Moléculas de fusión y variantes de IL-15.

Una variante interleuquina 15 humana (hIL-15) aislada que comprende una sustitución de aminoácido de N a D en la posición 72 de una secuencia de IL-15 humana madura (SEQ ID NO:

1), en donde la variante de hIL-15 funciona como un agonista IL- 15 y tiene un incremento de la actividad de unión para los receptores de cadena beta/gamma del receptor de interleuquina 15 (IL-15RßγC) en comparación con el polipéptido de IL-15 nativo.

Molïculas de fusiïn y variantes de IL-15

Antecedentes de la invenciïn Los Receptores de Cïlulas T (TCR) son efectores primarios del sistema inmunitario que tienen ventajas ïnicas como plataforma para desarrollar agentes terapïuticos. Si bien los agentes terapïuticos de anticuerpos se limitan al reconocimiento de patïgenos en la sangre y los espacios extracelulares o a dianas proteicas sobre la superficie de la cïlula, los receptores de cïlulas T pueden reconocer antïgenos presentados con molïculas del MHC sobre las superficies de las cïlulas (incluyendo antïgenos derivados de proteïnas intracelulares) . Dependiendo del subtipo de cïlulas T que reconocen el antïgeno presentado y se activan, los receptores de cïlulas T y las cïlulas T que albergan los receptores de cïlulas T pueden participar en el control de diversas respuestas inmunitarias. Por ejemplo, las cïlulas T estïn implicadas en la regulaciïn de la respuesta inmunitaria humoral a travïs de la inducciïn de la diferenciaciïn de las cïlulas B a cïlulas productoras de anticuerpos. Ademïs, las cïlulas T activadas actïan iniciando las respuestas inmunitarias mediadas por cïlulas. De este modo, los receptores de cïlulas T pueden reconocer dianas adicionales no disponibles para los anticuerpos.

Las cïlulas T son un subgrupo de cïlulas que junto con otros tipos de cïlulas inmunitarias (cïlulas polimorfonucleares, eosinïfilos, basïfilos, mastocitos, cïlulas B y NK) constituyen el componente celular del sistema inmunitario. En condiciones fisiolïgicas, las cïlulas T funcionan en la vigilancia inmunitaria y en la eliminaciïn de antïgenos forïneos. Sin embargo, en condiciones patolïgicas existe una evidencia convincente de que las cïlulas T juegan un papel principal en la causalidad y la propagaciïn de enfermedades. En estos trastornos, el desmoronamiento de la tolerancia inmunolïgica de las cïlulas T, ya sea central o perifïrica es un proceso fundamental en la causalidad de la enfermedad inmunitaria.

Se cree que los TCR juegan un papel importante en el desarrollo y la funciïn del sistema inmunitario. Por ejemplo, se ha informado de que los TCR median la destrucciïn celular, incrementan la proliferaciïn de las cïlulas B, e impactan en el desarrollo y la gravedad de diferentes trastornos incluyendo cïncer, alergias, infecciones virales y trastornos autoinmunitarios.

Por lo tanto serïa deseable proporcionar agentes de direccionamiento novedosos basados en los receptores de las cïlulas T, asï como mïtodos para producir y utilizar tales agentes para marcos terapïuticos y diagnïsticos. Por consiguiente, serïa particularmente deseable proporcionar molïculas que tuvieran ciertas ventajas en comparaciïn con los complejos de la tïcnica anterior basados en el direccionamiento de anticuerpos.

