MOLÉCULAS CON SEMIVIDAS PROLONGADAS, COMPOSICIONES Y USOS DE LAS MISMAS.

Una molécula modificada que comprende una proteína o agente no proteico y un dominio constante de IgG,

en la que el dominio constante de IgG comprende un dominio CH2 humano en el que hay una sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 252, numerado de acuerdo con el índice EU de Kabat, en el que la molécula modificada tiene una semivida prolongada en comparación con la semivida de una molécula que comprende la proteína o el agente no proteico y un dominio constante de IgG correspondiente que comprende un dominio CH2 de tipo silvestre humano, y en la que la sustitución en el resto 252 es una sustitución por tirosina, fenilalanina, triptofano o treonina

1. INTRODUCCIÓN

La presente invención se refiere a moléculas cuyas semividas in vivo se aumentan mediante la modificación de un dominio constante de lgG o un dominio de unión a FcRn (receptor Fc neonatal) de la misma. Específicamente, estas moléculas tienen modificaciones de aminoácidos que aumentan la afinidad del dominio constante o fragmentos del mismo por el FcRn. El aumento de la semivida de IgG terapéuticas y diagnósticas y otras moléculas bioactivas mediante el uso de procedimientos de la invención tiene muchos beneficios, incluidos la reducción de la cantidad y/o frecuencia de la dosificación de estas moléculas, por ejemplo, en vacunas, inmunoterapia pasiva y otros procedimientos terapéuticos y profilácticos. La invención se refiere además a proteínas de fusión que contienen un dominio constante de IgG que tiene una o varias modificaciones de aminoácidos y a una proteína no IgG o molécula no proteica conjugada a dicho dominio constante de IgG, en la que la presencia del dominio constante de la IgG modificada aumenta la semivida in vivo de la proteína no IgG o molécula.

2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El uso de inmunoglobulinas como agentes terapéuticos ha aumentado significativamente en años recientes y se ha extendido a diferentes áreas de tratamientos médicos. Dichos usos incluyen el tratamiento de agammaglobulinemia e hipogammaglobulinemia, como agentes inmunodepresores para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y enfermedades de injerto frente a huésped (GVH), el tratamiento de tumores malignos linfoides e inmunoterapias pasivas para el tratamiento de diversas enfermedades sistémicas e infecciosas. Es decir, las inmunoglobulinas son útiles como instrumentos de diagnóstico in vivo, en procedimientos diagnósticos de obtención de imágenes.

Un problema crítico de estas terapias es la persistencia de inmunoglobulinas en la circulación. La velocidad de eliminación de inmunoglobulina afecta directamente a la cantidad y la frecuencia de dosificación de la inmunoglobulina. Un aumento de la dosis y de la frecuencia de dosificación puede causar efectos adversos en el paciente y también puede aumentar los costes médicos.

La lgG es la clase de inmunoglobulina más prevalente en seres humanos y en otros mamíferos y se utiliza en varios tipos de inmunoterapias y procedimientos diagnósticos. El mecanismo de catabolismo de IgG en la circulación se ha elucidado mediante estudios relacionados con la transferencia de inmunidad pasiva de madre a feto/neonato a través de la placenta o saco de yema o a través del colostro (transferencia maternofetal de IgG por medio de transcitosis) en roedores (Brambell, Lancet, 1087-1093, 1966; Rodewald, J. CelI BioI., 71:666-670, 1976; Morris y col., en: Antigen Absorption by the Gut, páginas 3-22, 1978, University Park Press, Baltimore; Jones y col., J. Clin. lnvert., 51: 2916-2927, 1972).

La implicación de determinados receptores en la transmisión maternofetal de IgG materna fue sugerida primeramente por el grupo de Brambell en su estudio de la absorción intestinal de anticuerpos maternos a partir de leche ingerida en ratas recién nacidas (Halliday, Proc. R. Soc. B., 143:408-413, 1955; Halliday, Proc. R. Soc. B., 144:427-430, 1955; Halliday, Proc. R. Soc. B., 148:92-103, 1957; Morris, Proc. R. Soc. B., 148:84-91, 1957; Brambell et al., Proc. R. Soc. B., 149:1-11, 1958; Morris, Proc. R. Soc. B., 160:276-292,1964). Brambell y col. sugirieron, sobre la base de la observación, que IgG heterólogas interfirieron en la transmisión de anticuerpos específicos, que las moléculas de IgG de diversas especies podrían tener estructuras o secuencias suficientemente similares que se unen a receptores comunes (Brambell y col., Proc. R. Soc. B., 149:1-11, 1958).

