Structure Prediction Server; 

GOR (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_ gor4.html ), que cuenta con Teoría de Información/Inferencia Bayesiana (Garnier et al, 1996); 

HNN (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html) que cuenta con un método Hierarchical Neural Network (Guermeur, 1997); 

HTMSRAP (http://biotechnology.tbzmed.ac.ir/htmsrap/index.htm), que emplea Helical TransMembrane Segment Rotational Angle Prediction; 

Jpred (http://www.compbio.dundee.ac.uk/~www-jpred/), que implica la predicción de la estructura secundaria basada en una red neuronal; 

JUFO (http://www.meilerlab.org/view.php?section=0&page=6 ), que implica la predicción de la estructura secundaria de proteínas basada en una red neuronal; 

nnPredict (http://www.cmpharm.ucsf.edu/~nomi/nnpredict.html); 

Porter (http://distill.ucd.ie/porter/ ); 

PredictProtein (http://www.predictprotein.org/), que incluye PHDsec, PHDacc, PHDhtm, PHDtopology, PHDthreader, MaxHom y EvalSec; 

Prof (http://www.aber.ac.uk/~phiwww/prof/), que utiliza clasificadores múltiples en cascada para la predicción de la estructura secundaria; 

PSIpred (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/), que incluye diversos métodos de predicción de la estructura de proteínas; 

SOPMA (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_ sopma.html) (Geourjon y Deléage, 1995) 

SSpro (http://www.igb.uci.edu/?page=tools&subPage=psss), que incluye una predicción de la estructura secundaria utilizando redes neuronales recurrentes bidireccionales; y, 

DLP-SVM (http://www.tuat.ac.jp/~domserv/cgi-bin/DLP-SVM.cgi), que implica una predicción de conectores de dominios utilizando SVM.

Se puede encontrar información adicional referente a algunos de estos y otras metodologías de predicción de la estructura secundaria para secuencias individuales, por ejemplo, en Chou et al. (1974) Biochemistry, 13, 211-222; Lim (1974) Journal of Molecular Biology, 88, 857-872; Garnier et al. (1978) Journal of Molecular Biology, 120, 97- 120; Kabsch et al. (1983) FEBS Letters, 155, 179-182; Deleage et al. (1987) Protein Engineering, 1, 289-294 (DPM; http://www.ibcp.fr/serv_pred.html); Presnell et al. (1992) Biochemistry, 31, 983-993; Holley et al. (1989) Proceedings of the National Academy of Science, 86, 152-156; King et al. (1990). Journal of Molecular Biology, 216, 441-457; y Kneller et al.

(1990) Journal of Molecular Biology, 214, 171-182 (NNPRED; http://www.cmpharm.ucsf.edu/~nomi/nnpredict.html).

Además, se puede encontrar información adicional referente a algunos de estos y otros métodos automatizados para predecir la estructura secundaria de secuencias de proteínas alineadas de manera múltiple, por ejemplo, en Zvelebil et al. (1987) Journal of Molecular Biology, 195, 957-961 (ZPRED); Rost et al. (1993) Journal of Molecular Biology, 232, 584-599 (PHD;http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html); Salamov et al. (1995) Journal of Molecular Biology, 247, 1 (NNSSP; http://dot.imgen.bcm.tmc.edu:9331/seq-search/struc-predict.html); Geourjon et al. (1994), Protein Engineering, 7, 157-16 (SOPMA; http://www.ibcp.fr/serv_pred.html); Solovyev et al. (1994) Computer Applications in the Biosciences, 10, 661-669. (SSP; http://dot.imgen.bcm.tmc.edu:9331/seq-search/struc- predict.html); Wako et al. (1994) Journal of Molecular Biology, 238, 693-708; Mehta et al. (1995) Protein Science 4, 2517-25 (SSPRED;http://www.embl-heidelberg.de/sspred/sspred_ info.html); y King et al. (1996) Protein Sci 5, 2298- 2310. (DSC; http://www.bmm.icnet.uk/dsc/dsc form align.html).

También se puede utilizar un soporte lógico de visualización de la estructura, si se desea, junto con estructuras cristalinas disponibles públicamente para proteínas AARS o distintas de AARS (p. ej., a través de la base de datos Swiss Prot en el servidor NIH Entrez) para visualizar una proteína de interés e identificar motivos estructurales (p.

ej., Accelrys Software Inc., Discovery Studio Modeling Environment, Release 2.0, San Diego: Accelrys Software Inc., 2007). Otras herramientas de soporte lógico ilustrativas disponibles para identificar motivos estructurales secundarios incluyen ESyPred3d (Lambert 2002; ESyPred3D: Prediction of proteins 3D structures. Bioinformatics 18:1250-1256). Las predicciones de la estructura se pueden inspeccionar después visualmente (p. ej., en Accelrys Discovery Visualizer) para determinar los dominios peptídicos que tienen el motivo estructural deseado.

Después de identificar una proteína o polipéptido que contiene un motivo estructural deseado como se describe en la presente memoria (p. ej., que contiene tres láminas β flanqueadas en cada extremo por hélices α), utilizando una o más técnicas adecuadas tales como las comentadas más arriba, se determinan los límites de los aminoácidos del motivo y se pueden producir fragmentos de polipéptidos aislados que contienen el motivo (p. ej., sintéticamente o recombinantemente) y se someten a ensayo para la confirmación de la actividad de señalización celular.

Se dice que un polipéptido de la presente descripción tiene una "actividad de señalización celular" cuando el polipéptido muestra una o más actividades comúnmente asociadas con y/o inducidas por proteínas de señalización celular, ya sea directamente o indirectamente. En ciertas realizaciones de la presente descripción, la actividad de señalización celular es una actividad citoquina y/o quimioquina. Las citoquinas son una categoría de moléculas de señalización celular y las quimioquinas son una familia de citoquinas pequeñas, o proteínas secretadas por las células.

Las proteínas se clasifican generalmente como quimioquinas de acuerdo con características estructurales compartidas tales como el tamaño pequeño (todas tienen un tamaño de aproximadamente 8-10 kilodalton), con la presencia de cuatro residuos de cisteínas en localizaciones conservadas que son clave para formar su conformación tridimensional. Una actividad distintiva de las quimioquinas es su capacidad para actuar como quimioatrayentes para inducir y/o controlar la migración de las células. Las células que son atraídas por las quimioquinas generalmente siguen una señal de concentración que quimioquina creciente hacia la fuente de la quimioquina.

Las quimioquinas sirven para varios papeles biológicos. Algunas quimioquinas controlan las células del sistema inmunitario durante los procesos de vigilancia inmunitaria, tales como el direccionamiento de linfocitos a los ganglios linfáticos de manera que se puedan escrutar para determinar la invasión de patógenos interaccionando con células presentadoras de antígenos que residen en estos tejidos. Estas son conocidas como quimioquinas homeostáticas y son producidas y secretadas sin ninguna necesidad de estimular sus células de origen. Algunas quimioquinas tienen papeles en el desarrollo, tales como la promoción de la angiogénesis (el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos), o la orientación de células a tejidos que proporcionan señales específicas críticas para la maduración celular. Otras quimioquinas son inflamatorias y son liberadas de una amplia variedad de células en respuesta a la infección bacteriana, a virus y a agentes que causan un daño físico. Su liberación es estimulada a menudo por citoquinas pro- inflamatorias tales como la interleuquina 1. Las quimioquinas inflamatorias funcionan principalmente como quimioatrayenes para los leucocitos, reclutando monocitos, neutrófilos y otras células efectoras desde la sangre a sitios de infección o lesión tisular. Ciertas quimioquinas inflamatorias activan las células para iniciar una respuesta inmunitaria o promover la curación de heridas. Éstas son liberadas de muchos tipos de células diferentes y sirven para guiar a las células tanto del sistema inmunitario innato como del sistema inmunitario adaptativo. Las quimioquinas ejercen muchos de los efectos biológicos interaccionando con receptores transmembrana unidos a proteína G denominados receptores de quimioquinas, que se encuentran selectivamente en las superficies de sus células diana.

Dados estos papeles y actividades biológicos, las actividades quimioquina, citoquina o de señalización celular de un polipéptido de la presente descripción se pueden determinar utilizando cualquiera de los numerosos análisis de rutina y reconocidos en la técnica. En cierta realización, la actividad de señalización celular se determina utilizando esencialmente cualquier análisis que mida la quimiotaxis, la migración celular, la liberación de citoquina, la diferenciación celular y/o la viabilidad celular. En realizaciones más específicas de la presente descripción, la actividad quimioquina se determina, por ejemplo, utilizando un análisis que mide la quimiotaxis de monocitos dependiente de GPCR, la liberación de interleuquinas y/o la apoptosis.

Los polipéptidos aislados de la presente descripción pueden tener esencialmente cualquier longitud y pueden ser esencialmente de cualquier origen con tal que proporcionen los elementos necesarios para constituir un motivo estructural que posea la actividad de señalización celular u otra actividad no canónica deseadas.

En ciertas realizaciones ilustrativas descritas en la presente memoria, un polipéptido de la presente descripción tendrá un tamaño que oscilará de aproximadamente 30-100, 30-200, 30-300, 30-400, 30-500, 40-100, 40-200, 40- 300, 40-400, 40-500, 50-100, 50-200, 50-300, 50-400, 50-500, 60-100, 60-200, 60-300, 60-400 o 60-500 aminoácidos.

En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, un polipéptido de la presente descripción es una proteína de mamífero truncada (p. ej., humana) o una variante activa de la misma. Una proteína truncada hace referencia a un polipéptido que es más corto que su correspondiente proteína completa, por ejemplo, debido a la eliminación de aminoácidos de sus extremos N y/o C terminales. El grado de truncamiento, esto es, el número residuos de aminoácido N y/o C terminales eliminados de la proteína completa puede variar considerablemente siempre que todavía proporcione los efectos celulares deseados cuando se administren a una célula, tejido o sujeto, como se describe en la presente memoria. En ciertas realizaciones de la presente descripción, se truncan al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350 aminoácidos, o más, incluyendo todas las longitudes intermedias, del extremo N y/o C de una proteína completa. Se pretende que las longitudes intermedias incluyan todos los números enteros intermedios, por ejemplo, 6, 7, 8, etc., 51, 52, 53, etc., 201, 202, 203, etc.

En otras realizaciones descritas en la presente memoria, un polipéptido de la presente descripción está formado por uno o más fragmentos de una proteína de mamífero, o variantes activas de los mismos. Por ejemplo, en una realización ilustrativa, un polipéptido de la presente descripción está formado por un tramo lineal de aminoácidos contiguos (p. ej., con una longitud dentro de los intervalos indicados anteriormente) derivado de una proteína de mamífero, tal como una proteína humana. Alternativamente, un polipéptido de la presente descripción puede estar formado por fragmentos no contiguos de una proteína de mamífero, en donde los fragmentos no contiguos son suficientes para constituir un motivo estructural como se describe en la presente memoria.

En una realización específica de la presente descripción, el polipéptido es un fragmento de una proteína GlyRS, en donde el fragmento tiene una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización más específica descrita en la presente memoria, el polipéptido es una forma truncada de una proteína GlyRS que comprende los residuos de aminoácido 345-420 de la proteína GlyRS humana mostrada en el SEQ ID NO: 1, o un fragmento activo o una variante del mismo.

En otra realización de la presente descripción, el polipéptido es un fragmento de una proteína AspRS, en donde el fragmento tiene una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización más específica de la presente descripción, el polipéptido es una forma truncada de una proteína AspRS que comprende los residuos de aminoácido 367-448 de la proteína AspRS humana mostrada en el SEQ ID NO: 2, o un fragmento activo o una variante del mismo.

En otra realización de la presente descripción, el polipéptido es un fragmento de una proteína HisRS, en donde el fragmento tiene una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización más específica de la presente descripción, el polipéptido es una forma truncada de una proteína HisRS que comprende los residuos de aminoácido 294-372 de la proteína HisRS humana mostrada en el SEQ ID NO: 3, o un fragmento activo o una variante del mismo.

En otra realización más de la presente descripción, el polipéptido es un fragmento de una proteína ThrRS, en donde el fragmento tiene una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización más específica de la presente descripción, el polipéptido es una forma truncada de una proteína ThrRS que comprende los residuos de aminoácido 469-586 de la proteína ThrRS humana mostrada en el SEQ ID NO: 4, o un fragmento activo o una variante del mismo.

En otra realización de la presente descripción, el polipéptido es un fragmento de una proteína GluProRS, en donde el fragmento tiene una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización más específica de la presente descripción, el polipéptido es una forma truncada de una proteína GluProRS que comprende los residuos de aminoácido 1171-1253 de la proteína GluProRS humana mostrada en el SEQ ID NO: 5, o un fragmento activo o una variante del mismo.

En otra realización de la presente descripción, el polipéptido es un fragmento de una proteína SerRS, en donde el fragmento tiene una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización más específica de la presente descripción, el polipéptido es una forma truncada de una proteína SerRS que comprende los residuos de aminoácido 325-410 de la proteína SerRS humana mostrada en el SEQ ID NO: 6, o un fragmento activo o una variante del mismo.

En otra realización de la presente descripción, el polipéptido es un fragmento de una proteína PheRS, en donde el fragmento tiene una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización más específica de la presente descripción, el polipéptido es un polipéptido PheRS (FRS) que comprende los residuos 380-449 del SEQ ID NO: 7 o un fragmento activo o una variante del mismo.

En otra realización de la presente descripción, el polipéptido es un fragmento de una proteína LysRS, en donde el fragmento tiene una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización más específica de la presente descripción, el polipéptido es un polipéptido LysRS (KRS) que comprende los residuos 425-523 del SEQ ID NO: 8 o un fragmento activo o una variante del mismo.

En otra realización de la presente descripción, el polipéptido es un fragmento de una proteína AsnRS, en donde el fragmento tiene una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización más específica de la presente descripción, el polipéptido es un polipéptido AsnRS (NRS) que comprende los residuos 416-494 del SEQ ID NO: 9 o un fragmento activo o una variante del mismo.

En otra realización de la presente descripción, el polipéptido es un fragmento de una proteína AlaRS, en donde el fragmento tiene una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización más específica de la presente descripción, el polipéptido es un polipéptido AlaRS (ARS) que comprende los residuos 148-258 del SEQ ID NO: 10 o un fragmento activo o una variante del mismo.

En otra realización más de la presente descripción, el polipéptido es un fragmento de una proteína tiorredoxina, en donde el fragmento tiene una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización más específica de la presente descripción, el polipéptido es una forma truncada de una proteína tiorredoxina que comprende los residuos de aminoácido 20-105 de la proteína tiorredoxina humana mostrada en el SEQ ID NO: 11, o un fragmento activo o una variante del mismo.

En otra realización de la presente descripción, el polipéptido es un fragmento de una proteína de factor inhibidor de macrófagos, en donde el fragmento tiene una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización más específica de la presente descripción, el polipéptido es una forma truncada de una proteína de factor inhibidor de macrófagos que comprende los residuos de aminoácido 1-90 de la proteína de factor inhibidor de macrófagos humana mostrada en el SEQ ID NO: 12, o un fragmento activo o una variante del mismo.

En otra realización más de la presente descripción, el polipéptido es un fragmento de una proteína de isoforma B de peroxirredoxina 5 humana, en donde el fragmento tiene una actividad de señalización celular u otra actividad no canónica. En una realización más específica de la presente descripción, el polipéptido es una forma truncada de una isoforma B de peroxirredoxina 5 humana que comprende los residuos de aminoácido 32-68 y 125-161 de la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 13, o un fragmento activo o una variante del mismo.

En otra realización específica de la presente descripción, el polipéptido no es un fragmento de una proteína TrpRS o TyrRS.

En otra realización de la presente descripción, el polipéptido no es un fragmento de HisRS que consiste en los primeros 48 aminoácidos de la proteína HisRS.

En otra realización de la presente descripción, el polipéptido no es un fragmento de tiorredoxina que consiste en los primeros 80 u 84 aminoácidos N-terminales de la proteína tiorredoxina.

La presente descripción proporciona adicionalmente variantes de los polipéptidos descritos en la presente memoria. Las variantes de polipéptidos incluidas en la presente descripción mostrarán típicamente una identidad de al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% (determinada, por ejemplo, como se describe más abajo), en toda su longitud, con la región correspondiente de una secuencia de tipo salvaje o de referencia a partir de la cual derivan.

Una variante de polipéptido puede diferir de un polipéptido natural de la presente descripción en una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones. Tales variantes pueden ser de origen natural o pueden ser generadas sintéticamente, por ejemplo, modificando una o más de las secuencias polipeptídicas anteriores de la descripción y evaluando su actividad biológica como se describe en la presente memoria utilizando cualquiera de los numerosos mecanismos bien conocidos en la técnica.

En otras realizaciones ilustrativas descritas en la presente memoria, la variante puede ser una variante de empalme, ya sea de origen natural o no natural, en donde la variante de empalme posee al menos una actividad no canónica, p. ej., como se describe en la presente memoria.

En otras realizaciones ilustrativas descritas en la presente memoria, la variante contiene una o más mutaciones puntuales con respecto a una secuencia de polipéptido de tipo salvaje o de referencia, ya sea de origen natural o no natural, en donde el polipéptido variante posee al menos una actividad no canónica, p. ej., como se describe en la presente memoria.

En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, una variante contendrá sustituciones conservativas. Una "sustitución conservativa" es aquella en la un aminoácido es sustituido por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de manera que un experto en la técnica esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido permanecieran sustancialmente inalteradas. Se pueden realizar modificaciones en la estructura de los polinucleótidos y polipéptidos de la presente descripción y obtener todavía una molécula funcional que codifique un polipéptido variante o derivado con características deseables. Cuando se desea alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido para crear una variante de un polipéptido equivalente, o incluso mejorada, de la presente descripción, un experto en la técnica, por ejemplo, puede cambiar uno o más codones de la secuencia de ADN codificante de acuerdo con la Tabla 1.

Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos en una estructura de proteína sin una pérdida apreciable de capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, receptores, regiones de unión a antígeno de anticuerpos o sitios de unión sobre una molécula sustrato. Puesto que son la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína las que generalmente definen la actividad funcional biológica de la proteína, se pueden realizar ciertas sustituciones en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de proteína, y, por supuesto, su secuencia codificante de ADN subyacente, y sin embargo obtener una proteína con propiedades similares. De este modo se contempla que se puedan realizar varios cambios en las secuencias de polipéptidos de las composiciones descritas, o secuencias de ADN correspondientes que codifican dichos polipéptidos sin una pérdida apreciable de su utilidad o actividad deseadas.

Tabla 1.