Por otra parte, es deseable utilizar los TCR para dirigir las diferentes molïculas efectoras al sito de la enfermedad donde pueden proporcionar beneficio terapïutico sin los efectos secundarios asociados con la actividad sistïmica no dirigida. Uno de ellos es la IL-15, un miembro de la familia de linfoquinas de cuatro haces de hïlices alfa. La IL-15 juega un papel multifacïtico en el desarrollo y el control del sistema inmunitario. Mïs especïficamente, la IL-15 influye en la funciïn, el desarrollo, la supervivencia, y la proliferaciïn de las cïlulas T CD8+, las cïlulas NK, las cïlulas T asesinas, las cïlulas B, los linfocitos intraepiteliales intestinales (LIE) y las cïlulas presentadoras de antïgenos (CPA) . Se ha demostrado que los ratones transgïnicos tanto IL-15-/-, como IL-15Ra-/-carecen de poblaciones de cïlulas T NK perifïricas y asesinas, ciertos subgrupos de LIE, y la mayor parte de cïlulas T CD8+ de fenotipo de memoria, sugiriendo que la IL-15 juega un papel en el desarrollo, la proliferaciïn o/y la supervivencia de estos tipos de cïlulas. El receptor (R) de IL-15 consiste en tres polipïptidos, el IL-15R alfa de tipo especïfico ("IL15Rα" o "IL-15Ra") , el IL-2/IL-15R beta ("IL-2Rβ" o "IL-15Rb") , y la cadena gamma comïn ("γC, " o "gC" que es compartida por mïltiples receptores de citoquinas) .

La seïalizaciïn de IL-15 se puede producir a travïs del complejo heterotrimïrico de IL-15Rα, IL-2Rβ y γC; a travïs del complejo heterodimïrico de IL-2Rβ y γC. Un mecanismo novedoso de acciïn de la IL-15 es el de la transpresentaciïn en la que la IL-15 y el IL-15Rα son expresados de manera coordinada por las cïlulas presentadoras de antïgenos (monocitos y cïlulas dendrïticas) , y la IL-15 unida al IL-15Rα se presenta en trans a las cïlulas T Nk o CD8 prïximas que expresan solamente el receptor IL-15RβγC. En cuanto al evento co-estimulador que se produce en la sinapsis inmunolïgica, la transpresentaciïn de IL-15 parece ser ahora un mecanismo dominante para la acciïn de IL-15 in vivo y parece jugar un papel principal en la inmunovigilancia tumoral (Waldmann, TA, 2006, Nature Rev. Immunol. 6:595-601) . Se ha demostrado que las subunidades de IL-2Rα soluble, que inducen isoformas que contienen una deleciïn del exïn 3 y el denominado dominio "sushi" en el extremo N, portan la mayor parte de los elementos estructurales responsables de la uniïn de las citoquinas. Mientras IL-2Rα solo es un receptor de baja afinidad para la IL-2 (Kd _10 nM) , IL-15Rα se une a IL-15 con una afinidad elevada (Kd_ 100 pM) . De este modo el IL-2Rα soluble y la IL-15 son capaces de formar complejos heterodimïricos estables en disoluciïn y estos complejos son capaces de modular (esto es estimular o bloquear) las respuestas inmunitarias a travïs del complejo de IL-15R de afinidad elevada o intermedia (Mortier et al. 2006. J Biol Chem 281: 1612-1619; Stoklasek et al. 2006. J Immunol 177: 6072-6080; Rubinstein et al. 2006. Proc Natl Acad Sci U S A 103: 9166-9171) .

El documento US 2004/253587 A1 describe antagonistas de interleuquina-15 de mamïfero y muteïnas de IL-15 y

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molïculas de IL-15 modificadas que son capaces de unirse a la subunidad IL-15Rα y que son incapaces de transducir una seïal a travïs de las subunidades β o γ del complejo receptor de IL-15.

El documento WO 2006/063974 A2 describe una composiciïn que comprende una matriz antigïnica ordenada y repetitiva, en donde el antïgeno es una proteïna IL-15, una muteïna de IL-15 o un fragmento de IL-15.

La entrada de la base de datos que tiene el Nïm. de acceso de la base de datos 097687, procedente del Nïmero de acceso EBI UniProt: 097687 describe la secuencia de aminoïcidos de Felis silvestris catus. (1 de Mayo, 1999) .