Se ha implicado a un receptor de Fc de gran afinidad, el FcRn, en este mecanismo de transferencia. El receptor FcRn se ha aislado a partir de bordes en cepillo del epitelio duodenal de ratas lactantes (Rodewald y col., J. CelI Biol., 99:154s-164s, 1984; Simister y col., Eur. J. lmmunol., 15:733-738, 1985) y se han clonado los genes correspondientes (Simister y col., Natura, 337:184, 1989 y CoId Spring Harbor Symp. Quant. Biol., LIV, 571 -580, 1989). Estas últimas clonaciones de genes que codifican FcRn procedentes de ratones (Ahouse y col., J. lmmunol., 151 :6076-6088, 1993) y seres humanos (Story y col., J. Exp. Med., 180: 2377-2381, 1994) demuestran una gran homología de estas secuencias con el FcRn de rata, lo que sugiere un mecanismo similar de transmisión maternofetal de IgG que implica al FcRn en estas especies.

Mientras tanto, el grupo de Brambell propuso también un mecanismo para el catabolismo de IgG (Brambell y colll., Nature, 203:1352-1355, 1964; Brambell, Lancet, H:1087-1093, 1966). Propusieron que una proporción de las moléculas de IgG presentes en la circulación se unieron a determinados receptores celulares (es decir, FcRn) que se saturaron, con lo que las IgG se protegieron de su degradación y se reciclaron eventualmente a la circulación; por otra parte, las IgG que no se unieron a sus receptores se degradaron. El mecanismo propuesto fue consecuente con el catabolismo de IgG observado en pacientes hipergammaglobulinémicos o hipogammaglobulinémicos. Además, sobre la base de sus estudios, así como de otros (véase por ejemplo. Spiegelberg y col., J. Exp. Med, 121:323-338, 1965; Edelman y col., Proc. NatI. Acad. Sci. USA, 63:78-85, 1969), Brambell sugiere también que el mecanismo implicado en la transferencia maternofetal de IgG y el catabolismo de IgG pueden ser ambos el mismo o, al menos, estar muy estrechamente relacionados (Brambell, Lancet, H:1087-1093, 1966). Efectivamente, se informó posteriormente que una mutación en el fragmento Fc-bisagra causa cambios concomitantes en el catabolismo, en la transferencia maternofetal y, en particular, en la unión a FcRn (Ghetie y col., lmmunology Today, 1 8(12):592-598,1997).

Estas observaciones sugirieron que porciones del dominio constante de la IgG controlan el metabolismo de la IgG, incluida la velocidad de degradación de la IgG en suero a través de interacciones con el FcRn. Efectivamente, el aumento de la afinidad de unión a FcRn aumentó la semivida en suero de la molécula (Kim y col., Eur. J. lmmunol., 24:2429-2434, 1994; Popov y col., Mol. lmmunol., 33: 493-502, 1996; Ghetie y col., Eur. J. lmmunol., 26:690-696, 1996; Junghans y col., Proc. NatI. Acad Sci. USA, 93: 5512-551 6, 1996; Israel y col., lmmunol., 89:573-578, 1996).

Diversos experimentos de mutagénesis específica de sitio en la región Fc de IgG de ratón han conducido a la identificación de determinados restos de aminoácidos implicados en la interacción entre IgG y FcRn (Kim y col., Eur. J. lmmunol., 24: 2429-2434, 1994; Medesan y col., Eur. J. lmmunol., 26:2533, 1996; Medesan y col., J. lmmunol., 158:2211-2217, 1997). Estos estudios y estudios de comparación de secuencias encontraron que la isoleucina en la posición 253, la histidina en la posición 310 y la histidina en la posición 435 (de acuerdo con la numeración de Kabat, Kabat y col., en: Sequences of Proteins of lmmunological lnterest, Departamento de salud y servicios humanos de Estados Unidos, 1991, que se incorpora al presente documento por referencia en su totalidad), se conservan en gran medida en IgG de seres humanos y roedores, lo que sugiere su importancia en la unión IgG-FcRn.