Aminoácidos

Codones

Alanina Ala A GCA GCC GCG GCU Cisteína Cys C UGC UGU Ácido aspártico Asp D GAC GAU Ácido glutámico Glu E GAA GAG Fenilalanina Phe F UUC UUU Glicina gly G GGA GGC GGG GGU Histidina His H CAC CAU Isoleucina Ile I AUA AUC AUU Lisina Lys K AAA AAG Leucina Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU

Aminoácidos

Codones

Metionina Met M AUG Asparragina Asn N AAC AAU Prolina Pro P CCA CCC CCG CCU Glutamina Gln Q CAA CAG Arginina Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU Serina Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU Treonina Thr T ACA ACC ACG ACU Valina Val V GUA GUC GUG GUU Triptófano Trp W UGG Tirosina Tyr Y UAC UAU Al realizar tales cambios, también se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos al conferir la función biológica interactiva a una proteína es generalmente comprendida en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982). Por ejemplo, se sabe que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y similares. Cada aminoácido tiene un índice hidropático asignado basándose en sus características de carácter hidrófobo y carga (Kyte y Doolittle, 1982). Estos valores son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparragina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).

Se sabe en la técnica que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropáticos similares y todavía dan como resultado una proteína con una actividad biológica similar, esto es, todavía se obtiene una proteína biológicamente funcional equivalente. Al realizar tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están en ±2, son particularmente preferidos aquellos en ±1, y son incluso más concretamente preferidos aquellos en ±0,5.

También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares se puede llevar a cabo eficazmente basándose en el carácter hidrófilo. Como se detalla en la Patente de los Estados Unidos 4.554.101, se han asignado los siguientes valores de carácter hidrófilo a los residuos de aminoácido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ±1); serina (+0,3); asparragina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ±1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Se entiende que se puede sustituir un aminoácido por otro que tenga un valor de carácter hidrófilo similar y todavía obtener una proteína biológicamente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de carácter hidrófilo están en ±2, son particularmente preferidos aquellos en ±1, y son incluso aún más particularmente preferidos aquellos en ±0,5.

Como se ha esbozado anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se pueden basar en la similitud relativa de los sustituyentes de las cadenas laterales de los aminoácidos, por ejemplo, su carácter hidrófobo, su carácter hidrófilo, su carga, su tamaño, y similares. Las sustituciones ilustrativas que tienen en consideración varias de las características anteriores son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparragina; y valina, leucina e isoleucina.

Las sustituciones de aminoácidos se pueden realizar adicionalmente basándose en la similitud en la polaridad, la carga, la solubilidad, el carácter hidrófobo, el carácter hidrófilo y/o la naturaleza anfipática de los residuos. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polar no cargados que tienen valores de carácter hidrófilo similares incluyen leucina, isoleucina y valina; glicina y alanina; asparragina y glutamina; y serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Otros grupos de aminoácidos que pueden representar cambios conservativos incluyen: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his. Una variante también puede contener, o alternativamente contiene, cambios no conservativos. En una realización preferida, los polipéptidos variantes difieren de una secuencia nativa por la sustitución, deleción o adición de cinco aminoácidos o menos. Las variantes también se pueden modificar (o alternativamente se modifican), por ejemplo, por medio de la deleción o adición de aminoácidos que tienen una influencia mínima sobre la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido.

Los polipéptidos pueden comprender una secuencia señal (o líder) en el extremo N-terminal de la proteína, que dirige co-traduccionalmente o post-traduccionalmente la transferencia de la proteína. El polipéptido también se puede conjugar con un conector o con otra secuencia para facilitar la síntesis, purificación o identificación del polipéptido (p. ej., poli-His), o para intensificar la unión del polipéptido a un soporte sólido. Por ejemplo, se puede conjugar un polipéptido a una región Fc de inmunoglobulina.

Cuando se comparan secuencias de polipéptidos, se dice que dos secuencias son "idénticas" si las secuencias de aminoácidos de las dos secuencias son iguales cuando se alinean para una correspondencia máxima, como se describe más abajo. Las comparaciones entre dos secuencias se llevan a cabo típicamente comparando las secuencias a lo largo de una ventana de comparación para identificar y comparar las regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación" según se utiliza en la presente memoria, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, normalmente de 30 a aproximadamente 75, de 40 a aproximadamente 50, en el que una secuencia se puede comparar con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de alinear óptimamente las dos secuencias.

El alineamiento óptimo de secuencias para la comparación se puede llevar a cabo, por ejemplo, utilizando el programa Megalign del conjunto de soporte lógico bioinformático Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI), utilizando los parámetros por defecto. Este programa incorpora varios esquemas de alineamiento descritos en las siguientes referencias:Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. En Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Supl. 3, págs. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes págs. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. y Sharp, P.M. (1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. y Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. y Sokal, R.R. (1973) Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W. J. y Lipman, D. J. (1983) Proc. Nat'l Acad., Sci. USA 80:726-730.

Alternativamente, el alineamiento óptimo de secuencias para su comparación se puede llevar a cabo mediante el algoritmo de identidad local de Smith y Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482, mediante el algoritmo de alineamiento de identidad de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, mediante la búsqueda de métodos de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección.

Los ejemplos de los algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que han sido descritos por Altschul et al. (1977) Nucl.

Acids Res. 25:3389-3402 y Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. Se pueden utilizar BLAST y BLAST 2.0, por ejemplo con los parámetros descritos en la presente memoria, para determinar el porcentaje de identidad de secuencia para los polinucleótidos y polipéptidos de la presente descripción. El soporte lógico para llevar a cabo los análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information. Para las secuencias de aminoácidos, se puede utilizar una matriz de puntuación para calcular la puntuación cumulativa. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se para cuando: la puntuación acumulativa de alineamiento cae por la cantidad X desde su máximo valor conseguido; la puntuación acumulativa va a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos con puntuación negativa; o se alcance el final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento.

En un enfoque ilustrativo, el "porcentaje de identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo de una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, en donde la porción de la secuencia de polipéptidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (esto es, huecos) de 20 por ciento o menos, normalmente 5 a 15 por ciento, o 10 a 12 por ciento, en comparación con las secuencias de referencia (que no comprenden adiciones ni deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las cuales existen residuos de aminoácidos idénticos en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la secuencia de referencia (esto es, el tamaño de la ventana) y multiplicando los resultados por 100 para obtener el porcentaje de identidad de las secuencias.

En ciertas realizaciones de la presente descripción, se proporcionan polipéptidos de fusión, y polinucléotidos que codifican los polipéptidos de fusión. Los polipéptidos de fusión hacen referencia a polipéptidos de la presente descripción que se han conectado covalentemente, o bien directamente o bien indirectamente a través de un conector de aminoácidos, a una o más secuencias de polipéptidos heterólogas (compañeros de fusión). Los polipéptidos que forman la proteína de fusión están unidos típicamente del extremo C al extremo N, aunque también pueden unirse del extremo C al extremo C, extremo N a extremo N, o extremo N a extremo C. Los polipéptidos de la proteína de fusión pueden estar en cualquier orden.

El compañero de fusión puede ser diseñado e incluido esencialmente para cualquier propósito deseado siempre que no afecte adversamente a la actividad deseada del polipéptido. Por ejemplo, en una realización, un compañero de fusión comprende una secuencia que ayuda a expresar la proteína (un intensificador de la expresión) a rendimientos superiores a los de la proteína recombinante nativa. Otros compañeros de fusión pueden seleccionarse para incrementar la solubilidad de la proteína o para permitir que la proteína sea dirigida a compartimentos intracelulares deseados. Otros compañeros de fusión adicionales incluyen etiquetas de afinidad, que facilitan la purificación de la proteína.

Las proteínas de fusión pueden prepararse generalmente usando técnicas convencionales. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican los componentes del polipéptido de una fusión deseada pueden ensamblarse separadamente, y ligarse en un vector de expresión apropiado. El extremo 3' de la secuencia de ADN que codifica un componente del polipéptido se liga, con o sin un conector peptídico, al extremo 5' de una secuencia de ADN que codifica el segundo componente del polipéptido de manera que los marcos de lectura de las secuencias están en fase. Esto permite la traducción en una única proteína de fusión que retiene la actividad biológica de ambos polipéptidos componentes.

Puede emplearse una secuencia de conector peptídico para separar el primer y segundo componentes del polipéptido por una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliega en sus estructuras secundaria y terciaria, si se desea. Dicha secuencia de conector peptídico se incorpora a la proteína de fusión usando mecanismos convencionales muy conocidos en la técnica. Determinadas secuencias de conector peptídico pueden elegirse tomando como base los factores siguientes: (1) su capacidad de adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad de adoptar una estructura secundaria que podría interaccionar con epítopos funcionales en el primer y segundo polipéptido; y (3) la ausencia de residuos hidrófobos o cargados que podrían reaccionar con los epítopos funcionales del polipéptido. Las secuencias de conector peptídico preferidas contienen residuos Gly, Asn y Ser. También pueden usarse otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala en la secuencia conectora. Las secuencias de aminoácidos que pueden emplearse de manera útil como conectores incluyen las descritas en Maratea et al., Gene 40:39 46 (1985); Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258 8262 (1986); Patente de los Estados Unidos Núm. 4.935.233 y Patente de los Estados Unidos Núm. 4.751.180. La secuencia conectora puede tener una longitud generalmente de 1 a aproximadamente 50 aminoácidos. Las secuencias conectoras no se requieren cuando el primer y segundo polipéptido tienen regiones de aminoácidos no esenciales N-terminales que pueden usarse para separar los dominios funcionales y evitar la interferencia estérica.

Las secuencias de ADN ligadas están conectadas operablemente a elementos reguladores de la transcripción o la traducción adecuados. Los elementos reguladores responsables de la expresión del ADN están localizados 5' con respecto a la secuencia de ADN que codifica los primeros polipéptidos. De manera similar, los codones de parada requeridos para terminar la traducción y las señales de terminación de la transcripción están presentes 3' con respecto a la secuencia de ADN que codifica el segundo polipéptido.

En general, los polipéptidos y polipéptidos de fusión (así como sus polinucleótidos codificantes) están aislados. Un polipéptido o polinucleótido "aislado" es uno que se retira de su entorno original. Por ejemplo, una proteína natural está aislada si se separa de parte o todos los materiales que coexisten en el sistema natural. Preferiblemente, dichos polipéptidos son al menos aproximadamente 90% puros, más preferiblemente al menos aproximadamente 95% y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 99% puros. Un polinucleótido se considera que está aislado si, por ejemplo, se clona en un vector que no es parte del entorno natural.

En otras realizaciones más descritas en la presente memoria, un polipéptido de la presente descripción puede ser parte de un dímero. Los dímeros pueden incluir, por ejemplo, homodímeros entre dos polipéptidos AARS idénticos, heterodímeros entre dos polipéptidos AARS diferentes (p. ej., un polipéptido GlyRS completo y un polipéptido GlyRS truncado, o dos polipéptidos AARS truncados diferentes), y/o heterodímeros entre un polipéptido AARS y un polipéptido heterólogo. Los monómeros y/o dímeros pueden ser solubles y pueden ser aislados o purificados hasta la homogeneidad. Ciertos heterodímeros, tales como aquellos entre un polipéptido AARS y un polipéptido heterólogo, pueden ser bifuncionales.

Asimismo se describen en la presente memoria proteínas monoméricas o sustancialmente monoméricas. En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, una proteína monomérica tiene una capacidad reducida para dimerizarse consigo misma (es decir, homodimerizarse) y/o para dimerizar con otro polipéptido AARS (esto es,heterodimerizar).

En otras realizaciones descritas en la presente memoria, un polipéptido de la presente descripción puede ser parte de un complejo multi-unitario. Un complejo multi-unitario de la presente descripción puede incluir, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, o 5 o más monómeros. Los monómeros y/o los complejos multi-unitarios pueden ser solubles y se pueden aislar o purificar hasta su homogeneidad. Las unidades monoméricas de un complejo multiunitario pueden ser diferentes, homólogas, sustancialmente homólogas, o idénticas entre sí. No obstante, un complejo multi-unitario de la presente descripción incluye al menos un monómero que comprende un polipéptido como se describe en la presente memoria o, en otras realizaciones descritas en la presente memoria, al menos dos o más polipéptidos, como se describe en la presente memoria.

Los monómeros conectados covalentemente se pueden conectar directamente (por medio de enlaces) o indirectamente (p. ej., a través de un conector). Para conectar directamente los monómeros de polipéptidos en la presente memoria, puede resultar beneficioso modificar los polipéptidos de la presente memoria para intensificar la dimerización o la multimerización. Por ejemplo, se pueden modificar uno o más residuos de aminoácido de un polipéptido AARS mediante la adición o sustitución por una o más cisteínas. Los métodos para crear sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones de cisteína, u otras modificaciones para facilitar la conexión, son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Ciertas realizaciones de la presente descripción también contemplan el uso de AARS modificados u otros polipéptidos, incluyendo modificaciones que mejoran las características deseadas de un AARS u otro polipéptido, como se describe en la presente memoria. Las modificaciones ilustrativas de los polipéptidos AARS de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, derivatizaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constitutivos, incluyendo modificaciones de la cadena lateral, modificaciones de la cadena principal, y modificaciones N y C terminales incluyendo, hidroxilación, metilación, amidación, y el anclaje de radicales carbohidratados o lipídicos, cofactores, y similares. Las modificaciones ilustrativas también incluyen la pegilación de polipéptidos (véase, p. ej., Veronese y Harris, Advanced Drug Delivery Reviews 54: 453-456, 2002).

En ciertos aspectos de la presente descripción, se puede utilizar la tecnología de ligación quimioselectiva para modificar polipéptidos truncados de la presente descripción, por ejemplo atrayendo polímeros de una manera específica del sitio y controlada. Dicha tecnología se basa típicamente en la incorporación de anclajes quimioselectivos en el núcleo de la proteína bien por medios químicos o recombinantes, y la modificación posterior con un polímero que porta un conector complementario. Como resultado, el proceso de ensamblaje y la estructura covalente del conjugado proteína-polímero resultante puede controlarse, permitiendo la optimización racional de las propiedades del fármaco, tal como eficacia y propiedades farmacocinéticas (véase, por ejemplo, Kochendoerfer, Current Opinion in Chemical Biology 9:555-560, 2005).

Los polipéptidos AARS descritos en la presente memoria se pueden preparar mediante cualquier procedimiento adecuado conocido por los expertos en la técnica, tal como mediante mecanismos recombinantes. Por ejemplo, se pueden preparar polipéptidos mediante un procedimiento que incluye las etapas de: (a) preparar un constructo que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido AARS de la presente descripción y que está conectado operablemente a un elemento regulador; (b) introducir el constructo en una célula anfitriona; (c) cultivar la célula anfitriona para expresar el polipéptido; y (d) aislar el polipéptido de la célula anfitriona. Los polipéptidos AARS recombinantes se pueden preparar convenientemente utilizando protocolos convencionales como describen por ejemplo en Sambrook, et al., (1989, supra), en particular en las Secciones 16 y 17; Ausubel et al.,

(1994, supra), en particular los Capítulos 10 y 16; y Coligan et al., Current Protocols in Protein Science (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1997), en particular los Capítulos 1, 5 y 6.

Además de los métodos de producción recombinante, los polipéptidos de la presente descripción pueden ser producidos mediante síntesis peptídica directa utilizando técnicas en fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)). La síntesis de proteínas puede llevarse a cabo usando técnicas manuales o automatizadas.

La síntesis automatizada puede conseguirse, por ejemplo, usando el Sintetizador de Péptidos Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer). Alternativamente, varios fragmentos pueden sintetizarse químicamente separadamente y combinarse usando métodos químicos para producir la molécula deseada.

Composiciones de polinucleótido

La presente descripción también proporciona polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos de la presente descripción, así como también composiciones que comprenden tales polinucleótidos. Por ejemplo, las secuencias de polinucleótidos que codifican proteínas ARNt sintetasa, y otras proteínas descritas en la presente memoria, son fácilmente asequibles a través de cualquiera de las numerosas bases de datos de secuencias públicas (p. ej., http://www.ncbi.nlm.nih.gov) y pueden ser identificadas, elaboradas y utilizadas en el contexto de la presente descripción utilizando mecanismos y metodologías descritos en la presente memoria y/o bien establecidos en la técnica.

Según se utilizan en la presente memoria, los términos "ADN" y "polinucleótido" y "ácido nucleico" se refieren a una molécula de ADN que se ha aislado y que carece de ADN genómico total de un especie concreta. Por lo tanto, un segmento de ADN que codifica un polipéptido se refiere a un segmento de ADN que contiene una o más secuencias codificantes y que aún así está sustancialmente aislado de, o purificado careciendo de, ADN genómico total de la especie del que se obtiene el segmento de ADN. Incluidos en los términos "segmento de ADN" y "polinucleótido" están segmentos de ADN y fragmentos menores de dichos segmentos, y también vectores recombinantes, incluyendo, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagémidos, fagos, virus, y similares.

Como comprenderán los expertos en la técnica, las secuencias de polinucleótidos de esta descripción pueden incluir secuencias genómicas, secuencias extragenómicas y codificadas por plásmidos y segmentos génicos modificados más pequeños que expresan, o se pueden adaptar para que expresen, proteínas, polipéptidos, péptidos y similares. Dichos segmentos pueden aislarse naturalmente, o modificarse sintéticamente por la mano del hombre.

Como reconocerá el experto en la técnica, los polinucleótidos pueden ser monocatenarios (codificantes o antisentido) o bicatenarios, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintético) o ARN. Pueden estar presentes, pero no es necesario, otras secuencias codificantes o no codificantes, en un polinucleótido de la presente descripción, y un polinucleótido puede, pero no es necesario, estar conectado, a otras moléculas y/o materiales de soporte.

Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (esto es, una secuencia endógena que codifica un polipéptido de la presente descripción o una porción del mismo) o pueden comprender una variante, o un equivalente funcional biológico de semejante secuencia. Las variantes de polinucleótidos pueden contener una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones, como se describe adicionalmente más abajo, preferiblemente de manera que la actividad deseada del polipéptido codificado no disminuya sustancialmente con respecto al polipéptido no modificado. El efecto sobre la actividad del polipéptido codificado se puede evaluar generalmente como se describe en la presente memoria.

En realizaciones adicionales descritas en la presente memoria, la presente descripción proporciona polinucleótidos aislados que comprenden varias longitudes de tramos contiguos de secuencia idéntica o complementaria a un polinucleótido que codifica un polipéptido como se describe en la presente memoria.

Por ejemplo, esta descripción proporciona polinucleótidos que codifican al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500, o más, residuos de aminoácido contiguos de un polipéptido de la presente descripción, así como también todas las longitudes intermedias. Se comprenderá fácilmente que "longitudes intermedias", en este contexto, puede ser cualquier longitud entre los valores citados, tales como 101, 102, 103, etc.; 151, 152, 153, etc.; 201, 202, 203, etc.

Los polinucleótidos de la presente descripción, con independencia de la longitud de la propia secuencia codificante, se pueden combinar con otras secuencias de ADN, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios para enzimas de restricción adicionales, sitios de clonación múltiples, otros segmentos codificantes, y similares, de manera que su longitud global puede cambiar considerablemente. Se contempla, por lo tanto, que puede emplearse un fragmento de polinucleótido de casi cualquier longitud, estando limitada la longitud total preferiblemente para facilitar la preparación y uso en el protocolo de ADN recombinante pretendido.