La entrada de la base de datos que tiene el Nïm. de acceso de la base de datos Q8SPY0, procedente del Nïmero de acceso EBI UniProt: Q8SPY0 describe la secuencia de 128 aminoïcidos de la interleuquina-15 de Canis familiaris. (1 Junio, 2002)

La entrada de la base de datos que tiene el Nïm. de acceso de la base de datos Q6B4I6, procedente del Nïm. de acceso EBI UniProt: Q6B4I6 describe la secuencia de 162 aminoïcidos de la interleuquina-15 de Equus caballus. (13 Septiembre, 2004)

Dados los efectos conocidos de la IL-15 sobre el sistema inmunitario, se han explorado numerosos enfoques basados en IL-15 para manipular el sistema inmunitario en beneficio de los anfitriones. Si bien la administraciïn de IL-15 se ha empleado para reforzar las respuestas inmunitarias o aumentar la reconstituciïn del sistema inmunitario, el bloqueo de la actividad de IL-15 puede inhibir las respuestas autoinunitarias y otras respuestas inmunitarias no deseadas (Waldmann, TA, 2006, Nature Rev. Immunol. 6:595-601) . De hecho, una de las limitaciones con el tratamiento sistïmico con IL-15 es la posible inducciïn de enfermedades autoinmunitarias. Otras limitaciones incluyen la dificultad para producir esta citoquina en sistemas de expresiïn de cïlulas de mamïfero convencionales asï como su vida media muy corta in vivo. Por lo tanto, existe la necesidad de generar una forma terapïutica inmunoestimuladora adecuada de IL-15 que presente una vida media in vivo mïs prolongada, un aumento de la actividad de uniïn a cïlulas inmunitarias, o un incremento de la bioactividad. Adicionalmente existe la necesidad de antagonistas de IL-15 eficaces. En teorïa serïa deseable que tales molïculas fueran dirigidas selectivamente al lugar de la enfermedad para evitar toxicidades sistïmicas no deseadas y proporcionar un beneficio terapïutico mïs eficaz.

Compendio de la invenciïn La presente descripciïn proporciona numerosas variantes de IL-15 y complejos de proteïnas de fusiïn solubles que tienen uso terapïutico y mïtodos para elaborar tales proteïnas.

Las variantes de IL-15 y los complejos solubles descritos en... [Seguir leyendo]

1. Una variante interleuquina 15 humana (hIL-15) aislada que comprende una sustituciïn de aminoïcido de N a D en la posiciïn 72 de una secuencia de IL-15 humana madura (SEQ ID NO: 1) , en donde la variante de hIL-15

funciona como un agonista IL- 15 y tiene un incremento de la actividad de uniïn para los receptores de cadena beta/gamma del receptor de interleuquina 15 (IL-15RβγC) en comparaciïn con el polipïptido de IL-15 nativo.

2. Una variante interleuquina humana 15 (hIL-15) aislada que comprende una sustituciïn de aminoïcido de N a R en la posiciïn 72 de una secuencia de IL-15 humana madura (SEQ ID NO: 1) , en donde la variante de hIL-15 funciona como un antagonista de IL-15 y tiene una disminuciïn de la actividad de uniïn para los receptores IL

15RβγC en comparaciïn con el polipïptido nativo de la IL-15.

3. Una secuencia de ïcido nucleico que codifica la variante de IL-15 de la reivindicaciïn 1 o 2.

4. Un vector de ADN que comprende la secuencia de ïcido nucleico de la reivindicaciïn 3.

5. Una cïlula anfitriona que comprende el vector de la reivindicaciïn 4.

6. Un mïtodo para producir la variante de IL-15 de la reivindicaciïn 1 o 2, comprendiendo el mïtodo: 15 cultivar la cïlula anfitriona de la reivindicaciïn 5 en condiciones suficientes para expresar la variante de IL

15; producir de este modo la variante de IL-15.

7. El mïtodo de la reivindicaciïn 6, que comprende adicionalmente la purificaciïn de la variante de IL-15.

8. Una cantidad eficaz de la variante de IL-15 de la reivindicaciïn 1 para su uso en un mïtodo de 20 estimulaciïn de respuestas inmunitarias en un mamïfero.

9. Una cantidad eficaz de la variante de IL-15 de la reivindicaciïn 2 para su uso en un mïtodo para suprimir las respuestas inmunitarias en un mamïfero.