Adicionalmente, diversas publicaciones describen procedimientos para obtener moléculas fisiológicamente activas cuyas semividas se modifican bien por introducción de un polipéptido de unión a FcRn a las moléculas (documento WO 97/43316; patente de Estados Unidos 5.869,046; patente de Estados Unidos Nº 5.747.035; documento WO 96/32478; documento WO 91/14438) o bien por fusión de las moléculas con anticuerpos cuyas afinidades de unión a FcRn se conservan, pero las afinidades por otros receptores Fc se han reducido en gran medida (documento WO 99/43713) o bien por fusión con dominios de unión a FcRn de anticuerpos (documento WO 00/09560; patente de Estados Unidos Nº 4.703.039). No obstante, ninguna de estas publicaciones divulga mutantes específicos en el dominio constante de la IgG que afecten a su semivida.

Estudios anteriores han demostrado que determinadas mutaciones del dominio constante reducen realmente la unión a FcRn y, de este modo, reducen la semivida in vivo de la IgG. La publicación PCT WO 93/22332 (por Ward y col.) divulga diversas IgG de ratón recombinantes cuya semivida in vivo se ha reducido mediante mutaciones entre aproximadamente el resto 253 y aproximadamente el resto 434. En particular, se encontró que las sustituciones de isoleucina en la posición 253,... [Seguir leyendo]

1. Una molécula modificada que comprende una proteína o agente no proteico y un dominio constante de IgG, en la que el dominio constante de IgG comprende un dominio CH2 humano en el que hay una sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 252, numerado de acuerdo con el índice EU de Kabat, en el que la molécula modificada tiene una semivida prolongada en comparación con la semivida de una molécula que comprende la proteína o el agente no proteico y un dominio constante de IgG correspondiente que comprende un dominio CH2 de tipo silvestre humano, y en la que la sustitución en el resto 252 es una sustitución por tirosina, fenilalanina, triptofano o treonina.

2. La molécula modificada de la reivindicación 1, en la que el dominio constante de IgG es un dominio constante de IgG humana.

3. La molécula modificada de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el dominio constante de IgG humana es lgG1, lgG2, lgG3 o lgG4.

4. La molécula modificada de acuerdo con la reivindicación 3, en la que el dominio constante de IgG humana es lgG1.

5. La molécula modificada de acuerdo con la reivindicación 2, 3 ó 4, en la que el dominio constante de IgG de la molécula modificada comprende una o varias sustituciones de aminoácidos en uno o varios de los restos de aminoácidos 251, 253-256, 285-290, 308-314, 385-389 y 428-436 respecto a un dominio constante de IgG humana de tipo silvestre.

6. La molécula modificada de acuerdo con la reivindicación 2, 3 ó 4, en la que el dominio constante de IgG de la molécula modificada comprende una o varias sustituciones de aminoácidos en uno o varios de los restos de aminoácidos 254, 256, 309, 311, 314, 428, 433, 434, 436 ó 436 respecto a un dominio constante de IgG humana de tipo silvestre.

7. La molécula modificada de acuerdo con la reivindicación 1, 2, 3 ó 4, en la que el dominio constante de IgG de la molécula modificada comprende una sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 254 y una sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 256 respecto a un dominio CH2 humano de tipo silvestre.

8. La molécula modificada de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, en la que el dominio constante de IgG de la molécula modificada comprende una o varias sustituciones de aminoácidos en uno o varios de los restos de aminoácidos 385, 386, 387 ó 389 respecto a un dominio constante de IgG humana de tipo silvestre.

9. La molécula modificada de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, en la que la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 254 es una sustitución por treonina; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 256 es una sustitución por fenilalanina, serina, arginina, glutamina, ácido glutámico, ácido aspártico, alanina o asparagina; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 309 es una sustitución por prolina; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 311 es una sustitución por serina, ácido glutamico o leucina; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 433 es una sustitución por lisina, arginina, serina, isoleucina, prolina o glutamina; y la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 434 es una sustitución por histidina, fenilalanina o tirosina.

10. La molécula modificada de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, en la que la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 252 es una sustitución por tirosina; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 254 es una sustitución por treonina; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 256 es ácido glutámico; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 433 es una sustitución por lisina; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 434 es una sustitución por fenilalanina; y la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 436 es una sustitución por histidina.

11. La molécula modificada de acuerdo con la reivindicación 7, en la que la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 254 es una sustitución por treonina y la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 256 es una sustitución por fenilalanina, serina, arginina, glutamina, ácido glutámico, ácido aspártico, alanina o asparagina.

12. La molécula modificada de acuerdo con la reivindicación 7, en la que la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 252 es una sustitución por tirosina; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 254 es una sustitución por treonina y la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 256 es una sustitución por ácido glutámico.