Por otra parte, los expertos en la técnica apreciarán que, como resultado de la degeneración del código genético, existen muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido como se describe en la presente memoria. Algunos de estos polinucleótidos guardan una homología mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. A pesar de ello, los polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso de codones son específicamente contemplados por la presente descripción, por ejemplo los polinucleótidos que están optimizados para la selección de codones en seres humanos y/o primates. Adicionalmente, los alelos de los genes que comprenden las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en la presente memoria están dentro del alcance de la presente descripción. Los alelos son genes endógenos que están alterados como resultado de una o más mutaciones, tales como deleciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos. El ARNm y la proteína resultantes pueden, pero no necesitan, tener una estructura o función alterada. Los alelos pueden ser identificados utilizando técnicas convencionales (tales como hibridación, amplificación y/o comparación de secuencias de bases de datos).

Los polinucleótidos y fusiones de éstos pueden prepararse, manipularse y/o expresarse usando cualquiera de una variedad de mecanismos bien establecidos conocidos y disponibles en la técnica. Por ejemplo, se pueden utilizar secuencias de polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la presente descripción, o proteínas de fusión o equivalentes funcionales de las mismas, en moléculas de ADN recombinantes para dirigir la expresión de un polipéptido en células anfitrionas apropiadas. Debido a la degeneración inherente del código genético, pueden producirse otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos o una funcionalmente equivalente y estas secuencias pueden usarse para clonar y expresar un polipéptido dado.

Como entenderán los expertos en la técnica, puede ser ventajoso en algunos casos producir secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que poseen codones no naturales. Por ejemplo, los codones preferidos para un anfitrión procariota o eucariota particular pueden seleccionarse para incrementar la proporción de la expresión de la proteína o para producir un transcrito de ARN recombinante que tiene propiedades deseables, tales como una vida media que es mayor que la de un transcrito generado a partir de una secuencia natural.

Por otra parte, las secuencias de polinucleótidos de la presente descripción se pueden modificar utilizando métodos generalmente conocidos en la técnica con el fin de alterar las secuencias que codifican los polipéptidos por una variedad de razones, incluyendo pero no limitadas a, alteraciones que modifican la clonación, el procesamiento, la expresión y/o la actividad del producto génico.

Con el fin de expresar un polipéptido deseado, se pueden insertar una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, o un equivalente funcional, en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada. Los métodos que son muy conocidos para los expertos en la técnica pueden usarse para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican un polipéptido de interés y elementos de control apropiados de la transcripción y traducción. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo. Dichas técnicas se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989), y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1989).

Se conoce una variedad de sistemas de vectores de expresión/anfitrión y pueden utilizarse para contener y expresar secuencias de polinucleótido. Éstos incluyen, pero no están limitados a, microorganismos tales como bacterias transformadas con bacteriófago recombinante, vectores de expresión de ADN en plásmido, o cósmido; levaduras transformadas con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus (p. ej., baculovirus); sistemas de células de plantas transformadas con vectores de expresión de virus (p. ej., virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacterianos (p. ej., plásmidos Ti o pBR322); o sistemas de células animales.

Los "elementos de control" o "secuencias reguladoras" presentes en un vector de expresión son aquellas regiones no traducidas del vector--intensificadores, promotores, regiones no traducidas 5' y 3'--que interaccionan con proteínas celulares del anfitrión para llevar a cabo la transcripción y la traducción. Dichos elementos pueden variar en su fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema vector y anfitrión utilizado, puede usarse cualquier número de elementos de la transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clonan en sistemas bacterianos, se pueden utilizar promotores inducibles tales como el promotor lacZ híbrido del fagémido PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Calif.) o el plásmido PSPORT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, Md.) y similares. En sistemas de células de mamíferos, se prefieren generalmente los promotores de genes de mamíferos o de virus de mamíferos. Si es necesario generar una línea celular que contiene múltiples copias de la secuencia que codifica un polipéptido, pueden usarse ventajosamente los vectores basados en SV40 o EBV con un marcador seleccionable apropiado.

En sistemas bacterianos, pueden seleccionarse varios vectores de expresión dependiendo del uso pretendido del polipéptido expresado. Por ejemplo, cuando se necesitan grandes cantidades, pueden usarse vectores que dirigen la expresión a alto nivel de proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Dichos vectores incluyen, pero no están limitados a, la clonación multifuncional en E. coli y vectores de expresión tales como BLUESCRIPT (Stratagene), en el que la secuencia que codifica el polipéptido de interés puede ligarse en el vector en marco con secuencias para la Met amino-terminal y los 7 residuos posteriores de β-galactosidasa de manera que se produce una proteína híbrida; los vectores pIN (Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503 5509 (1989)); y similares, vectores pGEX (Promega, Madison, Wis.) también pueden usarse para expresar polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente de las células lisadas por adsorción a lechos de glutatión-agarosa seguido de elución en presencia de glutatión libre. Las proteínas preparadas en dichos sistemas pueden diseñarse para incluir sitios de escisión de heparina, trombina, o factor XA proteasa de manera que el polipéptido clonado de interés puede liberarse del radical GST cuando se desee.

En la levadura Saccharomyces cerevisiae, pueden usarse varios vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles tales como factor alfa, alcohol oxidasa, y PGH. Para revisiones, véase Ausubel et al. (supra) y Grant et al., Methods Enzymol. 153:516-544 (1987).

En los casos en los que se usan vectores de expresión de plantas, la expresión de secuencias que codifican polipéptidos puede estar dirigida por cualquiera de varios promotores. Por ejemplo, pueden usarse promotores virales tales como promotores 35S y 19S de CaMV solos o combinados con la secuencia líder omega de TMV (Takamatsu, EMBO J. 6:307-311 (1987)). Alternativamente, pueden usarse promotores de plantas tales como la subunidad pequeña de RUBISCO o promotores de choque térmico (Coruzzi et al., EMBO J. 3:1671-1680 (1984); Broglie et al., Science 224:838-843 (1984); y Winter et al., Results Probl. Cell Differ. 17:85-105 (1991)). Estos constructos pueden introducirse en células de planta por transformación de ADN directa o transfección mediada por patógeno. Dichas técnicas se describen en varias revisiones disponibles generalmente (véase, p. ej., Hobbs en McGraw Hill, Yearbook of Science and Technology, págs. 191-196 (1992)).

También puede usarse un sistema de insecto para expresar un polipéptido de interés. Por ejemplo, en uno de dichos sistemas, se usa el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como un vector para expresar genes foráneos en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. Las secuencias que codifican el polipéptido pueden clonarse en una región no esencial del virus, tal como el gen de polihedrina, y ponerse bajo el control del promotor de polihedrina. La inserción exitosa de la secuencia que codifica el polipéptido dará lugar al gen de polihedrina inactivo y producirá virus recombinantes que carecen de proteína de la cubierta. Los virus recombinantes pueden usarse para infectar, por ejemplo, células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que el polipéptido de interés puede expresarse (Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:3224-3227 (1994)).

En células anfitrionas de mamífero, están disponibles generalmente varios sistemas de expresión basados en virus. Por ejemplo, en los casos en los que se usa un adenovirus como un vector de expresión, las secuencias que codifican un polipéptido de interés pueden ligarse en un complejo de transcripción/traducción de adenovirus que consiste en el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. La inserción en una región no esencial E1 o E3 del genoma viral puede usarse para obtener un virus viable que es capaz de expresar el polipéptido en células anfitrionas infectadas (Logan y Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3655-3659 (1984)). Además, se pueden utilizar intensificadores de la transcripción, tales como el intensificador del virus del sarcoma de Rous (RSV), para incrementar la expresión en células anfitrionas de mamífero.

También pueden usarse señales de inicio específicas para conseguir una traducción más eficiente de secuencias que codifican un polipéptido de interés. Dichas señales incluyen el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. En los casos en los que se insertan secuencias que codifican el polipéptido, su codón de inicio, y secuencias aguas arriba en el vector de expresión adecuado, pueden no necesitarse señales de control de la transcripción o traducción adicionales. Sin embargo, en los casos en los que se inserta sólo la secuencia codificante, o una parte de ésta, deben proporcionarse señales de control de la traducción exógenas incluyendo el codón de inicio ATG. Además, el codón de inicio debe estar en el marco de lectura correcto para asegurar la traducción del inserto completo. Los elementos de la traducción exógenos y codones de inicio pueden tener varios orígenes, tanto natural como sintético. La eficacia de la expresión se puede intensificar por medio de la inclusión de intensificadores que son apropiados para el sistema de células concreto que se utilice, tales como los descritos en la bibliografía (Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125-162 (1994)).

Además, una cepa de célula anfitriona puede elegirse por su capacidad de modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada en la forma deseada. Dichas modificaciones del polipéptido incluyen, pero no están limitadas a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación, y acilación. El procesamiento posterior a la traducción que escinde una forma "prepro" de la proteína también puede usarse para facilitar la inserción, plegamiento y/o función correctos. Pueden elegirse diferentes células anfitrionas tales como CHO, HeLa, MDCK, HEK293, y W138, que tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos para dichas actividades posteriores a la traducción, para asegurar la modificación y procesamiento correctos de la proteína foránea.

Para una producción a largo plazo, con alto rendimiento, de las proteínas recombinantes, se prefiere generalmente la expresión estable. Por ejemplo, pueden transformarse líneas celulares que expresan de manera estable un polinucleótido de interés usando vectores de expresión que pueden contener orígenes virales de replicación y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable en el mismo vector o en un vector separado. Después de la introducción del vector, puede dejarse que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiarlas a medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y recuperación de las células que expresan con éxito las secuencias introducidas. Los clones resistentes de células transformadas de manera estable pueden proliferar usando técnicas de cultivo tisular apropiadas para el tipo celular.

Puede usarse cualquier número de sistemas de selección para recuperar las líneas celulares transformadas. Éstos incluyen, pero no están limitados a, los genes de timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., Cell 11:223-232 (1977)) y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22:817-823 (1990)) que pueden emplearse en células tk- o aprt-, respectivamente. También puede usarse resistencia a antimetabolito, antibiótico o herbicida como la base de la selección; por ejemplo, dhfr que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:3567-70 (1980)); npt, que confiere resistencia a los aminoglicósidos, neomicina y G-418 (Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1-14 (1981)); y als o pat, que confieren resistencia a clorsulfurón y fosfinotricina acetiltransferasa, respectivamente (Murry, supra). Se han descrito genes seleccionables adicionales, por ejemplo, trpB, que permite a las células utilizar indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite a las células utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8047-51 (1988)). El uso de marcadores visibles ha ganado popularidad con marcadores tales como antocianinas, β-glucuronidasa y su sustrato GUS, y luciferasa y su sustrato luciferina, siendo usados ampliamente no sólo para identificar transformantes, sino también para cuantificar la cantidad de expresión de proteína temporal o estable atribuible a un sistema de vector específico (Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55:121-131 (1995)).

En la técnica se conoce una variedad de protocolos para detectar y medir la expresión de productos codificados por polinucleótidos, usando bien anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para el producto. Los ejemplos incluyen el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), y separación de células activada por fluorescencia (FACS). Éstos y otros ensayos se describen, entre otros lugares, en Hampton et al., Serological Methods, a Laboratory Manual (1990) y Maddox et al., J. Exp. Med. 158:1211-1216 (1983).

Los expertos en la técnica conocen una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación y pueden usarse en varios ensayos de ácidos nucleicos y aminoácidos. Los medios para producir sondas marcadas de hibridación o PCR para detectar secuencias relacionadas con los polinucleótidos incluyen oligomarcaje, traslación de mella, y marcaje terminal o amplificación por PCR usando un nucleótido marcado. Alternativamente, las secuencias, o cualquier parte de éstas pueden clonarse en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Dichos vectores son conocidos en la técnica, están disponibles comercialmente, y pueden usarse para sintetizar sondas de ARN in vitro por la adición de una ARN polimerasa apropiada tal como T7, T3, o SP6 y nucleótidos marcados. Estos procedimientos pueden llevarse a cabo usando una variedad de kits disponibles comercialmente. Las moléculas informadoras o marcas adecuadas, que pueden usarse incluyen radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes, o cromogénicos así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas, y similares.

Las células anfitrionas transformadas con una secuencia de polinucleótido de interés pueden cultivarse en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína del cultivo celular. La proteína producida por una célula recombinante puede secretarse o estar contenida intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o del vector usado. Como comprenderán los expertos en la técnica, los vectores de expresión que contienen los polinucleótidos de la presente descripción se pueden diseñar para que contengan secuencias señal que dirijan la secreción del polipéptido codificado a través de una membrana celular procariótica o eucariótica. Pueden usarse otras construcciones recombinantes para unir secuencias que codifican un polipéptido de interés a la secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de polipéptido que facilitará la purificación de proteínas solubles.

Además de los métodos de producción recombinante, los polipéptidos de la presente descripción, y los fragmentos de los mismos, pueden ser producidos mediante síntesis peptídica directa utilizando técnicas en fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)). La síntesis de proteínas puede llevarse a cabo usando técnicas manuales o automatizadas. La síntesis automatizada puede conseguirse, por ejemplo, usando el Sintetizador de Péptidos Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer). Alternativamente, se pueden sintetizar químicamente por separado diversos fragmentos y combinarlos utilizando métodos químicos para producir la molécula completa.

De acuerdo con otro aspecto de la presente descripción, los polinucleótidos que codifican polipéptidos de la presente descripción se pueden liberar en un sujeto in vivo, p. ej., utilizando técnicas de terapia génica. La terapia génica se refiere en general a la transferencia de ácidos nucleicos heterólogos a ciertas células, células diana, de un mamífero, concretamente un ser humano, con un trastorno o afecciones para los cuales se procura semejante terapia. El ácido nucleico es introducido en las células diana seleccionadas de manera que se exprese el ADN heterólogo y se produzca un producto terapéutico codificado de ese modo.

Los diversos vectores virales que se pueden utilizar para la terapia génica como se ilustra en la presente memoria incluyen adenovirus, virus herpes, vaccinia, virus adeno-asociados (AAV), o, preferiblemente, un virus con ARN tal como un retrovirus. Preferiblemente, el vector retroviral es un derivado de un vector retrovirus murino o aviar, o es un vector lentiviral. El vector retroviral preferido es un vector lentiviral. Los ejemplos de los vectores retrovirales en los que se puede insertar un único gen foráneo incluyen, pero no se limitan a: virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus del tumor mamario murino (MuMTV), SIV, BIV, VIH y virus del Sarcoma de Rous (RSV). Numerosos vectores retrovirales adicionales pueden incorporar múltiples genes. Todos estos vectores pueden transferir o incorporar un gen para un marcador seleccionable de manera que las células transducidas puedan ser identificadas y generadas. Insertando una secuencia de polipéptido de unión a ADN derivada de un dedo de cinc de interés en el vector viral, junto con otro gen que codifica el ligando para un receptor sobre una célula diana específica, por ejemplo, el vector se puede volver específico de la diana. Los vectores retrovirales se pueden volver específicos de la diana insertando, por ejemplo, un polinucléotido que codifica una proteína (dímero). Se puede lograr un direccionamiento ilustrativo utilizando un anticuerpo para dirigir el vector retroviral. Los expertos en la técnica sabrán, o podrán averiguar fácilmente sin experimentación indebida, secuencias de polinucleótidos específicas que se pueden insertar en el genoma retroviral para permitir la liberación específica de la diana del vector retroviral que contiene el polinucleótido de la proteína de unión al dedo de cinc.

Puesto que los retrovirus recombinantes son defectuosos, requieren ayuda para producir partículas de vector infecciosas. Esta ayuda puede ser proporcionada, por ejemplo, utilizando líneas celulares coadyuvantes que contienen plásmidos que codifican todos los genes estructurales del retrovirus bajo el control de secuencias reguladoras dentro de la LTR. En estos plásmidos falta una secuencia de nucleótidos que permita que el mecanismo de empaquetamiento reconozca un transcrito de ARN para la encapsulación. Las líneas celulares coadyuvantes que tienen deleciones de la señal de empaquetamiento incluyen, pero no se limitan a PSI.2, PA317 y PA12, por ejemplo. Estas líneas celulares producen viriones vacíos, ya que no hay genoma empaquetado. Si se introduce un vector retroviral en tales células en las que la señal de empaquetamiento está intacta, pero se remplazan los genes estructurales por otros genes de interés, el vector puede ser empaquetado y el virión de vector producido. Los viriones de vector producidos mediante este método se pueden utilizar a continuación para infectar una línea celular de tejido, tal como las células NIH 3T3, para producir grandes cantidades de viriones retrovirales quiméricos.

También se pueden utilizar técnicas de liberación "no virales" para la terapia génica incluyendo, por ejemplo, complejos de ADN-ligando, complejos de adenovirus-ligando-ADN, inyección directa de ADN, precipitación de CaPO4, técnicas de pistola génica, electroporación, liposomas, lipofección, y similares. Cualquiera de estos métodos está ampliamente disponible para un experto en la técnica y sería adecuado para su uso en la presente descripción.

Otros métodos adecuados se encuentran disponibles para un experto en la técnica, y se debe entender que lapresente descripción puede completarse utilizando cualquiera de los métodos de transfección disponibles. La lipofección se puede completar encapsulando una molécula de ADN aislada dentro de una partícula liposomal y poniendo en contacto la partícula liposomal con la membrana celular de la célula diana. Los liposomas son partículas coloidales, auto-ensamblantes, en las que una bicapa lipídica, compuesta por moléculas anfífilas tales como fosfatidilserina o fosfatidilcolina, encapsula una porción del medio circundante de manera que la bicapa lipídica rodea un interior hidrófilo. Se pueden construir liposomas unilamelares o multilamelares de manera que el interior contenga un agente químico, un fármaco, o, como en la presente descripción, una molécula de ADN aislada, deseados.

Las realizaciones de la presente descripción también incluyen oligonucleótidos (p. ej., oligómeros antisentido, sondas, cebadores), ya sea para la detección, para la amplificación, para terapias antisentido, o para otro fin. Los oligonucleótidos comprenden típicamente o son complementarios a al menos una porción de una secuencia de polinucleótido de AARS. Para estos fines y fines relacionados, se pretende que el término "oligonucleótido" u "oligo" u "oligómero" incluya un "oligonucleótido" singular, así como también "oligonucleótidos" plurales, y se refiera a cualquier polímeros de dos o más nucleótidos, nucleósidos, nucleobases o compuestos relacionados utilizados como reactivo en los métodos de amplificación de la presente descripción, así como también en los métodos de detección subsiguientes. El oligonucleótido puede ser ADN y/o ARN y/o análogos de los mismos.

En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, pueden ser adecuados oligómeros tales como oligómeros antisentido tan largos como de 40 bases, en los que al menos un número mínimo de bases, p. ej., 10-12 bases, son complementarias a la secuencia diana (p. ej., una secuencia de polinucleótido de AARS). En general, sin embargo, la absorción favorecida o activa en las células se optimiza a longitudes de oligómeros menores de aproximadamente 30. Para ciertos oligómeros, descritos adicionalmente más abajo, se produce un equilibrio óptimo de estabilidad de unión y absorción a longitudes de 18-25 bases. Se describen en la presente memoria oligómeros antisentido (p. ej., PNA, LNA, 2'-OMe, MOE, morfolino) que consisten en aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40 bases, en los que al menos aproximadamente 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40 bases contiguas o no contiguas son complementarias a su secuencia diana de AARS, o variantes de la misma.

