Moléculas de ácido nucleico que codifican alternansacarasa.

Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene actividad de alternansacarasa seleccionada del grupo constituido por:

(a) moléculas de ácido nucleico que codifican al menos la forma madura de una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ. ID No. 2 o la secuencia de aminoácidos que es codificada por el cDNA contenido en el plásmido DSM 12666; (b) moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ. ID No. 1 o la secuencia de nucleótidos del cDNA contenido en el plásmido DSM 12666 o una secuencia de ribonucleótidos correspondiente; (c) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína, cuya secuencia de aminoácidos tiene una homología de al menos 40% con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ. ID No. 2; (d) moléculas de ácido nucleico, una de cuyas cadenas se hibrida con una cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que se definen en (a) o (b); (e) moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento biológicamente activo de la proteína que es codificada por una cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que se definen en (a), (b), (c) o (d); y (f) moléculas de ácido nucleico, cuya secuencia de nucleótidos se desvía, debido a la degeneración del código genético, de la secuencia de las moléculas de ácido nucleico que se definen en (a), (b), (c), (d) o (e).

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2000/000954.

Solicitante: BAYER BIOSCIENCE GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: Hermannswerder 20a 14473 Potsdam ALEMANIA.

Inventor/es: WELSH, THOMAS, QUANZ, MARTIN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A23L1/09
  • A61K8/60 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 8/00 Cosméticos o preparaciones similares para el aseo. › Azúcares; Sus derivados.
  • A61K8/73 A61K 8/00 […] › Polisacáridos.
  • A61Q19/00 A61 […] › A61Q USO ESPECIFICO DE COSMETICOS O DE PREPARACIONES SIMILARES PARA EL ASEO.Preparaciones para el cuidado de la piel.
  • C08B37/00 QUIMICA; METALURGIA.C08 COMPUESTOS MACROMOLECULARES ORGANICOS; SU PREPARACION O PRODUCCION QUIMICA; COMPOSICIONES BASADAS EN COMPUESTOS MACROMOLECULARES.C08B POLISACARIDOS; SUS DERIVADOS (polisacáridos que contienen menos de seis radicales sacáridos unidos entre sí por enlaces glucosídicos C07H; procesos de fermentación o procesos que utilizan enzimas C12P 19/00; producción de celulosa D21). › Preparación de polisacáridos no previstos en los grupos C08B 1/00 - C08B 35/00; Sus derivados (celulosa D21).
  • C12N1/21 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/09 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12N15/31 C12N 15/00 […] › Genes que codifican proteínas microbianas, p. ej. enterotoxinas.
  • C12N15/54 C12N 15/00 […] › Transferasas (2).
  • C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
  • C12N9/10 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Transferasas (2.) (ribonucleasas C12N 9/22).
  • C12P19/02 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › Monosacáridos.
  • C12P19/04 C12P 19/00 […] › Polisacáridos, es decir, compuestos que contienen más de cinco radicales sacárido unidos entre ellos por enlaces glucosídicos.
  • C12P19/08 C12P 19/00 […] › Dextrano.
  • C12P19/18 C12P 19/00 […] › preparados por acción de una transferasa glicosílica, p. ej. alfa-, beta- o gamma-ciclodextrinas.
  • C12R1/19 C12 […] › C12R SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C - C12Q, RELATIVO A LOS MICROORGANISMOS.C12R 1/00 Microorganismos. › Escherichia coli.
Moléculas de ácido nucleico que codifican alternansacarasa.

Fragmento de la descripción:

Moléculas de ácido nucleico que codifican alternansacarasa.

La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican una alternansacarasa. Además, esta invención se refiere a vectores, células hospedadoras y células vegetales transformadas con las moléculas de ácido nucleico descritas en esta memoria, y plantas que contienen dichas células. Además, se describen métodos para preparar plantas transgénicas que debido a la inserción de las moléculas de DNA que codifican una alternansacarasa, sintetizan el carbohidrato alternano. Adicionalmente, se describen métodos para la preparación de alternano.

Se citan más adelante documentos de la técnica anterior, el contenido de cuyas descripciones se incluye en la presente solicitud por referencia a los mismos.

El alternano es un polisacárido compuesto de unidades de glucosa. Las unidades de glucosa están enlazadas unas a otras por enlaces glicosídicos α-1,3 y α-1,6, y dichos dos tipos de enlaces aparecen predominantemente de manera alternante. Sin embargo, el alternano no es un polisacárido lineal, sino que puede contener ramificaciones (Seymour et al., Carbohydrate Research 74, (1979), 41-62). Debido a sus propiedades fisicoquímicas, las posibilidades de aplicación del alternano en la industria farmacéutica, por ejemplo como soporte de ingredientes farmacéuticamente activos y como aditivo en la industria textil, de los cosméticos y alimentaria han sido expuestas (López-Munguía et al., Enzyme Microb. Technol. 15, (1993) 77-85; Leathers et al., Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 18, (1997), 278-283). Además, el alternano puede utilizarse como sustituto para la goma arábiga (Coté, Carbohydrate Polymers 19, (1992), 249-252).