13. La molécula modificada de acuerdo con la reivindicación 7, en la que la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 252 es una sustitución por tirosina; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 254 es una sustitución por treonina y la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 256 es una sustitución por fenilalanina, serina, arginina, glutamina, ácido glutámico, ácido aspártico, alanita o asparagina.

14. La molécula modificada de acuerdo con la reivindicación 7, en la que la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 254 es una sustitución por treonina y en la que la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 256 es una sustitución por ácido glutámico.

15. La molécula modificada de acuerdo con la reivindicación 8, en la que la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 385 es una sustitución por arginina, ácido aspártico, serina, treonina, histidina, lisina, alanina o glicina; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 386 es una sustitución por treonina, prolina, ácido aspártico, serina, lisina, arginina, isoleucina o metionina; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 387 es una sustitución por arginina, histidina, serina, treonina o alanina; y la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 389 es una sustitución por prolina, serina o asparagina.

16. La molécula modificada de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, en la que la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 428 es una sustitución por metionina, treonina, leucina, fenilalanina o serina.

17. La molécula modificada de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, en la que la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 314 es una sustitución por alanina.

18. La molécula modificada de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la sustitución del resto de aminoácido en el resto de aminoácido 251 es una sustitución por arginina; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 254 es una sustitución por treonina; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 255 es una sustitución por leucina, glicina, isoleucina o arginina; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 256 es una sustitución por serina, arginina, glutamina, ácido glutámico, ácido aspártico, alanina o asparagina; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 308 es una sustitución por una treonina o isoleucina; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 309 es una sustitución por prolina; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 311 es una sustitución por serina, ácido glutámico o leucina; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 312 es una sustitución por alanina; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 314 es una sustitución por alanina; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 385 es una sustitución por arginina, ácido aspártico, serina, treonina, histidina, lisina, alanina o glicina; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 386 es una sustitución por treonina, prolina, ácido aspártico, serina, lisina, arginina, isoleucina o metionina; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 387 es una sustitución por arginina, histidina, serina, treonina o alanina; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 389 es una sustitución por prolina, asparagina o serina; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 428 es una sustitución por metionina, treonina, leucina, fenilalanina o serina; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 433 es una sustitución por lisina, arginina, serina, isoleucina, prolina, glutamina o histidina; la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 434 es una sustitución por fenilalanina, tirosina o histidina; y la sustitución de aminoácido en el resto de aminoácido 436 es una sustitución por histidina, asparagina, arginina, treonina, lisina o metionina.

19. La molécula modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 18, en la que el dominio constante de IgG de la molécula modificada tiene una afinidad superior por el FcRn que un dominio constante de IgG humana de tipo silvestre.

20. La molécula modificada de acuerdo con la reivindicación 19, en la que el dominio constante de IgG de la molécula modificada tiene una afinidad superior por el FcRn que un dominio constante de IgG humana de tipo silvestre a pH 6,0 que a pH 7,4.

21. La molécula modificada de acuerdo con la reivindicación 20, en la que la molécula modificada es una IgG modificada.

22. La molécula modificada de acuerdo con la reivindicación 21, en la que la molécula modificada es una IgG humana o humanizada modificada.

23. La molécula modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en la que la molécula modificada es un proteína de fusión que comprende una proteína no IgG unida covalentemente a un dominio constante de IgG.

24. La molécula modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en la que el agente no proteico está conjugado a un dominio constante de IgG.

25. Una composición farmacéutica que comprende la molécula modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

26. Un kit que comprende la molécula modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en un recipiente, e instrucciones de uso.

27. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio constante de la molécula modificada tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.

28. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 27.

29. Una molécula modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, para usar en el tratamiento

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o la prevención de una enfermedad o trastorno en un sujeto.

30. La molécula modificada de acuerdo con la reivindicación 29, en la que el sujeto es un ser humano.

5 31. Una molécula modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, para su uso en el diagnóstico de una enfermedad o trastorno.

32. Un anticuerpo conjugado que comprende la molécula modificada de acuerdo con la reivindicación 21 ó 22 y una sustancia detectable.

33. Un anticuerpo conjugado que comprende la molécula modificada de acuerdo con la reivindicación 21 ó 22 y un resto 10 terapéutico.

34. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo conjugado de acuerdo con la reivindicación 32 ó 33 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

35. Un kit que comprende el anticuerpo conjugado de acuerdo con la reivindicación 32 ó 33 e instrucciones para su uso.

36. El anticuerpo conjugado de la reivindicación 33 para la prevención o tratamiento de una enfermedad o trastorno.

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