Ciertas realizaciones descritas en la presente memoria se refieren a agentes de interferencia de ARN (ARNi), tales como ARN de interferencia pequeño (ARNip) u otros agentes ARNip, que dirigen uno o más transcritos de ARNm de un polinucleótido de AARS. Para ciertas realizaciones relacionadas con ARNip descritas en la presente memoria, cada hebra de un agente ARNip puede tener una longitud igual o menor de 35, 30, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, o 15 nucleótidos. La hebra tiene preferiblemente al menos 19 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, cada hebra puede tener entre 21 y 25 nucleótidos de longitud. Los agentes ARNip preferidos tienen una región dúplex de 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24, o 25 pares de nucleótidos, y uno o más salientes, preferiblemente uno o dos salientes 3', de 2- 3 nucleótidos. También se describen en la presente memoria los métodos de uso de los mismos para modular los niveles de un transcrito de AARS seleccionado, tal como un polinucleótido de AARS que codifica un motivo como se describe en la presente memoria.

Como se ha observado anteriormente, los polinucleótidos de AARS de la presente descripción se pueden utilizar en cualquiera de los métodos de diagnóstico, descubrimiento de fármacos, o terapéuticos descritos en la presente memoria.

Composiciones de anticuerpo, fragmentos de los mismos y otros agentes de unión

De acuerdo con otro aspecto descrito en la presente memoria, la presente descripción proporciona adicionalmente agentes de unión, tales como anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, receptores solubles, péptidos, peptidomiméticos, aptámeros, etc., que muestran especificidad de unión a un polipéptido descrito en la presente memoria, o a una porción, variante o derivado de los mismos, y métodos de utilización de los mismos.

También se describen en la presente memoria agentes de unión que muestran especificidad de unión para un compañero de unión celular de un polipéptido descrito en la presente memoria. Preferiblemente, tales agentes de unión son eficaces para modular una o más de las actividades no canónicas mediadas por un polipéptido de la presente descripción.

En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, por ejemplo, el agente de unión es uno que se une a un polipéptido de la presente descripción e inhibe su capacidad para unirse a uno o más de sus compañeros de unión celulares. Por consiguiente, tales agentes de unión se pueden utilizar para tratar o prevenir enfermedades, trastornos u otras afecciones que están mediadas por un polipéptido de la presente descripción suscitando antagonismo sobre su actividad.

Se dice que un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se "une específicamente", "se une inmunológicamente", y/o es "reactivo inmunológicamente" con un polipéptido de la presente descripción si reacciona a un nivel detectable (dentro, por ejemplo, de un análisis ELISA) con el polipéptido, y no reacciona detectablemente con polipéptidos no relacionados en condiciones similares.

La unión inmunológica, tal y como se usa en este contexto, se refiere generalmente a las interacciones no covalentes del tipo que ocurren entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el que la inmunoglobulina es específica. La fuerza, o afinidad de las interacciones de unión inmunológica pueden expresarse en términos de la constante de disociación (Kd) de la interacción, en donde una Kd menor representa una mayor afinidad. Las propiedades de la unión inmunológica de polipéptidos seleccionados pueden cuantificarse usando métodos muy conocidos en la técnica. Uno de dichos métodos conlleva medir las velocidades de la formación del complejo de sitio unión a antígeno/antígeno y disociación, en donde esas velocidades dependen de las concentraciones de las parejas del complejo, la afinidad de la interacción, y de parámetros geométricos que influyen igualmente en la velocidad en ambas direcciones. Así, tanto la "constante de asociación" (kon) como la "constante de disociación" (koff) pueden determinarse por el cálculo de las concentraciones y las velocidades reales de asociación y disociación. La proporción de koff /kon permite la cancelación de todos los parámetros no relacionados con la afinidad, y es así igual a la constante de disociación Kd. Véase, generalmente, Davies et al. (1990) Annual Rev. Biochem. 59:439-473.

Un "sitio de unión a antígeno," o una "porción de unión" de un anticuerpo se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en la unión al antígeno. El sitio de unión al antígeno está formado por residuos de aminoácidos de las regiones variables N-terminales ("V") de las cadenas pesada ("H") y ligera ("L"). Tres tramos altamente divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera son referidos como "regiones hipervariables" que están interpuestos entre los tramos flanqueantes más conservados conocidos como "regiones marco", o "FR". De este modo el término "FR" se refiere a secuencias de aminoácidos que se encuentran naturalmente entre y adyacentes a regiones hipervariables en las inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada están dispuestas una respecto a otra en espacio tridimensional para formar una superficie de unión a antígeno. La superficie de unión a antígeno es complementaria a la superficie tridimensional de un antígeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesada y ligera se refieren como "regiones determinantes de la complementariedad," o "CDR." Un agente de unión puede ser, por ejemplo, un ribosoma, con o sin un componente peptídico, una molécula de ARN o un polipéptido. En una realización preferida, un agente de unión es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Los anticuerpos pueden prepararse por cualquiera de una variedad de mecanismos conocidos para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En general, los anticuerpos pueden producirse por técnicas de cultivo celular, incluyendo la generación de anticuerpos monoclonales como se describe en la presente memoria, o mediante transfección de genes de anticuerpo en anfitriones celulares bacterianos o de mamífero adecuados, con el fin de permitir la producción de anticuerpos recombinantes. En una técnica, un inmunógeno que comprende el polipéptido se inyecta inicialmente en cualquiera de una amplia variedad de mamíferos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, ovejas o cabras). En esta etapa, los polipéptidos de esta descripción pueden servir como inmunógeno sin modificación.

Alternativamente, particularmente para polipéptidos relativamente cortos, puede incitarse una respuesta inmune superior si el polipéptido se une a una proteína vehicular, tal como albúmina de suero bovino o hemocianina de lapa californiana. El inmunógeno se inyecta en el anfitrión animal, preferiblemente según un esquema predeterminado incorporando una o más inmunizaciones de refuerzo, y se toman muestras de sangre de los animales periódicamente. Los anticuerpos policlonales específicos para el polipéptido pueden purificarse de dichos antisueros, por ejemplo, por cromatografía de afinidad usando el polipéptido acoplado a un soporte sólido adecuado.

Los anticuerpos monoclonales específicos para un polipéptido de interés se pueden preparar, por ejemplo, utilizando la técnica de Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976, y las mejoras del mismo. Brevemente, estos métodos implican la preparación de líneas celulares inmortales capaces de producir anticuerpos que tienen la especificidad deseada (es decir, reactividad con el polipéptido de interés). Dichas líneas celulares pueden producirse, por ejemplo, a partir de células del bazo obtenidas de un animal inmunizado como se ha descrito anteriormente. Las células del bazo se inmortalizan, por ejemplo, por fusión con un compañero de fusión de células de mieloma, preferiblemente una que es singénica con el animal inmunizado. Puede emplearse una variedad de técnicas de fusión. Por ejemplo, las células de bazo y las células de mieloma pueden combinarse con un detergente no iónico durante unos pocos minutos y a continuación cultivarse en placa a baja densidad en un medio selectivo que soporta el crecimiento de las células híbridas, pero no de las células de mieloma. Una técnica de selección preferida usa selección HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de un tiempo suficiente, habitualmente aproximadamente 1 a 2 semanas, se observan colonias de híbridos. Se seleccionan colonias individuales y sus sobrenadantes de cultivo se someten a ensayo para determinar la actividad de unión frente al polipéptido. Se prefieren los hibridomas que tienen alta reactividad y especificidad.

Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse de los sobrenadantes de colonias de hibridoma en crecimiento. Además, pueden emplearse varias técnicas para aumentar el rendimiento, tal como inyección de la línea celular de hibridoma en la cavidad peritoneal de un anfitrión vertebrado adecuado, tal como un ratón. Los anticuerpos monoclonales pueden recogerse del fluido de ascites o la sangre. Los contaminantes pueden eliminarse de los anticuerpos por técnicas convencionales, tales como cromatografía, filtración en gel, precipitación, y extracción. Los polipéptidos de esta descripción se pueden utilizar en el proceso de purificación, por ejemplo, en una etapa de una cromatografía de afinidad.

En la técnica se conocen varias moléculas terapéuticamente útiles que comprenden sitios de unión a antígeno que son capaces de presentar propiedades de unión inmunológicas de una molécula de anticuerpo. La enzima proteolítica papaína escinde preferiblemente moléculas de IgG para rendir varios fragmentos, dos de los cuales (los fragmentos "F(ab)") comprenden cada uno un heterodímero covalente que incluye un sitio de unión a antígeno intacto. La enzima pepsina es capaz de escindir moléculas de IgG para proporcionar varios fragmentos, incluyendo el fragmento "F(ab')2" que comprende ambos sitios de unión al antígeno. Un fragmento "Fv" puede producirse por escisión proteolítica preferencial de una IgM, y en raras ocasiones molécula de inmunoglobulina IgG o IgA. Los fragmentos Fv, sin embargo, se obtienen más comúnmente usando mecanismos recombinantes conocidos en la técnica. El fragmento Fv incluye un heterodímero VH::VL no covalente incluyendo un sitio de unión a antígeno que retiene la mayor parte de las capacidades de reconocimiento y unión a antígeno de la molécula de anticuerpo nativa. Inbar et al. (1972) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69:2659-2662; Hochman et al. (1976) Biochem 15:2706-2710; y Ehrlich et al. (1980) Biochem 19:4091-4096.

Un polipéptido de cadena sencilla Fv ("sFv") es un heterodímero VH::VL unido covalentemente que se expresa a partir de una fusión génica incluyendo genes que codifican VH y VL unidos por un conector que codifica un péptido.

Huston et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85(16):5879-5883. Se han descrito varios métodos para discernir estructuras químicas para convertir las cadenas de polipéptido de cadena ligera y pesada agregadas naturalmente pero químicamente separadas de una región V de anticuerpo en una molécula sFv que se plegará en un estructura tridimensional sustancialmente similar a la estructura de un sitio de unión a antígeno. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.091.513 y 5.132.405, de Huston et al.; y Patente de los Estados Unidos Núm. 4.946.778, de Ladner et al.

Cada una de las moléculas anteriormente descritas incluye un conjunto de CDR de cadena pesada y cadena ligera, interpuestas respectivamente entre un conjunto de FR de una cadena pesada y una cadena ligera que proporciona soporte a las CDR y definen la relación espacial de las CDR entre sí. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "conjunto de CDR" se refiere a las tres regiones hipervariables de una región V de cadena pesada o ligera.

Desde el extremo N de una cadena pesada o ligera, estas regiones se indican como "CDR1," "CDR2," y "CDR3" respectivamente. Un sitio de unión a antígeno, por lo tanto, incluye seis CDR, que comprenden el conjunto de CDR de cada una de una región V de cadena pesada y cadena ligera. Un polipéptido que comprende una única CDR, (por ejemplo, una CDR1, CDR2 o CDR3) se refiere en la presente memoria como una "unidad de reconocimiento molecular." Los análisis cristalográficos de varios complejos antígeno-anticuerpo han demostrado que los residuos de aminoácidos de las CDR forman un contacto extenso con el antígeno unido, en el que el contacto más extenso con el antígeno es con CDR3 de cadena pesada. Así, las unidades de reconocimiento molecular son responsables principalmente de la especificidad de un sitio de unión a antígeno.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "conjunto de FR" se refiere a las cuatro secuencias de aminoácidos flanqueantes que enmarcan las CDR de un conjunto de CDR de una región V de cadena pesada o ligera. Algunos residuos de FR pueden contactar el antígeno unido; sin embargo, las FR son principalmente responsables del plegamiento de la región V en el sitio de unión al antígeno, concretamente los residuos de FR directamente adyacentes a las CDR. En las FR, determinados residuos de aminoácidos y determinadas características estructurales están altamente conservados. A este respecto, todas las secuencias de región V contienen un bucle disulfuro interno de aproximadamente 90 residuos de aminoácidos. Cuando las regiones V se pliegan en un sitio de unión, las CDR se presentan como restos de bucle proyectados que forman una superficie de unión a antígeno. Generalmente se reconoce que existen regiones estructurales conservadas de las FR que influyen en la conformación plegada de los bucles de CDR en ciertas estructuras "canónicas" con independencia de la secuencia de aminoácidos de la CDR precisa. Además, se sabe que determinados residuos de FR participan en contactos interdominio no covalentes que estabilizan la interacción de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo.

Se han descrito varias moléculas de anticuerpo "humanizadas" que comprenden un sitio de unión a antígeno derivado de una inmunoglobulina no humana, incluyendo anticuerpos quiméricos que tienen regiones V de roedor y sus CDR asociadas fusionadas con dominios constantes humanos (Winter et al. (1991) Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224; Shaw et al. (1987) J Immunol. 138:4534-4538; y Brown et al. (1987) Cancer Res. 47:3577-3583), CDR de roedor injertadas en un FR de soporte humano antes de la fusión con un dominio constante de anticuerpo humano apropiado (Riechmann et al. (1988) Nature 332:323- 327;Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536; y Jones et al. (1986) Nature 321:522-525), y CDR de roedor soportadas por FR de roedor recubiertas recombinantemente (Publicación de Patente Europea No. 519.596, publicada el 23 de dic., 1992). Estas moléculas "humanizadas" se diseñan para minimizar la respuesta inmunológica no deseada hacia moléculas de anticuerpos de roedores que limita la duración y la eficacia de las aplicaciones terapéuticas de esos radicales en los receptores humanos.

Tal y como se usa en la presente memoria, los términos "FR recubiertas" y "FR recubiertas recombinantemente" se refieren al reemplazo selectivo de residuos de FR de, por ejemplo, una región V de cadena pesada o ligera de roedor, con residuos de FR humano con el fin de proporcionar una molécula xenogénica que comprende un sitio de unión a antígeno que retiene sustancialmente toda la estructura de plegamiento del polipéptido FR nativo. Las técnicas de recubrimiento se basan en la comprensión de que las características de unión a ligando de un sitio de unión a antígeno están determinadas principalmente por la estructura y disposición relativa de los conjuntos de CDR de cadena pesada y ligera en la superficie de unión a antígeno. Davies et al. (1990) Ann. Rev. Biochem. 59:439-473.

Así, la especificidad de la unión a antígeno puede conservarse en un anticuerpo humanizado sólo cuando se mantienen cuidadosamente las estructuras CDR, su interacción entre sí, y su interacción con el resto de los dominios de la región V. Mediante el uso de técnicas de recubrimiento, los residuos de FR exteriores (por ejemplo, accesibles a disolvente) que son encontrados fácilmente por el sistema inmune se reemplazan selectivamente por residuos humanos para proporcionar una molécula híbrida que comprende bien una superficie débilmente inmunogénica, o bien sustancialmente no inmunogénica.

En otra realización de la presente descripción, los anticuerpos monoclonales u otros agentes de unión de la presente descripción se pueden acoplar a uno o más agentes de interés. Por ejemplo, un agente terapéutico puede acoplarse (por ejemplo, unirse covalentemente) a un anticuerpo monoclonal adecuado bien directamente o bien indirectamente (por ejemplo, mediante un grupo conector). Una reacción directa entre un agente y un anticuerpo es posible cuando cada uno posee un sustituyente capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleofílico, tal como un grupo amino o sulfidrilo, en uno puede ser capaz de reaccionar con un grupo que contiene carbonilo, tal como un anhídrido o haluro de ácido, o con un grupo alquilo que contiene un buen grupo saliente (por ejemplo, un haluro) en el otro.

Alternativamente, puede ser deseable acoplar un agente terapéutico y un anticuerpo a través de un grupo conector. Un grupo conector puede funcionar como un espaciador para distanciar un anticuerpo de un agente con el fin de evitar interferencia con las capacidades de unión. Un grupo conector también puede servir para incrementar la reactividad química de un sustituyente en un agente o un anticuerpo, e incrementar así la eficiencia del acoplamiento. Un incremento en la reactividad química también puede facilitar el uso de agentes, o grupos funcionales en agentes, que de otra manera no sería posible.

Será evidente para los expertos en la técnica que pueden emplearse como grupo conector una variedad de reactivos bifuncionales o polifuncionales, tanto homo- como hetero-funcionales (tales como los descritos en el catálogo de Pierce Chemical Co., Rockford, IL). El acoplamiento puede efectuarse, por ejemplo, a través de grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfidrilo o residuos de carbohidrato oxidados. Existen numerosas referencias que describen dicha metodología, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.671.958, de Rodwell et al.

Cuando un agente terapéutico es más potente cuando está libre de la porción de anticuerpo de los productos inmunoconjugados de la presente descripción, puede ser deseable utilizar un grupo conector que sea escindible durante o después de la internalización en una célula. Se han descrito varios grupos conectores escindibles diferentes. Los mecanismos para la liberación intracelular de un agente de estos grupos conectores incluyen escisión por reducción de un enlace disulfuro (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.489.710, de Spitler), por irradiación de un enlace fotolábil (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos Núm.4.625.014, de Senter et al.), por hidrólisis de cadenas laterales de aminoácidos derivatizadas (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.638.045, de Kohn et al.), por hidrólisis mediada por complemento del suero (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.671.958, de Rodwell et al.), e hidrólisis catalizada por ácido (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.569.789, de Blattler et al.).

Puede ser deseable acoplar más de un agente a un anticuerpo. En una realización, se acoplan múltiples moléculas de un agente a una molécula de anticuerpo. En otra realización, puede acoplarse más de un tipo de agente a un anticuerpo. Independientemente de la realización particular, los productos inmunoconjugados con más de un agente pueden prepararse de varias maneras. Por ejemplo, puede acoplarse más de un agente directamente a una molécula de anticuerpo, o pueden usarse conectores que proporcionan múltiples sitios para la unión.

Como se ha observado anteriormente, los "péptidos" se incluyen como agentes de unión. El término péptido se refiere típicamente a un polímero de residuos de aminoácido y a variantes y análogos sintéticos de los mismos. En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, el término "péptido" se refiere a polipéptidos relativamente cortos, incluyendo péptidos que consisten en aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 aminoácidos, incluyendo todos los números enteros e intervalos (p. ej., 5-10, 8- 12, 10-15) intermedios, e interaccionan con un polipéptido de AARS, su compañero de unión celular, o ambos. Los péptidos pueden estar compuestos por aminoácidos de origen natural y/o aminoácidos de origen no natural, como se describe en la presente memoria.