La industria tiene un gran interés en métodos biotecnológicos para preparación de oligosacáridos y polisacáridos, y en particular del alternano que es difícilmente accesible o no es accesible en absoluto a la síntesis orgánica clásica. En comparación con el enfoque clásico de la química orgánica de síntesis, los procesos biotecnológicos ofrecen ventajas. Por ejemplo, las reacciones catalizadas enzimáticamente exhiben como regla especificidades mucho mayores (regioespecificidad, estereoespecificidad) y velocidades de reacción más altas, transcurren en condiciones de reacción más suaves y conducen a mayores rendimientos. Estos factores son de importancia excepcional en la preparación de nuevos oligosacáridos y polisacáridos.

El alternano se prepara enzimáticamente con el uso de enzimas que poseen la actividad biológica de las alternansacarasas. Las alternansacarasas pertenecen al grupo de las glucosiltransferasas que, partiendo de la sacarosa, son capaces de catalizar la formación de alternano y fructosa. Hasta ahora, se han encontrado únicamente alternasas en la bacteria Streptococcus mutans (Mukasa et al. (J. Gen. Microbiol. 135 (1989), 2055-2063); Tsumori et al. (J. Gen. Microbiol. 131 (1985), 3347-3353)) y en cepas específicas de la bacteria Gram-positiva Leuconostoc mesenteroides donde aquéllas están, como regla, presentes junto con otras enzimas formadoras de polisacáridos, tales como por ejemplo dextransacarasas formadoras de dextrano, o junto con enzimas degradantes de polisacáridos, tales como alternanasas. Por tanto, las cepas existentes naturalmente producen también dextrano además de alternano.

Hasta ahora, el alternano se ha preparado en un sistema exento de células utilizando proteínas parcialmente purificadas o por fermentación utilizando cepas productoras de alternansacarasa de Leuconostoc mesenteroides.

Se han descrito diversos métodos de purificación para la purificación de las alternansacarasas (López-Munguía et al., Enzyme Microb. Technol. 15 (1993), 77-85; López-Munguía et al., Annals New York Academy of Sciences 613 (1990), 717-722; Coté y Robyt, Carbohydrate Research 101 (1982), 57-74). Estos métodos son complejos y relativamente costosos, y, como regla, conducen a bajos rendimientos de proteína (Leathers et al., Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 18 (1997), 278-283). Ninguno de estos métodos hace posible la producción de la proteína alternansacarasa en condiciones de pureza elevada, por lo que la secuenciación de la proteína y el aislamiento de las secuencias de DNA correspondientes no han tenido éxito hasta ahora. Si la proteína alternansacarasa purificada de acuerdo con estos métodos se utiliza para preparación in vitro de alternano, entonces los residuos de la proteína dextransacarasa contenidos en la preparación de alternansacarasa producen impurezas de dextrano en el alternano producido. La separación de alternano y dextrano consume un tiempo relativamente largo y es costosa (Leathers et al., Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 18 (1997), 278-283). Otra desventaja de las impurezas de la proteína dextransacarasa contenidas en la preparación enzimática de la proteína alternansacarasa es el hecho de que una parte del sustrato sacarosa se convierte en dextrano y no en alternano, lo cual da como resultado una reducción del rendimiento de alternano.

La preparación fermentativa por medio de Leuconostoc conduce también a la formación de mezclas de los productos alternano y dextrano. Con objeto de aumentar la cantidad de alternansacarasa a partir de cepas de Leuconostoc se han aislado mutantes, tales como el mutante NRRL B-21138, que secretan la alternansacarasa y conducen a una mayor proporción de la cantidad de alternansacarasa formada con relación a dextransacarasa. No obstante, si se fermentan tales mutantes con sacarosa, el alternano obtenido continúa presentando impurezas de dextrano (Leathers et al., Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 18 (1997), 278-283).

Como se puede ver por la técnica anterior arriba expuesta, no ha sido posible proporcionar hasta ahora la proteína alternansacarasa altamente purificada.

Por esta razón, la presente invención aborda el problema de proporcionar medios y métodos que permitan la preparación de alternano de una manera que ahorra tiempo y es económica.

Este problema se resuelve por la provisión de las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones de patente.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que posee la actividad biológica de una alternansacarasa seleccionada del grupo constituido por

(a) moléculas de ácido nucleico que codifican al menos la forma madura de una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ. ID No. 2 o la secuencia de aminoácidos codificada por el cDNA contenido en el plásmido DSM 12666;
(b) moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ. ID No. 1 o la secuencia de nucleótidos del cDNA contenido en el plásmido DSM 12666 o una secuencia de ribonucleótidos correspondiente;
(c) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína, cuya secuencia de aminoácidos tiene una homología de al menos 40% con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ. ID No. 2;
(d) moléculas de ácido nucleico, una de cuyas cadenas se hibrida con las moléculas de ácido nucleico que se definen en (a) o (b);
(e) moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento biológicamente activo de la proteína que es codificada por una cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que se definen en (a), (b), (c) o (d); y
(f) moléculas de ácido nucleico, cuya secuencia de nucleótidos se desvía, debido a la degeneración del código genético, de la secuencia de las moléculas de ácido nucleico que se definen en (a), (b), (c), (d) o (e).