Un agente de unión puede incluir un peptidomimético u otra molécula pequeña. Una "molécula pequeña" hace referencia a un compuesto orgánico que es de origen sintético o biológico (biomolécula), pero no es típicamente un polímero. Compuestos orgánicos hace referencia a una gran clase de compuestos químicos cuyas moléculas contienen carbono, típicamente excluyendo aquellas que contienen solamente carbonatos, óxidos de carbono simples, o cianuros. Una "biomolécula" hace referencia generalmente a una molécula orgánica que es producida por un organismo vivo, incluyendo moléculas poliméricas grandes (biopolímeros) tales como péptidos, polisacáridos, y también ácidos nucleicos, y moléculas pequeñas tales como metabolitos primarios secundarios, lípidos, fosfolípidos, glicolípidos, esteroles, glicerolípidos, vitaminas, y hormonas. Un "polímero" hace referencia generalmente a una molécula grande o macromolécula compuesta por unidades estructurales repetitivas, que están conectadas típicamente por enlaces químicos covalentes.

En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, una molécula pequeña tiene un peso molecular de menos de 1000 Dalton, típicamente entre aproximadamente 300 y 700 Daltons, e incluyendo aproximadamente 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 500, 650, 600, 750, 700, 850, 800, 950, o 1000 Dalton.

Los aptámeros también se incluyen como agentes de unión. Los ejemplos de los aptámeros incluyen aptámeros de ácidos nucleicos (p. ej., aptámeros de ADN, aptámeros de ARN) y aptámeros de péptidos. Los aptámeros de ácidos nucleicos se refieren en general a especies de ácidos nucleicos que han sido modificadas por medio de rondas repetidas de selección in vitro o un método equivalente, tal como SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial), para la unión a diversas dianas moleculares tales como moléculas pequeñas, proteínas, ácidos nucleicos, e incluso células, tejidos y organismos. Por consiguiente, se incluyen aptámeros de ácidos nucleicos que se unen a polipéptidos de AARS descritos en la presente memoria y/o sus compañeros de unión celulares.

Los aptámeros de péptidos incluyen típicamente un bucle peptídico variable anclado en ambos extremos a un armazón de proteína, una doble restricción estructural que incrementa típicamente la afinidad de unión del aptámero de péptido a niveles comparables con los de un anticuerpo (p. ej., en el intervalo nanomolar). En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, la longitud del bucle variable puede estar compuesta por aproximadamente 10-20 aminoácidos (incluyendo todos los números enteros intermedios), y el armazón puede incluir cualquier proteína que tenga una buena solubilidad y propiedades de compacidad. Ciertas realizaciones ilustrativas descritas en la presente memoria pueden utilizar la proteína bacteriana Tiorredoxina A como una proteína armazón, insertándose el bucle variable dentro del sitio activo reductor (bucle -Cys-Gly-Pro-Cys- en la proteína salvaje), siendo las dos cadenas laterales de las cisteínas capaces de formar un puente disulfuro. Por consiguiente, se encuentran incluidos los aptámeros de péptidos que se unen a los polipéptidos de AARS descritos en la presente memoria y/o sus compañeros de unión celulares. La selección de los aptámeros de péptidos se puede realizar utilizando diferentes sistemas conocidos en la técnica, incluyendo el sistema de dos híbridos de levadura.

Como se ha indicado anteriormente, los polipéptidos de AARS y los agentes de unión de la presente descripción se pueden utilizar en cualquiera de los métodos de diagnóstico, descubrimiento de fármacos, o terapéuticos descritos en la presente memoria.

Formulación y administración

Las composiciones de la presente descripción (p. ej., polipéptidos, polinucleótidos, anticuerpos, etc.) se formulan generalmente en soluciones farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables para la administración a una célula, tejido o animal, ya sea sola, o combinada con una o más modalidades de terapia distintas. Asimismo se entenderá que, si se desea, las composiciones se pueden administrar también en combinación con otros agentes, tales como, p. ej., otras proteínas o polipéptidos o varios agentes farmacéuticamente activos. No existe virtualmente ningún límite para otros componentes que puedan ser incluidos en las composiciones descritas en la presente memoria, siempre que los agentes adicionales no afecten adversamente a las propiedades de un polipéptido de la presente descripción.

En las composiciones farmacéuticas de la presente invención, la formulación de los excipientes y las soluciones de vehículo farmacéuticamente aceptables es muy conocida para los expertos en la técnica, como lo es el desarrollo de regímenes adecuados de dosificación y tratamiento para utilizar las composiciones particulares descritas en la presente memoria en una variedad de regímenes de tratamiento, incluyendo, p. ej., la administración y formulación oral, parenteral, intravenosa, intranasal, intracraneal e intramuscular.

En determinadas aplicaciones de la presente descripción, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria se pueden entregar mediante administración oral a un sujeto. Como tales, estas composiciones pueden formularse con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o pueden incluirse en cápsulas de gelatina de cubierta dura o blanda, o pueden comprimirse en comprimidos, o pueden incorporarse directamente con el alimento de la dieta.

En determinadas circunstancias, será deseable administrar las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente, o incluso intraperitonealmente como se describe, por ejemplo en Patente de los Estados Unidos Núm. 5.543.158; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.641.515 y Patente de los Estados Unidos Núm. 5.399.363. Las disoluciones de compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de éstos y en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.466.468). En todos los casos la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto que se pueda manejar fácilmente con una jeringa. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe preservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (p. ej., glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y/o aceites vegetales. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede facilitar con diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timesoral, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasen la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Para administración parenteral en una disolución acuosa, por ejemplo, la disolución debe estar adecuadamente tamponada si es necesario y el diluyente líquido se debe hacer isotónico en primer lugar con disolución salina o glucosa suficiente. Estas disoluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, un medio acuoso estéril que puede emplearse será muy conocido para los expertos en la técnica a la vista de la presente descripción. Por ejemplo, una dosificación se puede disolver en 1 ml de solución isotónica de NaCl y se puede añadir a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o se puede inyectar en el sitio de infusión propuesto (véase, p. ej., Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a· Edición, pág. 1035-1038 y 1570-1580). Necesariamente se producirá alguna variación en la dosificación dependiendo de la afección del sujeto que se está tratando. La persona responsable de administración, determinará, en cualquier evento, la dosis apropiada para el sujeto individual. Además, para administración a seres humanos, las preparaciones deben cumplir los patrones generales de esterilidad, pirogenicidad, y de seguridad y pureza según requieren los patrones biológicos de la de FDA Office.

Las disoluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con los diferentes otros ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diferentes ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio básico de dispersión y los demás ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son técnicas de secado en vacío y de liofilización que rinden un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una disolución de éstos previamente esterilizada por filtración.

Las composiciones descritas en la presente memoria pueden formularse en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables, incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Después de la formulación, las disoluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente efectiva. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación tales como disoluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármaco, y similares.

Tal y como se usa en la presente memoria, "portador" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y que retrasan la absorción, tampones, disoluciones portadoras, suspensiones, coloides, y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas es muy conocido en la técnica. Excepto si cualquier medio o agente convencional es incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse ingredientes activos complementarios a las composiciones.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción alérgica o similar inapropiada cuando se administran a un ser humano. La preparación de una composición acuosa que contiene una proteína como un ingrediente activo es muy conocida en la técnica. Típicamente, dichas composiciones se preparan como inyectables, bien como disoluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para disolución en, o suspensión en, líquido antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse.

En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, las composiciones farmacéuticas se pueden liberar mediante pulverizaciones intranasales, inhalación, y/u otros vehículos de liberación en aerosol. Los métodos para la liberación de genes, polinucleótidos, y composiciones de péptidos directamente a los pulmones a través de pulverizadores de aerosol nasal se han descrito, p. ej., en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.756.353 y la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.804.212. Asimismo, la administración de fármacos utilizando resinas de micropartículas intranasales (Takenaga et al., 1998) y compuestos de lisofosfatidil-glicerol (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.725.871) es muy conocida en las técnicas farmacéuticas. Asimismo, la administración transmucosal de fármacos en la forma de una matriz de soporte de politetrafluoroetileno se describe en Patente de los Estados Unidos Núm. 5.780.045.

En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, la liberación se puede producir mediante la utilización de liposomas, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas de lípidos, vesículas, y similares, para la introducción de las composiciones de la presente descripción en células anfitrionas adecuadas. En particular, las composiciones de la presente descripción se pueden formular para administración bien encapsuladas en una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera, una nanopartícula o similares. La formulación y uso de dichos vehículos de administración pueden llevarse a cabo usando técnicas conocidas y convencionales.

Kits que comprenden las composiciones

La presente descripción, en otros aspectos, proporciona kits que comprenden uno o más recipientes cargados con uno o más de los polipéptidos, polinucleótidos, anticuerpos, complejos multiunitarios, composiciones de los mismos,

etc., de la presente descripción, como se describe en la presente memoria. Los kits pueden incluir instrucciones por escrito sobre cómo utilizar tales composiciones (p. ej., para modular la señalización celular, la angiogénesis, el cáncer, afecciones inflamatorias, etc.).

Los kits en la presente memoria también pueden incluir uno o más agentes terapéuticos adicionales u otros componentes adecuados o deseados para la indicación que esté siendo tratada. Un agente terapéutico adicional puede estar contenido en un segundo recipiente, si se desea. Los ejemplos de los agentes terapéuticos adicionales incluyen, pero no se limitan a agentes antineoplásicos, agentes anti-inflamatorios, agentes antibacterianos, agentes antivirales, agentes angiogénicos, etc.

Los kits en la presente memoria también pueden incluir una o más jeringas u otros componentes necesarios o deseados para facilitar un modo de liberación pretendido (p. ej., dispositivos intraluminales, depósitos implantables,

etc.).

Métodos de uso

Las realizaciones de la presente descripción también incluyen métodos de utilización de los "agentes" de aminoacil- ARNt (AARS) descritos en la presente memoria para fines de diagnóstico, descubrimiento de fármacos, y/o terapéuticos. El término "agentes" de AARS hace referencia en general a polinucleótidos de AARS, polipéptidos de AARS, agentes de unión tales como peptidomiméticos, y otros compuestos descritos en la presente memoria. Para fines de diagnóstico, se pueden utilizar los agentes de AARS en una variedad de formas no limitantes, por ejemplo para distinguir entre diferentes tipos de células o estados celulares diferentes, o para identificar sujetos que tienen una enfermedad o afección relevante. Con el fin de descubrir fármacos, se pueden utilizar los agentes de AARS para identificar uno o más "compañeros de unión" celulares de un polipéptido de AARS, caracterizar una o más actividades "no canónicas" de un polipéptido de AARS, identificar agentes que tienen un efecto agonístico o antagónico selectivo o no selectivo sobre la interacción de un polipéptido de AARS con sus compañeros de unión, y/o identificar los agentes que tienen un efecto agonístico o antagónico selectivo o no selectivo sobre una o más actividades "no canónicas" de un polipéptido de AARS. Para fines terapéuticos, se pueden utilizar los agentes o composiciones de AARS proporcionados en la presente memoria para tratar una variedad de enfermedades o afecciones, detalladas más abajo.

Descubrimiento de fármacos

Ciertas realizaciones de la presente descripción se refieren al uso de las secuencias de polipéptidos de aminoacil- ARNt sintetasa (AARS) descritas en la presente memoria en el descubrimiento de fármacos, típicamente para identificar agentes que modulan una o más de las actividades no canónicas del polipéptido. Por ejemplo, ciertas realizaciones de la presente descripción incluyen métodos de identificación de uno o más "compañeros de unión" de un polipéptido de AARS de la presente descripción, tal como una proteína celular u otra molécula del anfitrión que está asociada con el polipéptido y participa en su actividad o en sus actividades no canónicas. Asimismo se describen en la presente memoria los métodos para identificar un compuesto (p. ej., polipéptido) u otro agente que suscita agonismo o antagonismo de la actividad no canónica de un polipéptido de referencia o una variante activa del mismo, por ejemplo mediante interacción con el polipéptido y/o uno o más de sus compañeros de unión celulares.

Ciertas realizaciones de la presente descripción incluyen por lo tanto métodos de identificación de un compañero de unión de un polipéptido de AARS, que comprenden a) combinar el polipéptido de AARS con una muestra biológica en condiciones adecuadas, y b) detectar la unión específica del polipéptido de AARS a un compañero de unión, identificando de ese modo un compañero de unión que se une específicamente al polipéptido de AARS. Asimismo se describen en la presente memoria los métodos de escrutinio de un compuesto que se une específicamente a un polipéptido de AARS o un compañero de unión del polipéptido, que comprenden a) combinar el polipéptido o el compañero de unión con al menos un compuesto de ensayo en condiciones adecuadas, y b) detectar la unión del polipéptido o el compañero de unión al compuesto de ensayo, identificando de ese modo un compuesto que se une específicamente al polipéptido o su compañero de unión. En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, el compuesto es un polipéptido o un péptido. En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, el compuesto es una molécula pequeña u otro compuesto químico (p. ej., no biológicos). En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, el compuesto es un peptidomimético.

Se puede emplear cualquier método adecuado para detectar interacciones proteína-proteína para identificar proteínas celulares que interaccionan con un polipéptido de AARS, interaccionan con uno o más de sus compañeros de unión celulares, o ambos. Los ejemplos de los métodos tradicionales que se pueden emplear incluyen co- inmunoprecipitación, entrecruzamiento, y co-purificación a través de columnas con gradientes o cromatográficas de productos lisados celulares o proteínas obtenidas de productos lisados celulares, principalmente para identificar proteínas en el producto lisado que interaccionan con el polipéptido de AARS.

En estas realizaciones y en realizaciones relacionadas de la presente descripción, al menos una porción de la secuencia de aminoácidos de una proteína que interacciona con un polipéptido de AARS o su compañero de unión puede ser averiguada utilizando mecanismos bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo a través del mecanismo de degradación de Edman. Véase, p. ej., Creighton Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., N.Y., págs. 34 49, 1983. La secuencia de aminoácidos obtenida se puede utilizar como una guía para la generación de mezclas de oligonucleótidos que se pueden utilizar para escrutar secuencias génicas que codifican tales proteínas. El escrutinio se puede completar, por ejemplo, por medio de hibridación convencional o técnicas de PCR, como se describe en la presente memoria y se conoce en la técnica. Las técnicas para la generación de mezclas de oligonucleótidos y el escrutinio son bien conocidas. Véase, p. ej., Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989; e Innis et al., eds. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, Inc., Nueva York, 1990.

Adicionalmente, los métodos se pueden emplear en la identificación simultánea de genes que codifican el compañero de unión u otro polipéptido. Estos métodos incluyen, por ejemplo, el sondeo de bibliotecas de expresión, de una manera similar al mecanismo bien conocido de sondeo con anticuerpos de bibliotecas de lambda-gt11, utilizando una proteína AARS marcada, u otro polipéptido, péptido o proteína de fusión, p. ej., un polipéptido de AARS variante o un dominio de AARS fusionado a un marcador (p. ej., una enzima, flúor, una proteína luminiscente, o un colorante), o un dominio Fc de Ig.

Un método que detecta las interacciones de proteínas in vivo, el sistema de dos híbridos, se describe con detalle solamente como ilustración y no a modo de limitación. Un ejemplo de este sistema ha sido descrito (Chien et al., PNAS USA 88:9578 9582, 1991) y se encuentra disponible en el mercado en Clontech (Palo Alto, Calif.).

En resumen, utilizando semejante sistema, se pueden construir plásmidos que codifican dos proteínas híbridas: un plásmido consiste en nucleótidos que codifican el dominio de unión a ADN de una proteína activadora de la transcripción fusionada a una secuencia de nucleótidos de AARS de referencia (o, en ciertas realizaciones, su compañero de unión), o una variante de la misma, y el otro plásmido consiste en nucleótidos que codifican el dominio de activación de la proteína activadora de la transcripción fusionado a un ADNc (o una colección de ADNc) que codifica una o varias proteínas desconocidas que han sido recombinadas en el plásmido como parte de una biblioteca de ADNc. El plásmido de fusión del ADN-dominio de unión y la biblioteca de ADNc activador se pueden transformar en una cepa de la levadura Saccharomyces cerevisiae que contiene un gen informador (p. ej., HBS o lacZ) cuya región reguladora contiene el sitio de unión del activador de la transcripción. Cualquier proteína híbrida no puede activar la transcripción del gen informador: el híbrido de ADN-dominio de unión no puede porque no proporciona función de activación y el híbrido del dominio de activación no puede porque no puede localizar los sitios de unión del activador. La interacción de las dos proteínas híbridas reconstituye la proteína activadora funcional y da como resultado la expresión del gen informador, que es detectada por medio de un análisis para el producto génico del informador.

El sistema de dos híbridos u otra metodología semejante se pueden utilizar para escrutar las bibliotecas de dominios de activación para determinar las proteínas que interaccionan con el producto génico "cebo". A modo de ejemplo, y no de limitación, se puede utilizar un polipéptido de referencia de AARS o una variante como producto génico cebo. También se puede utilizar un compañero de unión de AARS como producto génico "cebo". Las secuencias genómicas o de ADNc totales se fusionan al ADN que codifica un dominio de activación. Esta biblioteca y un plásmido que codifica un híbrido de un producto génico de AARS cebo fusionado al dominio de unión a ADN se transforman simultáneamente en una cepa informadora de levadura, y los transformantes resultantes se escrutan para determinar aquellos que expresan el gen informador.

Se puede elaborar una biblioteca de ADNc de la línea celular de la cual se van a detectar las proteínas que interaccionan con los productos génicos de AARS cebo utilizando métodos rutinarios puestos en práctica en la técnica. Por ejemplo, los fragmentos de ADNc se pueden insertar en un vector de manera que se fusionan traduccionalmente al dominio de activación transcripcional de GAL4. Esta biblioteca se puede transformar simultáneamente con el plásmido de fusión del gen cebo-GAL4 en una cepa de levadura, que contiene un gen lacZ dirigido por un promotor que contiene la secuencia de activación GAL4. Una proteína codificada por ADNc, fusionada al dominio de activación transcripcional GAL4, que interacciona con el producto génico cebo reconstituirá una proteína GAL4 activa y de ese modo dirigirá la expresión del gen HIS3. Las colonias, que expresan HIS3, se pueden detectar por medio de su crecimiento sobre placas Petri que contienen medios basados en agar semisólido carentes de histidina. El ADNc se puede purificar después a partir de estas cepas, y se puede utilizar para producir y aislar la proteína de interacción con el gen AARS cebo utilizando mecanismos rutinarios puestos en práctica en la técnica.

Asimismo se describen en la presente memoria sistemas de tres híbridos, que permiten la detección de interacciones ARN-proteína en levaduras. Véase, p. ej., Hook et al., ARN. 11:227-233, 2005. Por consiguiente, se pueden utilizar estos métodos y métodos relacionados para identificar un compañero de unión celular de un polipéptido de AARS, y para identificar otras proteínas o ácidos nucleicos que interaccionan con el polipéptido de AARS, el compañero de unión celular, o ambos.

Como se ha indicado anteriormente, una vez aislados, los compañeros de unión pueden ser identificados y, a su vez, pueden ser utilizados junto con mecanismos convencionales para identificar proteínas u otros compuestos con los cuales interacciona. Ciertas realizaciones de la presente descripción se refieren por lo tanto a métodos de escrutinio de un compuesto que se une específicamente a un compañero de unión de un polipéptido de referencia de AARS, que comprenden a) combinar el compañero de unión con al menos un compuesto de ensayo en condiciones adecuadas, y b) detectar la unión del compañero de unión al compuesto de ensayo, identificando de ese modo un compuesto que se une específicamente al compañero de unión. En ciertas realizaciones de la presente descripción, el compuesto de ensayo es un polipéptido. En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, el compuesto de ensayo es un compuesto químico, tal como un compuesto de molécula pequeña o un peptidomimético.

Ciertas realizaciones descritas en la presente memoria incluyen métodos de escrutinio de un compuesto que modula la actividad de un polipéptido de AARS, que comprenden a) combinar el polipéptido con al menos un compuesto de ensayo en condiciones permisivas para la actividad del polipéptido, b) evaluar la actividad del polipéptido en presencia del compuesto de ensayo, y c) comparar la actividad del polipéptido en presencia del compuesto de ensayo con la actividad del polipéptido en ausencia del compuesto de ensayo, en donde un cambio en la actividad del polipéptido en presencia del compuesto de ensayo es indicativa de un compuesto que modula la actividad del polipéptido. Ciertas realizaciones descritas en la presente memoria incluyen métodos de escrutinio de un compuesto que modula la actividad de un compañero de unión de un polipéptido de AARS, que comprenden a) combinar el polipéptido con al menos un compuesto de ensayo en condiciones permisivas para la actividad del compañero de unión, b) evaluar la actividad del compañero de unión en presencia del compuesto de ensayo, y c) comparar la actividad del compañero de unión en presencia del compuesto de ensayo con la actividad del compañero de unión en ausencia del compuesto de ensayo, en donde un cambio en la actividad del compañero de unión en presencia del compuesto de ensayo es indicativa de un compuesto que modula la actividad del compañero de unión. Típicamente, estas realizaciones y realizaciones relacionadas descritas en la presente memoria incluyen la evaluación de una actividad no canónica seleccionada que está asociada con un polipéptido de AARS o su compañero de unión. Se describen en la presente memoria las condiciones in vitro e in vivo, tales como las condiciones de cultivo celular.

Ciertas realizaciones descritas en la presente memoria incluyen los métodos de escrutinio de un compuesto para determinar la eficacia como agonista total o parcial de un polipéptido de AARS o un fragmento activo o una variante del mismo, que comprenden a) exponer una muestra que comprende el polipéptido a un compuesto, y b) detectar la actividad agonística en la muestra, típicamente midiendo un incremento en la actividad no canónica del polipéptido de AARS. Ciertos métodos incluyen a) exponer una muestra que comprende un compañero de unión del polipéptido de AARS a un compuesto, y b) detectar la actividad agonística en la muestra, típicamente midiendo un incremento en la actividad no canónica seleccionada del polipéptido de AARS. Ciertas realizaciones de la presente descripción incluyen composiciones que comprenden un compuesto agonista identificado por el método y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptables.

Asimismo se describen en la presente memoria los métodos de escrutinio de un compuesto para determinar la eficacia como antagonista total o parcial de un polipéptido de AARS, que comprenden a) exponer una muestra que comprende el polipéptido a un compuesto, y b) detectar la actividad antagónica en la muestra, típicamente midiendo un descenso en la actividad no canónica del polipéptido de AARS. Ciertos métodos incluyen a) exponer una muestra que comprende un compañero de unión del polipéptido de AARS a un compuesto, y b) detectar la actividad antagónica en la muestra, típicamente midiendo un descenso en la actividad no canónica seleccionada del polipéptido de AARS. Ciertas realizaciones descritas en la presente memoria incluyen composiciones que comprenden un compuesto antagónico identificado por el método y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptables.

En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, se pueden diseñar sistemas in vitro para identificar compuestos capaces de interaccionar con o modular una secuencia de referencia de AARS o su compañero de unión. Ciertos compuestos identificados por medio de tales sistemas pueden ser útiles, por ejemplo, en la modulación de la actividad de la ruta, y en la elaboración de los componentes de la propia ruta. Asimismo se pueden utilizar en escrutinios para identificar compuestos que interrumpen las interacciones entre los componentes de la ruta; o pueden interrumpir tales interacciones directamente. Un enfoque ilustrativo implica preparar una mezcla de reacción del polipéptido de AARS y un compuesto de ensayo en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que los dos interaccionen y se unan, formando de ese modo un complejo que puede ser eliminado de y/o detectado en la mezcla de reacción Los análisis de escrutinio in vitro se pueden llevar a cabo en una variedad de formas. Por ejemplo, un polipéptido de AARS, un compañero de unión celular, o uno o varios compuestos de ensayo se pueden anclar sobre una fase sólida. En estas realizaciones y en realizaciones relacionadas descritas en la presente memoria, los complejos resultantes se pueden capturar y detectar sobre la fase sólida al final de la reacción. En un ejemplo de semejante método, el polipéptido de AARS y/o su compañero de unión se anclan sobre una superficie sólida, y el compuesto o los compuestos de ensayo, que no están anclados, se pueden marcar, directamente o indirectamente, de manera que se pueda detectar su captura por el componente sobre la superficie sólida. En otros ejemplos, el compuesto o los compuestos de ensayo se anclan a la superficie sólida, y el polipéptido de AARS y/o su compañero de unión, que no están anclados, se marcan o se hacen detectables de algún modo. En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, se pueden utilizar convenientemente placas de microtitulación como fase sólida. El componente anclado (o compuesto de ensayo) puede ser inmovilizado por medio de anclajes no covalentes o covalentes. El anclaje no covalente se puede completar simplemente recubriendo la superficie sólida con una solución de la proteína y secando. Alternativamente, se puede utilizar un anticuerpo inmovilizado, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, específico para la proteína que se va a inmovilizar para anclar la proteína a la superficie sólida. Las superficies se pueden preparar de antemano y se pueden almacenar.

Para llevar a cabo un análisis ilustrativo, el componente no inmovilizado se añade típicamente a la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Una vez que la reacción se ha completado, los componentes que no han reaccionado se eliminan (p. ej., mediante lavado) en condiciones tales que cualquiera de los complejos específicos formados permanezcan inmovilizados sobre la superficie sólida. La detección de complejos anclados sobre la superficie sólida se puede completar de numerosas maneras. Por ejemplo, cuando el componente previamente no inmovilizado está pre-marcado, la detección de la marca inmovilizada sobre la superficie indica que se habían formado complejos. Cuando el componente previamente no inmovilizado no está pre-marcado, se puede utilizar una marca indirecta para detectar los complejos anclados sobre la superficie; p. ej., utilizando un anticuerpo marcado específico para el componente previamente no inmovilizado (el anticuerpo, a su vez, puede estar marcado directamente o marcado indirectamente con un anticuerpo anti-Ig marcado).

Alternativamente, se puede determinar la presencia o ausencia de unión de un compuesto de ensayo, por ejemplo, utilizando la resonancia de plasmón superficial (SPR) y el cambio en el ángulo de resonancia como un índice, en donde un polipéptido de AARS o un compañero de unión celular es inmovilizado sobre la superficie de un chip sensor disponible en el mercado (p. ej., fabricado por Biacore™) de acuerdo con un método convencional, el compuesto de ensayo se pone en contacto con el mismo, y el chip sensor se ilumina con una luz de una longitud de onda concreta desde un ángulo concreto. La unión de un compuesto de ensayo también se puede medir mediante la detección de la aparición de un pico correspondiente al compuesto de ensayo mediante un método en donde un polipéptido de AARS o un compañero de unión celular son inmovilizados sobre la superficie de un chip de proteína adaptable a un espectrómetro de masas, un compuesto de ensayo se pone en contacto con el mismo, y un método de ionización tal como MALDI-MS, ESI-MS, FAB-MS y similares se combina con un espectrómetro de masas (p. ej., espectrómetro de masas de doble enfoque, espectrómetro de masas de cuadrupolo, espectrómetro de masas de tiempo de vuelo, espectrómetro de masas de transformada de Fourier, espectrómetro de masas de ión ciclotrón y similares).

En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, se pueden utilizar análisis basados en células, análisis basados en vesículas de membrana, o análisis basados en fracciones de membrana para identificar compuestos que modulan las interacciones en la ruta no canónica del polipéptido de AARS seleccionado. Con este fin, se pueden utilizar líneas celulares que expresan un polipéptido de AARS y/o un compañero de unión, o una proteína de fusión que contiene un dominio o un fragmento de tales proteínas (o una combinación de los mismos), o líneas celulares (p. ej., células COS, células CHO, células HEK293, células Hela, etc.) que han sido modificadas genéticamente para expresar tales proteínas o proteínas de fusión. Los compuestos de ensayo que influyen en la actividad no canónica se pueden identificar controlando el cambio (p. ej., un cambio estadísticamente significativo) en esa actividad en comparación con una cantidad de control o predeterminada.

Para las realizaciones de la presente descripción que relacionan los agentes antisentido y ARNi, por ejemplo, también se incluyen los métodos de escrutinio de un compuesto para determinar la eficacia en la alteración de la expresión de una secuencia de polinucleótido de AARS, que comprenden a) exponer una muestra que comprende el polinucleótido de AARS a un compuesto tal como un oligonucleótido antisentido potencial, y b) detectar la alteración de la expresión del polinucleótido de AARS. En ciertos ejemplos no limitantes, se pueden emplear estas realizaciones y realizaciones relacionadas descritas en la presente memoria en análisis basados en células o en análisis de traducción libres de células, de acuerdo con mecanismos rutinarios en la técnica. Asimismo se describen oligonucleótidos antisentido y agentes de ARNi identificados por tales métodos.

También se describe en la presente memoria cualquiera de los métodos anteriores, u otros métodos de escrutinio conocidos en la técnica, que están adaptados para el escrutinio de alto rendimiento (HTS). El HTS típicamente utiliza la automatización para ejecutar un escrutinio de un análisis frente a una biblioteca de compuestos candidato, por ejemplo, un análisis que mide un incremento o un descenso en una actividad no canónica, como se describe en la presente memoria.

Métodos de tratamiento

En otro aspecto, la presente descripción se refiere a métodos de utilización de las composiciones de la presente descripción para el tratamiento de una célula, tejido o sujeto con una composición como se describe en la presente memoria. Las células o tejidos que se pueden modular por medio de la presente descripción son preferiblemente células o tejidos de mamífero, o más preferiblemente células o tejidos de ser humano. Tales células o tejidos pueden proceder de un estado sano o de un estado enfermo.

En determinadas realizaciones de la presente descripción, por ejemplo, se proporcionan métodos para modular actividades celulares terapéuticamente relevantes incluyendo, pero no limitadas a, metabolismo celular, diferenciación celular, proliferación celular, muerte celular, movilización celular, migración celular, transcripción génica, traducción del ARNm, impedancia celular, y similares, que comprenden poner en contacto una célula con una composición como se describe en la presente memoria. Los ejemplos de las células o tejidos que pueden ser modulados incluyen los de la piel (p. ej., dermis, epidermis, capa subcutánea), folículos pilosos, sistema nervioso (p. ej., cerebro, médula espinal, nervios periféricos), sistema auditivo u órganos del equilibrio (p. ej., oído interno, oído medio, oído externo), sistema respiratorio (p. ej., nariz, tráquea, pulmones), tejidos gastroesofágicos, el sistema gastrointestinal (p. ej., boca, esófago, estómago, intestino delgado, intestino grueso, recto), sistema vascular (p. ej., corazón, vasos sanguíneos, y arterias), hígado, vesícula biliar, sistema linfático/inmunitario (p. ej., nódulos linfáticos, folículos linfoides, bazo, timo, médula ósea), sistema uro-genital (p. ej., riñones, uréter, vejiga, uretra, cuello uterino, trompas de Falopio, ovarios, útero, vulva, próstata, glándulas bulbouretrales, epidídimo, próstata, vesículas seminales, testículos), sistema músculo-esquelético (p. ej., músculos esqueléticos, músculos lisos, hueso, cartílago, tendones, ligamentos), tejido adiposo, mamas, y el sistema endocrino (p. ej., hipotálamo, pituitaria, tiroides, páncreas, glándulas adrenales). Por consiguiente, las composiciones se pueden emplear en el tratamiento esencialmente de cualquier célula o tejido o sujeto que se beneficiaría de una o más de tales actividades ilustrativas, o uno o más de tales células o tejidos ilustrativos.

Las composiciones descritas en la presente memoria también se pueden utilizar en cualquiera de varios contextos terapéuticos incluyendo, por ejemplo, los relacionados con el tratamiento o la prevención de enfermedades neoplásicas, enfermedades del sistema inmunitario (p. ej., enfermedades autoinmunitarias e inflamación), enfermedades infecciosas, enfermedades metabólicas, enfermedades neuronales/neurológicas, enfermedades musculares/cardiovasculares, enfermedades asociadas con hematopoyesis aberrante, enfermedades asociadas con angiogénesis aberrante, enfermedades asociadas con supervivencia celular aberrante, y otras.

Por ejemplo, en ciertas realizaciones ilustrativas descritas en la presente memoria, las composiciones de la presente descripción se pueden utilizar para modular la angiogénesis, p. ej., a través de la modulación de la proliferación y/o la señalización de las células endoteliales. La proliferación y/o la señalización de células endoteliales se pueden controlar utilizando una línea celular apropiada (p. ej., células de pulmón endoteliales microvasculares humanas (HMVEC-L) y células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC)), y utilizando un análisis apropiado (p. ej., análisis de migración de células endoteliales, análisis de proliferación de células endoteliales, análisis de formación de tubo, análisis de tapón de matrigel, etc.), muchos de los cuales son conocidos y se encuentran disponibles en la técnica.

Por lo tanto, en realizaciones relacionadas descritas en la presente memoria, las composiciones de la presente descripción se pueden emplear en el tratamiento esencialmente de cualquier células o tejido o sujeto que se beneficiaría de la modulación de la angiogénesis. Por ejemplo, en algunas realizaciones descritas en la presente memoria, se puede poner en contacto una célula o tejido o sujeto que está experimentando o es susceptible de angiogénesis (p. ej., una afección angiogénica) con una composición de la presente descripción para inhibir una afección angiogénica. En otras realizaciones descritas en la presente memoria, se puede poner en contacto una célula o tejido que está experimentando o es susceptible de angiogénesis insuficiente (p. ej., una afección angiostática) con una composición apropiada de la presente descripción con el fin de interferir en la actividad angiostática y/o promover la angiogénesis.

Los ejemplos ilustrativos de las afecciones angiogénicas incluyen, pero no se limitan a, degeneración macular relacionada con la edad (AMD), cáncer (tanto sólido como hematológico), anomalías del desarrollo (organogénesis), ceguera por diabetes, endometriosis, neovascularización ocular, psoriasis, artritis reumatoide (RA), y decoloraciones de la piel (p. ej., hemangioma, nevus flammeus o nevus simplex). Los ejemplos de las afecciones anti-angiogénicas incluyen, pero no se limitan a, enfermedad cardiovascular, restenosis, lesión tisular tras reperfusión de tejido isquémico o insuficiencia cardíaca, inflamación crónica y curación de heridas.

Las composiciones de la presente descripción también pueden ser útiles como inmunomoduladores para el tratamiento de indicaciones pro-inflamatorias mediante la modulación de las células que median, bien directamente bien indirectamente, enfermedades, afecciones y trastornos autoinmunitarios y/o inflamatorios. La utilidad de las composiciones de la presente descripción como inmunomoduladores se puede controlar utilizando cualquiera de los numerosos mecanismos conocidos y disponibles en la técnica incluyendo, por ejemplo, análisis de migración (p. ej., utilizando leucocitos o linfocitos) o análisis de viabilidad celular (p. ej., utilizando células B, células T, monocitos o células NK). En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, las composiciones de la presente descripción pueden modular las citoquinas inflamatorias, tales como TNF-α. En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, las composiciones de la presente descripción pueden modular la quimiotaxis de células inmunitarias, tales como monocitos.

"Inflamación" se refiere generalmente a la respuesta biológica de tejidos a estímulos dañinos, tales como patógenos, células dañadas (por ejemplo, heridas), e irritantes. El término "respuesta inflamatoria" se refiere a los mecanismos específicos por los que la inflamación se consigue y regula, incluyendo, meramente como ilustración, activación o migración de células inmunes, producción de citoquinas, vasodilatación, incluyendo liberación de quinina, fibrinolisis, y coagulación, entre otros descritos en la presente memoria y conocidos en la técnica. Idealmente, la inflamación es un intento protector del cuerpo tanto para eliminar el estímulo injurioso como para iniciar el proceso de cicatrización para el tejido o tejidos afectados. En ausencia de inflamación las heridas e infecciones nunca cicatrizarían, creando una situación en la que la destrucción progresiva del tejido amenazaría la supervivencia. Por otra parte, la inflamación excesiva o crónica puede estar asociada con una variedad de enfermedades, tal como fiebre del heno, aterosclerosis, y artritis reumatoide, entre otras descritas en la presente memoria y conocidas en la técnica.

Las composiciones de la presente descripción pueden modular la inflamación aguda, la inflamación crónica, o ambas. Ciertas realizaciones de la presente descripción se refieren al aumento de inflamación aguda o de las respuestas inflamatorias agudas, y determinadas realizaciones descritas en la presente memoria se refieren a la reducción de la inflamación crónica o de las respuestas inflamatorias crónicas. Dependiendo de las necesidades del sujeto, determinadas realizaciones descritas en la presente memoria se refieren a la reducción de la inflamación aguda o de las respuestas inflamatorias, y determinadas realizaciones descritas en la presente memoria se refieren a la reducción de la inflamación crónica o de las respuestas inflamatorias crónicas.

La inflamación aguda se refiere a la respuesta inicial del cuerpo a estímulos presumiblemente dañinos e implica un movimiento incrementado de plasma y leucocitos desde la sangre a los tejidos dañados. Es un proceso a corto plazo, empezando típicamente en minutos u horas y finalizando después de la eliminación del estímulo injurioso. La inflamación aguda puede caracterizarse por una cualquiera o más de enrojecimiento, calor incrementado, hinchazón, dolor, y pérdida de función. El enrojecimiento y calor se deben principalmente a un flujo sanguíneo incrementado a temperatura corporal central al sitio inflamado, la hinchazón está causada por la acumulación de fluido, el dolor se debe típicamente a la liberación de agentes químicos que estimulan las terminaciones nerviosas, y la pérdida de función tiene múltiples causas.

Las respuestas inflamatorias agudas se inician principalmente por células inmunitarias locales, tales como macrófagos residentes, células dendríticas, histiocitos, células de Kuppfer y mastocitos. En el inicio de una infección, quemadura, u otras lesiones, estas células experimentan activación y liberan mediadores inflamatorios responsables de los signos clínicos de la inflamación, tales como aminas vasoactivas y eicosanoides. La vasodilatación y su flujo sanguíneo incrementado resultante causan el enrojecimiento y aumento de calor. El aumento de permeabilidad de los vasos sanguíneos da como resultado una exudación o extravasación de proteínas plasmáticas y fluido en el tejido, lo que crea la hinchazón. Determinados mediadores liberados tales como bradiquinina incrementan la sensibilidad al dolor, y alteran los vasos sanguíneos para permitir la migración o extravasación de leucocitos, tales como neutrófilos, que migran típicamente a lo largo de un gradiente quimiotáctico creado por las células inmunitarias locales.

Las respuestas inflamatorias agudas también incluyen uno o más sistemas de cascada bioquímicos acelulares, que consisten en un producto modulado de proteínas plasmáticas preformadas, que actúan en paralelo para iniciar y propagar la respuesta inflamatoria. Estos sistemas incluyen el sistema del complemento, que se activa principalmente por bacterias, y los sistemas de coagulación y fibrinolisis, que se activan principalmente por necrosis, tal como el tipo de daño tisular que es causado por determinadas infecciones, quemaduras, u otros traumas. Por consiguiente, las composiciones de la descripción se pueden utilizar para modular la inflamación aguda, o cualquiera de una o más de las respuestas inflamatorias agudas individuales.

La inflamación crónica, una respuesta inflamatoria prolongada y retrasada, se caracteriza por un desplazamiento progresivo en el tipo de células que están presentes en el sitio de la inflamación, y da lugar frecuentemente a la destrucción y cicatrización simultánea o casi simultánea del tejido a partir del proceso inflamatorio. A nivel celular, las respuestas inflamatorias crónicas implican una variedad de células inmunitarias tales como monocitos, macrófagos, linfocitos, células plasmáticas, y fibroblastos, aunque a diferencia de la inflamación aguda, que está mediada principalmente por granulocitos, la inflamación crónica está mediada principalmente por células mononucleares tales como monocitos y linfocitos. La inflamación crónica también implica una variedad de mediadores inflamatorios, tales como IFN-γ y otras citoquinas, factores de crecimiento, especies de oxígeno reactivas, y enzimas hidrolíticas. La inflamación crónica puede durar durante muchos meses o años, y puede dar como resultado la destrucción de tejido y fibrosis no deseada.

Los signos clínicos de la inflamación crónica dependen de la duración de la enfermedad, lesiones inflamatorias, causa y área anatómica afectada. (Véase, por ejemplo, Kumar et al., Robbins Basic Pathology-8ª Ed., 2009 Elsevier, Londres; Miller, LM, Pathology Lecture Notes, Atlantic Veterinary College, Charlottetown, PEI, Canadá). La inflamación crónica está asociada con una variedad de afecciones o enfermedades patológicas, incluyendo, por ejemplo, alergias, enfermedad de Alzheimer, anemia, estenosis de la válvula aórtica, artritis tal como artritis reumatoide y osteoartritis, cáncer, fallo cardiaco congestivo, fibromialgia, fibrosis, ataque cardiaco, fallo renal, lupus, pancreatitis, ictus, complicaciones quirúrgicas, enfermedad pulmonar inflamatoria, enfermedad inflamatoria intestinal, aterosclerosis, y psoriasis, entre otras descritas en la presente memoria y conocidas en la técnica. Por lo tanto, las composiciones proporcionada en la presente memoria se pueden utilizar para tratar o gestionar la inflamación crónica, modular cualquiera de las una o más respuestas inflamatorias crónicas individuales, o tratar cualquiera de las una o más enfermedades o afecciones asociadas con la inflamación crónica.

Las composiciones de la presente descripción también pueden modular la inflamación proliferativa, un proceso inflamatorio caracterizado por un incremento en el número de células tisulares. Éstas pueden englobar afecciones de la piel tales como psoriasis, seborrea o eccema, o también puede pensarse en ellas en términos de cánceres y crecimientos anormales especialmente a la vista de la evidencia que se acumula basada en métodos moleculares más eficientes para documentar incluso inflamación crónica de grado bajo.

Los criterios para evaluar los signos y síntomas de las afecciones inflamatorias y otras, incluyendo el propósito de realizar un diagnóstico diferencial y también para controlar tratamientos tales como la determinación de si se ha administrado una dosis terapéuticamente eficaz en el curso del tratamiento, por ejemplo, la determinación de la mejoría de acuerdo con criterios clínicos aceptados, serán evidentes para los expertos en la técnica y se ilustran por las enseñanzas, por ejemplo, de Berkow et al., eds., The Merck Manual, 16a edición, Merck y Co., Rahway, N.J., 1992; Goodman et al., eds., Goodman y Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10a edición, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y., (2001); Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3a edición, ADIS Press, Ltd., Williams y Wilkins, Baltimore, MD. (1987); Ebadi, Pharmacology, Little, Brown y Co., Boston, (1985); Osolci al., eds., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990); Katzung, Basic and Clinical Pharmacology, Appleton y Lange, Norwalk, CT (1992).

Las enfermedades, trastornos o afecciones del sistema inmunitario ilustrativos que se pueden tratar de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no están limitados a, inmunodeficiencias primarias, trombocitopenia mediada por inmunidad, síndrome de Kawasaki, trasplante de médula ósea (por ejemplo, trasplante reciente de médula ósea en adultos o niños), leucemia linfocítica crónica de células B, infección por VIH (por ejemplo, infección por VIH de adulto o pediátrica), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, púrpura post-transfusión, y similares.

Como se ha observado anteriormente, ciertas realizaciones descritas en la presente memoria pueden emplear las composiciones de la presente descripción para incrementar la inflamación o incrementar la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, dependiendo de las necesidades del sujeto, ciertas realizaciones descritas en la presente memoria pueden incrementar la inflamación aguda o incrementar las respuestas inflamatorias aguas o ambas. Ciertas realizaciones descritas en la presente memoria pueden incrementar la inflamación crónica o las respuestas inflamatorias crónicas o ambas. Ciertas realizaciones descritas en la presente memoria pueden incrementar la inflamación tanto aguda como crónica. Ciertas realizaciones descritas en la presente memoria pueden incrementar la inflamación local o sistémica o ambas.

En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, se pueden utilizar las composiciones para tratar o gestionar inmunodeficiencias, incluyendo inmunodeficiencias primarias e inmunodeficiencias secundarias, en las que el organismo puede no montar una respuesta inflamatoria adecuada. Los ejemplos de las inmunodeficiencias primarias incluyen diversas afecciones genéticas recesivas y ligadas a X tales como inmunodeficiencias de células T y de células B, incluyendo las inmunodeficiencias de células T y de células B combinadas, deficiencias de anticuerpos, síndromes bien definidos, enfermedades de desregulación inmunitaria, trastornos de fagocitos, trastornos innatos de la inmunidad, y deficiencias del complemento.

Los ejemplos de las inmunodeficiencias de células T y células B incluyen deficiencias T-/B+ tales como deficiencia de γc, deficiencia de JAK3, deficiencia de la cadena α del receptor de interleuquina 7, deficiencia de CD45, deficiencia de CD3δ/CD3ε; y deficiencias T-/B- tales como deficiencia de RAG 1/2, deficiencia de DCLRE1C, deficiencia de adenosina desaminasa (ADA), disgénesis reticular. Otros ejemplos incluyen el síndrome de Omenn, la deficiencia de ADN ligasa de tipo IV, la deficiencia de ligando de CD40, deficiencia de CD40, deficiencia de purina nucleósido fosforilasa (PNP), deficiencia de MHC clase II, deficiencia de CD3γ, deficiencia de CD8, deficiencia de ZAP-70, deficiencia de TAP-1/2, y deficiencia de hélice alada.

Los ejemplos de las deficiencias de anticuerpos incluyen agammaglobulinemia ligada a X (deficiencia de btk, o agammaglobulinemia de Bruton), deficiencia de cadena pesada µ, deficiencia de I-5, deficiencia de Igα, deficiencia de BLNK, timoma con inmunodeficiencia, inmunodeficiencia variable común (CVID), deficiencia de ICOS, deficiencia de CD19, deficiencia de TACI (TNFRSF13B), y deficiencia de receptor BAFF. Los ejemplos adicionales incluyen deficiencia de AID, deficiencia de UNG, deleciones de cadena pesada, deficiencia de cadena kappa, deficiencias de la subclase IgG aislada, deficiencia de la subclase IgA con IgG, deficiencia de inmunoglobulina A selectiva, e hipogammaglobulinemia transitoria de la infancia (THI).

Los ejemplos de los "síndrome bien definidos" incluyen síndrome de Wiskott-Aldrich, ataxia telangiectasia, síndrome de tipo ataxia, síndrome de rotura de Nijmegen, síndrome de Bloom, síndrome de DiGeorge, displasias imuno-óseas tales como hipoplasia de cartílago-cabello, síndrome de Schimke, síndrome de Hermansky-Pudlak tipo 2, síndrome de Hiper-IgE, candidiasis mucocutánea crónica.

Los ejemplos de las enfermedades por desregulación inmunitaria incluyen inmunodeficiencia con hipopigmentación o albinismo tal como síndrome de Chediak-Higashi y síndrome de Griscelli tipo 2, linfohistiocitosis hemofagocítica familiar tal como deficiencia de perforina, deficiencia de MUNC13D, y deficiencia de sintaxina 11, síndrome linfoproliferativo ligado a X, síndrome linfoproliferativo autoinmunitario tal como tipo 1a (defectos en CD95), tipo 1b (defectos en el ligando Fas), tipo 2a (defectos en CASP10), y tipo 2b (defectos en CASP8), poliendocrinopatía autoinmunitaria con candidiasis y distrofia ectodérmica, y síndrome de enteropatía poliendocrinopatía e inmunodesregulación ligado a X. Adicionalmente, las enfermedades que afectan a la médula ósea pueden dar como resultado leucocitos anómalos o escasos, tal como en la leucopenia. La leucopenia puede ser inducida por ciertas infecciones y enfermedades, incluyendo infección viral, infección por Rickettsia, algunos protozoos, tuberculosis, y ciertos cánceres.

Los ejemplos de los trastornos de los fagocitos incluyen la neutropenia congénita grave tal como la deficiencia de ELA2 (p. ej., mielodisplasia), deficiencia de GFI1 (con linfopenia T/B) o deficiencia de G-CSFR (G-CSF no responsiva), síndrome de Kostmann, neutropenia cíclica, neutropenia/mielodisplasia ligada a X, deficiencia de la adherencia de leucocitos tipos 1, 2 y 3, deficiencia de RAC2, deficiencia de β-actina, periodontitis juvenil localizada, síndrome de Papillon-Lefèvre, deficiencia de gránulos específicos, síndrome de Shwachman-Diamond, enfermedad granulomatosa crónica, incluyendo formas ligadas a X y autosómicas, deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de neutrófilos, deficiencia de la cadena β1 de IL-12 e IL-23, deficiencia de IL-12p40, deficiencia de receptor 1 de interferon γ, deficiencia de receptor 2 de interferon γ, y deficiencia de STAT1.

Los ejemplos de las deficiencias de inmunidad innata incluyen displasia ectodérmica hipohidrótica tal como deficiencia de NEMO y deficiencia de IKBA, deficiencia de IRAK-4, síndrome de WHIM (verrugas, hipogammaglobulinemia, infecciones, mielocatexis), y epidermodisplasia verruciformis. Los ejemplos de las deficiencias del complemento y las afecciones asociadas ilustrativas incluyen deficiencia de C1 q (p. ej., síndrome de tipo lupus, enfermedad reumatoide, infecciones), deficiencia de C1r, deficiencia de C4, deficiencia de C2 (p. ej., síndrome de tipo lupus, vasculitis, polimiositis, infecciones piogénicas), deficiencia de C3 (p. ej., infecciones piogénicas recurrentes), deficiencia de C5 (p. ej., infecciones neisseriales), deficiencia de C6, deficiencia de C7 (p. ej., vasculitis), deficiencia de C8a y C8b, deficiencia de C9 (p. ej., infecciones neisseriales), deficiencia de inhibidor de C1 (p. ej., angioedema hereditario), deficiencia de Factor I (infecciones piogénicas), deficiencia de Factor H (p. ej., síndrome hemoliticourémico, glomerulonefritis membranoproliferativa), deficiencia de Factor D (p. ej., infecciones neisseriales), deficiencia de Properdina (p. ej., infecciones neisseriales), deficiencia de MBP (p. ej., infecciones piogénicas), y deficiencia de MASP2.

Las deficiencias inmunitarias primarias se pueden diagnosticar de acuerdo con mecanismos rutinarios en la técnica. Los ensayos de diagnóstico ilustrativos incluyen, sin limitación, la realización de recuentos de los diferentes tipos de células mononucleares en la sangre (p. ej., linfocitos y monocitos, incluyendo linfocitos, diferentes grupos de linfocitos B tales como linfocitos CD19+, CD20+, y CD21+, células asesinas naturales, y monocitos positivos para CD15+), la medición de la presencia de marcadores de activación (p. ej., HLA-DR, CD25, CD80), la realización de ensayos para determinar la función de células T por ejemplo ensayos cutáneos para la hipersensibilidad de tipo retardado, respuestas celulares a mitógenos y células alogénicas, producción de citoquinas por las células, realización de ensayos para determinar la función de las células B por ejemplo identificando anticuerpos para inmunizaciones rutinarias e infecciones comúnmente adquiridas y cuantificando subclases de IgG, y la realización de ensayos de la función de los fagocitos, por ejemplo midiendo la reducción de cloruro de nitroazul de tetrazolio, y la realización de análisis de quimiotaxis y actividad bactericida. Por lo tanto los polipéptidos de AARS se pueden utilizar para estimular o mantener la inflamación aguda o las respuestas inflamatorias agudas en sujetos con una inmunodeficiencia primaria, como se describe en la presente memoria y es conocido en la técnica.

Los ejemplos de las causas de las inmunodeficiencias secundarias incluyen malnutrición, envejecimiento, y medicaciones (p. ej., quimioterapia, fármacos anti-reumáticos modificadores de la enfermedad, fármacos inmunosupresores después de transplantes de órganos, glucocorticoides). Otras causas incluyen diversos cánceres, incluyendo cánceres de médula ósea y células sanguíneas (p. ej., leucemia, linfoma, mieloma múltiple), y ciertas infecciones crónicas, tales como el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), causado por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Los polipéptidos de AARS se pueden utilizar para estimular o mantener la inflamación aguda o las respuestas inflamatorias agudas en sujetos con una inmunodeficiencia, como se describe en la presente memoria y es conocido en la técnica. Los polipéptidos de AARS también se pueden utilizar para estimular o mantener la inflamación crónica o las respuestas inflamatorias crónicas en sujetos con una inmunodeficiencia secundaria, como se describe en la presente memoria y es conocido en la técnica.

Además, las enfermedades, trastornos y afecciones adicionales incluyen síndrome de Guillain-Barre, anemia (por ejemplo, anemia asociada con parvovirus B19, pacientes con mieloma múltiple estable que presentan alto riesgo de infección (por ejemplo, infección recurrente), anemia hemolítica autoinmunitaria (por ejemplo, anemia hemolítica autoinmunitaria de tipo caliente), trombocitopenia (por ejemplo, trombocitopenia neonatal), y neutropenia mediada por inmunidad, trasplante (por ejemplo, receptores citomegalovirus (CMV) negativos de órganos CMV positivos), hipogammaglobulinemia (por ejemplo, neonatos hipogammaglobulinémicos con factor de riesgo para infección o morbilidad), epilepsia (por ejemplo, epilepsia intratable), síndromes vasculíticos sistémicos, miastenia grave (por ejemplo, descompensación en miastenia grave), dermatomiositis, y polimiositis.

Las enfermedades, trastornos y afecciones autoinmunitarios adicionales incluyen, pero no están limitados a, anemia hemolítica autoinmunitaria, trombocitopenia neonatal autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica idiopática, autoinmunocitopenia, anemia hemolítica, síndrome antifosfolípido, dermatitis, encefalomielitis alérgica, miocarditis, policondritis con recaída, enfermedad cardiaca reumática, glomerulonefritis (por ejemplo, nefropatía IgA), esclerosis múltiple, neuritis, uveitis oftálmica, poliendocrinopatías, púrpura (por ejemplo, púrpura Henloch-Scoenlein), enfermedad de Reiter, síndrome del hombre rígido, inflamación pulmonar autoinmunitaria, síndrome de Guillain- Barre, diabetes mellitus dependiente de insulina, y enfermedad ocular inflamatoria autoinmunitaria.

Las enfermedades, trastornos o afecciones autoinmunitarios adicionales incluyen, pero no están limitados a, tiroiditis autoinmunitaria; hipotiroidismo, incluyendo tiroiditis de Hashimoto y tiroiditis caracterizada, por ejemplo, por citotoxicidad tiroidea mediada por células y humoral; SLE (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por complejos inmunitarios circulantes y generados localmente); síndrome de Goodpasture (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por anticuerpos anti-membrana basal); pénfigo (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por anticuerpos acantolíticos epidérmicos); autoinmunidades de receptores tales como, por ejemplo, enfermedad de Graves (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos para un receptor de la hormona estimuladora de tiroides) miastenia grave, (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos receptores de acetilcolina); resistencia a insulina (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por anticuerpos del receptor de insulina); anemia hemolítica autoinmunitaria (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por fagocitosis de células sanguíneas rojas sensibilizadas por anticuerpo); y púrpura trombocitopénica autoinmunitaria (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por fagocitosis de plaquetas sensibilizadas por anticuerpo).

Las enfermedades, trastornos o afecciones autoinmunitarios adicionales incluyen, pero no están limitados a, artritis reumatoide (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por complejos inmunitarios en las articulaciones); escleroderma con anticuerpos anti-colágeno (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por anticuerpos nucleolares y otros nucleares); enfermedad del tejido conectivo mixta (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por anticuerpos frente a antígenos nucleares extraíbles, por ejemplo, ribonucleoproteína); polimiositis/dermatomiositis (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por anticuerpos anti-nucleares no histónicos); anemia perniciosa (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por anticuerpos anti célula parietal, antimicrosoma, y anti-factor intrínseco); enfermedad de Addison idiopática (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por citotoxicidad adrenal humoral y mediada por células); infertilidad (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por anticuerpos antiespermatozoicos); glomerulonefritis (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por anticuerpos de la membrana basal glomerular o complejos inmunitarios); glomerulonefritis primaria, nefropatía de IgA; pénfigo ampolloso (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por IgG y complemento en la membrana basal); síndrome de Sjogren (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por múltiples anticuerpos de tejido y/o el anticuerpo específico antinuclear no histónico (SS-B)); diabetes mellitus (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por anticuerpos de células del islote mediados por células y humoral); y resistencia a fármacos adrenérgicos, incluyendo resistencia a fármacos adrenérgicos con asma o fibrosis quística (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por anticuerpos del receptor beta-adrenérgico).

Las enfermedades, trastornos o afecciones autoinmunitarios más adicionales incluyen, pero no están limitados a, hepatitis activa crónica (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por anticuerpos del músculo liso); cirrosis biliar primaria (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por anticuerpos anti-mitocondriales); otro fallo de glándula endocrina (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por anticuerpos específicos de tejido en algunos casos); vitiligo (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por anticuerpos anti-melanocito); vasculitis (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por inmunoglobulina y complemento en las paredes de los vasos y/o complemento sérico bajo); afecciones posteriores al infarto de miocardio (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por anticuerpos anti-miocárdicos); síndrome de cardiotomía (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por anticuerpos anti-miocárdicos); urticaria (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por anticuerpos IgG e IgM frente a IgE); dermatitis atópica (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por anticuerpos IgG e IgM frente a IgE); asma (que se caracteriza frecuentemente, por ejemplo, por anticuerpos IgG e IgM frente a IgE); miopatías inflamatorias; y otros trastornos inflamatorios, granulomatosos, degenerativos, y atróficos.

En otras realizaciones descritas en la presente memoria, se pueden utilizar las composiciones de la presente descripción para modular la proliferación y/o supervivencia celulares y, de acuerdo con esto, para tratar o prevenir enfermedades, trastornos o afecciones caracterizados por anomalías en la proliferación yo supervivencia celulares. Por ejemplo, en ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, las composiciones se pueden utilizar para modular la apoptosis y/o para tratar enfermedades o afecciones asociadas con la apoptosis anormal. La apoptosis es el término usado para describir la cascada de señalización celular conocida como muerte celular programada. Existen varias indicaciones terapéuticas para moléculas que inducen apoptosis (por ejemplo, cáncer), así como aquellas que inhiben la apoptosis (p. ej., ictus, infarto de miocardio, sepsis, etc.). La apoptosis puede verificarse por cualquiera de varios mecanismos asequibles conocidos y disponibles en la técnica incluyendo, por ejemplo, ensayos que miden la fragmentación del ADN, alteraciones en la asimetría de las membranas, activación de caspasas apoptóticas y/o liberación de citocromo C y AIF.

Las enfermedades ilustrativas asociadas con supervivencia celular incrementada, o la inhibición de apoptosis incluyen, pero no están limitadas a, cánceres (tales como linfomas foliculares, carcinomas, y tumores dependientes de hormonas, incluyendo, pero no limitados a cáncer de colon, tumores cardiacos, cáncer pancreático, melanoma, retinoblastoma, glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer intestinal, cáncer testicular, cáncer de estómago, neuroblastoma, mixoma, mioma, linfoma, endotelioma, osteoblastoma, osteoclastoma, osteosarcoma, condrosarcoma, adenoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, sarcoma de Kaposi y cáncer de ovario); trastornos autoinmunitarios (tales como, esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, diabetes autoinmunitaria, cirrosis biliar, enfermedad de Behcet, enfermedad de Crohn, polimiositis, lupus eritematoso sistémico y glomerulonefritis relacionada con inmunidad, gastritis autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria, y artritis reumatoide) e infecciones virales (tales como virus de herpes, virus de viruela y adenovirus), inflamación, enfermedad de injerto frente a anfitrión (aguda y/o crónica), rechazo de injerto agudo, y rechazo de injerto crónico.

Las enfermedades o afecciones ilustrativas adicionales asociadas con la supervivencia celular incrementada incluyen, pero no están limitadas a, progreso y/o metástasis de malignidades y trastornos relacionados tales como leucemia (incluyendo leucemias agudas (por ejemplo, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, incluyendo mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica, y eritroleucemia)) y leucemias crónicas (por ejemplo, leucemia mielocítica crónica (granulocítica) y leucemia linfocítica crónica), síndrome mielodisplásico, policitemia vera, linfomas (por ejemplo enfermedad de Hodgkin y enfermedad no de Hodgkin), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedades de cadena pesada, y tumores sólidos incluyendo, pero no limitados a, sarcomas y carcinomas tales como fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándula sudorípara, carcinoma de glándula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cáncer cervical, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma, y retinoblastoma.

Las enfermedades ilustrativas asociadas con el incremento de la apoptosis incluyen, pero no están limitadas a, SIDA (tal como nefropatía inducida por VIH y encefalitis por VIH), trastornos neurodegenerativos (tal como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, retinitis pigmentosa, degeneración cerebelar y tumor cerebral o enfermedad asociada con priones), trastornos autoinmunitarios tales como esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, diabetes autoinmunitaria, cirrosis biliar, enfermedad de Behcet, enfermedad de Crohn, polimiositis, lupus eritematoso sistémico, glomerulonefritis relacionada con inmunidad, gastritis autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica, y artritis reumatoide, síndromes mielodisplásicos (tales como anemia aplásica), enfermedad de injerto frente a anfitrión (aguda y/o crónica), daño isquémico (tal como el causado por infarto de miocardio, ictus y daño por reperfusión), daño o enfermedad hepática (por ejemplo, daño hepático relacionado con hepatitis, cirrosis, daño por isquemia/reperfusión, colestosis (daño en el conducto biliar) y cáncer de hígado), enfermedad hepática inducida por toxinas (tal como la causada por alcohol), choque séptico, colitis ulcerosa, caquexia, y anorexia.

En otras realizaciones adicionales más descritas en la presente memoria, se pueden utilizar las composiciones de la presente descripción en el tratamiento de enfermedades o trastornos neuronales/neurológicos, incluyendo los ejemplos ilustrativos de éstos enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Pick, enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, corea de Huntington, hemiplejia alternante, esclerosis lateral amiotrófica, ataxia, parálisis cerebral, síndrome de fatiga crónica, síndromes de dolor crónico, anomalías neurológicas congénitas, enfermedades de los nervios craneales, delirio, demencia, enfermedades desmielinizantes, disautonomía, epilepsia, dolores de cabeza, enfermedad de Huntington, hidrocefalia, meningitis, trastornos del movimiento, enfermedades musculares, neoplasmas del sistema nervioso, síndromes neurocutáneos, enfermedades neurodegenerativas, síndromes de neurotoxicidad, trastornos de motilidad ocular, trastornos del sistema nervioso periférico, trastornos de la pituitaria, porencefalia, síndrome de Rett, trastornos del sueño, trastornos de la médula espinal, ictus, corea de sydenham, síndrome de tourette, trauma y daños del sistema nervioso, etc.

Además, las realizaciones adicionales descritas en la presente memoria se refieren al uso de las composiciones de la presente descripción en el tratamiento de trastornos metabólicos tales como adrenoleucodistrofia, enfermedad de Krabbe (leucodistrofia de células globoides), leucodistrofia metacromática, enfermedad de Alexander, enfermedad de Canavan (leucodistrofia espongiforme), enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, síndrome de Cockayne, enfermedad de Hurler, síndrome de Lowe, enfermedad de Leigh, enfermedad de Wilson, enfermedad de Hallervorden-Spatz, enfermedad de Tay-Sachs, etc. La utilidad de las composiciones de la presente descripción para modular procesos metabólicos puede verificarse usando cualquiera de una variedad de mecanismos conocidos y disponibles en la técnica incluyendo, por ejemplo, ensayos que miden la lipogénesis de adipocitos o lipolisis de adipocitos.

Ejemplos

EJEMPLO COMPARATIVO 1

Identificación del motivo estructural dentro de un fragmento de polipéptido de GLYRS que tiene actividad de señalización celular

Como se muestra en las FIG. 2A-2C, se descubrió inesperadamente que un fragmento de glicil-ARNt sintetasa (GlyRS) humana referido como G6, y los correspondientes residuos 214-439 de GlyRS humana (SEQ ID NO: 1), era eficaz al inducir quimiotaxis de monocitos THP-1 dependiente de GPCR. El análisis adicional de este fragmento activo reveló la presencia de un motivo estructural, que comprendía 3 láminas β antiparalelas flanqueadas por una hélice α en cada extremo, que se cree que es responsable de la actividad quimioquina observada. Se identificó que el motivo estructural estaba contenido en los residuos de aminoácido 345-438 de la secuencia de proteína GlyRS humana mostrada en el SEQ ID NO: 1.

Ejemplo 2

Identificación del motivo estructural en otras proteínas de AARS de clase II

El motivo estructural identificado anteriormente en el Ejemplo 1 también se encontró en regiones similares de otras AARS de Clase II humanas. Estas incluían AspRS, HisRS, ThrRS, GluProRS y SerRS. Esta región de las proteínas AARS de Clase II está altamente conservada estructuralmente entre los miembros de esta clase de AARS indicando que la región contiene la misma arquitectura estructural básica, pero no está bien conservada en identidad de secuencia de los residuos, creando el potencial de presentar varias secuencias diferentes que pueden tener diferentes actividades de señalización en esta arquitectura. (p. ej., FIG. 4, adaptada de O'Donoghue y Luthey- Schulten, Microbiology and Molecular Biology Reviews, Dic 2003) Se identificó que el motivo estructural estaba contenido en los residuos de aminoácido 367-448 de la secuencia de proteína AspRS humana mostrada en el SEQ ID NO: 2; en los residuos de aminoácido 294-372 de la proteína HisRS humana mostrada en el SEQ ID NO: 3; en los residuos de aminoácido 469-586 of the la proteína ThRS humana mostrada en el SEQ ID NO: 4; en los residuos de aminoácido 1171-1253 de la proteína GluProRS humana mostrada en el SEQ ID NO: 5; en los residuos de aminoácido 325-410 de la proteína SerRS humana mostrada en el SEQ ID NO: 6; en los residuos de aminoácido 380-449 de la proteína PheRS humana mostrada en el SEQ ID NO: 7; en los residuos de aminoácido 425-523 de la proteína LysRS humana mostrada en el SEQ ID NO: 8; en los residuos de aminoácido 416-494 de la proteína AsnRS humana mostrada en el SEQ ID NO: 9; y en los residuos de aminoácido 148-258 de la proteína AlaRS humana mostrada en el SEQ ID NO: 10.

EJEMPLO COMPARATIVO 3

Proteínas no AARS ilustrativas que contienen el motivo estructural

Un análisis adicional identificó la presencia de este mismo motivo estructural que comprende 3 láminas β antiparalelas y dos hélices α en varias proteínas distintas de AARS (FIG 5). Por ejemplo, el motivo se identificó en la tiorredoxina humana, contenido en los residuos 20-105 de la secuencia de tiorredoxina humana del SEQ ID NO: 11, así como también en los residuos 20-84 de Trx80, que es una forma trucada, secretada de tiorredoxina que contiene los 84 residuos de aminoácido N-terminales.

El motivo también se identificó en la proteína factor inhibidor de macrófagos humana, contenido en los residuos 1-90 de la secuencia de tiorredoxina humana del SEQ ID NO: 12.

El motivo también se identificó en la proteína de isoforma B de peroxirredoxina 5 humana, contenido en los fragmentos no contiguos correspondientes a los residuos 32-68 y 125-161 de la secuencia de la isoforma B de la peroxirredoxina 5 humana del SEQ ID NO: 13.

De este modo, escrutando proteínas distintas de AARS para determinar la presencia del motivo estructural identificado, la presente descripción proporciona un medio para identificar fragmentos de proteínas que tienen actividades biológicas no canónicas de relevancia terapéutica.

Ejemplo 4

Identificación del motivo estructural dentro de un fragmento de polipéptido de SERRS que tiene actividad de señalización celular

Como se muestra en la FIG. 7, se descubrió inesperadamente que un fragmento de seril-ARNt sintetasa (SerRS) humana referido como S3, y correspondiente a los residuos 253-484 de la SerRS humana completa (SEQ ID NO: 6), era eficaz en la unión a monocitos y células B humanos, estimulando la secreción de TNF-α desde una línea celular monocítica humana, y señalizando a través de un receptor 2 de tipo Toll. El análisis adicional de este fragmento activo reveló la presencia de un motivo estructural, que comprende 3 láminas β antiparalelas flanqueadas por una hélice α en cada extremo, que se cree que es responsable de la actividad observada. Se identificó que el motivo estructural estaba contenido en los residuos de aminoácido 325-410 de la secuencia de proteína SerRS humana mostrada en el SEQ ID NO: 6.

Para la unión de S3, se purificaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de un donante de sangre sano y se resuspendieron en RPMI con FBS al 10% a 1x107 por ml. Después se trataron 1x106 células en 100 µl de medio con PBS o S3 500 nM. Después de 45 minutos las células se lavaron dos veces con 1 mL de tampón de tinción (PBS + FBS al 2%) y se tiñeron con un anticuerpo αV5-FITC de Invitrogen (Núm. de Catálogo R96325), CD19 para las células B (Núm. de Catálogo BD 555413), en tampón de tinción con 200 µg/ml de IgG humana durante 30 minutos. Las células se lavaron a continuación dos veces con 1 mL de tampón de tinción, se resuspendieron y se analizaron mediante FACS. Los resultados se muestran en la FIG. 7A, que muestra la unión de S3 a monocitos humanos, y la FIG. 7B, que muestra la unión de S3 a células B humanas, en comparación con un control negativo de PBS.

Para la secreción de TNFα, se cultivaron células THP en medio RPMI con FBS al 10% y BME 0,5 mM. Se trataron un millón de células con PBS, S3 (100 nM), o Lipopolisacárido (LPS, 1 ug/mL). Después de 4 horas, el sobrenadante celular se recogió por centrifugación a 2000xg durante 10 min y se evaluó en un ELISA de TNF-α (R&D Systems; Núm. de Cat. DTA00C) mediante las directrices del kit. Los resultados se muestran en la FIG. 7C, que muestra la inducción de secreción de TNF-α a partir de la línea celular monocítica humana (THP-1), en comparación con un control positivo de LPS y un control negativo de PBS.

Para la señalización a través del receptor 2 de tipo Toll, se trataron células HEK-Blue 2 (Invivogen células Núm. hb2) transfectadas establemente con receptor 2 de tipo Toll de ratón (mTLR2) unido a un gen informador de fosfatasa alcalina de NFκB durante la noche con dosis variables de proteína S3. El día siguiente, el medio se eliminó y se analizó durante cuatro horas para determinar la fosfatasa alcalina secretada utilizando QUANTI-Blue (Invivogen Núm. rep-qb). Como se muestra en la Figura 8, el tratamiento logró una fuerte secreción de fosfatasa alcalina de una manera dependiente de la dosis, indicando la activación del receptor y su ruta de señalización de NFκB asociada.

En otro experimento, se pre-trataron las mismas células con 5 ug/ml de MAb mTLR2 (Invivogen Núm. mab-mtlr2) (marcado (+) TLR-2) o no se trataron (S3) durante 30 minutos, seguido de tratamiento durante la noche con S3 250 nM. Al día siguiente el medio se retiró y se analizó durante cuatro horas para determinar la fosfatasa alcalina secretada utilizando QUANTI-Blue (Invivogen Núm. rep-qb). Como se muestra en la Figura 9, la activación del receptor 2 de tipo Toll era inhibida por el pre-tratamiento con un anticuerpo monoclonal que bloquea la unión a mTLR2.

Listado de secuencias

<110> ATYR PHARMA, INC. Greene, Leslie Ann <120> Motivos estructurales de polipéptidos asociados con la actividad de señalización celular <130> 120161.411PC <140> PCT <141> 26-02-2010 <150> US 61/156.370 <151> 27-02-2009 <160> 13 <170> FastSEQ para Windows Versión 4.0 <210> 1 <211> 685 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 <210> 2 <211> 501 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 <210> 3 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 <210> 4 <211> 723 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 <210> 7 <211> 508 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 <210> 8 <211> 597 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 <210> 10 <211> 968 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 <210> 12 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 <210> 13 <211> 170 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) aislado que consiste en 60-300 residuos de aminoácido, en donde el polipéptido de AARS comprende tres hebras β antiparalelas flanqueadas en cada extremo por una hélice α y muestra una actividad de señalización celular, en donde el polipéptido comprende los residuos 325-410 del SEQ ID NO: 6 o un fragmento activo o variante que muestra una identidad de al menos 90% con los residuos 325-410 del SEQ ID NO: 6, y en donde el polipéptido tiene actividad quimioquina.

2. Una proteína de fusión que comprende el polipéptido aislado de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido está unido covalentemente a un polipéptido heterólogo.

3. El polipéptido aislado de la reivindicación 1 o 2, en donde el polipéptido consiste en 60 a 200 residuos de aminoácido.

4. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Un a) polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, b) un vector que comprende un polinucleótido aislado de a), o c) una célula anfitriona que comprende un vector de b).

6. Un método de identificación de un fragmento de polipéptido que tiene una actividad de señalización celular, que comprende las etapas de identificar una secuencia de proteína que contiene un motivo estructural formado por tres hebras β antiparalelas flanqueadas en cada extremo por una hélice α, determinar los límites de residuos de aminoácido del motivo estructural dentro de dicha proteína, e identificar de ese modo un fragmento de polipéptido que tiene actividad de señalización celular.

7. El método de la reivindicación 6, en donde el fragmento de polipéptido comprende de 60 a 200 aminoácidos de la proteína.

8. El método de la reivindicación 6, en donde la etapa de identificación de una secuencia de proteína que contiene un motivo estructural formado por tres hebras β antiparalelas flanqueadas en cada extremo por una hélice α se realiza utilizando un método de predicción de la estructura secundaria.

9. El método de la reivindicación 6, en donde la etapa de identificación de una secuencia de proteína que contiene un motivo estructural formado por tres hebras β antiparalelas flanqueadas en cada extremo por una hélice α se realiza utilizando un método de predicción de la estructura secundaria seleccionado del grupo que consiste en PHDsec, NSSP, SOPM, DSC, SSPRED, MultiPredict, PSA, NNPREDICT, APSSP, GOR, HNN, HTMSRAP, Jpred, JUFO, nnPredict, Porter, PredictProtein, Prof, PSIpred, SOPMA, SSpro y DLP-SVM.

10. Una composición para su uso en la modulación de la señalización celular que comprende una cantidad eficaz de: a) un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3; b) un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 5; y/o c) un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3; 11. La composición de la reivindicación 10, para su uso en la inducción de la secreción de TNF-α.

12. La composición de la reivindicación 10, para su uso en la señalización a través de un receptor 2 de tipo Toll.

13. Un método de escrutinio para identificar un modulador de la señalización celular, que comprende las etapas de: (a) formar una mezcla de reacción que incluye: (i) un componente seleccionado del grupo que consiste en un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3; un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 5; y/o un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3; (ii) un compañero de unión, un efector celular y/o un tipo de célula conocidos por unirse a y/o estar modulados por dicho componente; y (iii) un compuesto de ensayo; y (b) detectar una interacción de dicho componente con el compañero de unión, el efector celular y/o el tipo de célula, en donde un cambio en la interacción en presencia de un compuesto de ensayo, con respecto a la interacción en ausencia del compuesto de ensayo, identifica de ese modo un modulador de la señalización celular.

14. El polipéptido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso como medicamento.

15. El polipéptido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades neoplásicas, enfermedades del sistema inmunitario tales como enfermedades autoinmunitarias e inflamación, enfermedades infecciosas, enfermedades metabólicas, enfermedades neuronales/neurológicas, enfermedades musculares/cardiovasculares, enfermedades asociadas con hematopoyesis aberrante, enfermedades asociadas con angiogénesis aberrante y enfermedades asociadas con supervivencia celular aberrante.