Por consiguiente, la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas que poseen la actividad biológica de una alternansacarasa, codificando preferiblemente dichas moléculas proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ. ID No. 2.

Debe entenderse que una enzima que posee la actividad enzimática o biológica de una alternansacarasa (E.C. 2.4.1.140) significa una enzima que es capaz de catalizar ...

 


Reivindicaciones:

1. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene actividad de alternansacarasa seleccionada del grupo constituido por:

(a) moléculas de ácido nucleico que codifican al menos la forma madura de una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ. ID No. 2 o la secuencia de aminoácidos que es codificada por el cDNA contenido en el plásmido DSM 12666;
(b) moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ. ID No. 1 o la secuencia de nucleótidos del cDNA contenido en el plásmido DSM 12666 o una secuencia de ribonucleótidos correspondiente;
(c) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína, cuya secuencia de aminoácidos tiene una homología de al menos 40% con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ. ID No. 2;
(d) moléculas de ácido nucleico, una de cuyas cadenas se hibrida con una cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que se definen en (a) o (b);
(e) moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento biológicamente activo de la proteína que es codificada por una cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que se definen en (a), (b), (c) o (d); y
(f) moléculas de ácido nucleico, cuya secuencia de nucleótidos se desvía, debido a la degeneración del código genético, de la secuencia de las moléculas de ácido nucleico que se definen en (a), (b), (c), (d) o (e).

2. Un oligonucleótido o polinucleótido que se hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

3. Un vector que contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.

4. El vector de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la molécula de ácido nucleico está conectada en orientación de sentido a elementos reguladores que aseguran la transcripción y síntesis de un RNA traducible en células procariotas o eucariotas.

5. El plásmido pAlsu-pSK depositado bajo el número de acceso DSM 12666.

6. Una célula hospedadora transformada con una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o un vector de la reivindicación 3 ó 4 o descendiente de una célula de este tipo.

7. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, que es una célula de un microorganismo.

8. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, que es una célula de E. coli.

9. Un método para preparar una proteína o fragmento de la misma, teniendo dicha proteína o fragmento de la misma actividad de alternansacarasa, en donde una célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 se cultiva en condiciones que permiten la síntesis de la proteína, y en donde la proteína se aísla de las células cultivadas y/o del medio de cultivo.

10. Una proteína o fragmento de la misma que tiene actividad de alternansacarasa codificada por una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o preparada de acuerdo con el método de la reivindicación 9, que no exhibe contaminación alguna con una proteína que tiene una actividad de síntesis de polisacáridos.

11. Una célula de planta transgénica transformada con una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o un vector de la reivindicación 3 ó 4, o descendiente de una célula de este tipo, en donde dicha molécula de ácido nucleico que codifica la proteína que tiene actividad de alternansacarasa se encuentra bajo el control de elementos reguladores que permiten la transcripción de un mRNa traducible en células vegetales.

12. Una planta que contiene las células vegetales de la reivindicación 11.

13. La planta de acuerdo con la reivindicación 12, que es una planta útil.

14. La planta de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, que es una planta que almacena azúcar o que almacena almidón.

15. Material de propagación de una planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, comprendiendo dicho material de propagación las células vegetales de la reivindicación 11.

16. Un método para preparar alternano que comprende los pasos de extraer y aislar el alternano de una planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14.

17. Un método para preparar alternano y/o fructosa, en donde:

a) una célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 secreta una alternansacarasa en un medio de cultivo que contiene sacarosa; y
b) se aísla(n) alternano y/o fructosa del medio de cultivo.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la célula hospedadora está inmovilizada.

19. Un método para preparar alternano y/o fructosa, en donde:

a) una solución que contiene sacarosa se pone en contacto con una proteína de la reivindicación 10 en condiciones que permiten la conversión de sacarosa en alternano y/o fructosa; y
b) se aísla(n) alternano y/o fructosa de la solución.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde la proteína está inmovilizada sobre un material soporte.

21. Un método para preparar alternano y/o fructosa, en donde

a) una solución que contiene sacarosa se pone en contacto con una proteína de la reivindicación 10 y moléculas aceptoras en condiciones que permiten la conversión de la sacarosa en alternano y/o fructosa; y
b) se aísla(n) alternano y/o fructosa de la solución.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde la molécula aceptora se selecciona del grupo constituido por maltosa, isomaltosa, isomaltotriosa y metil-α-D-glucano.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 21 ó 22, en donde la proteína está inmovilizada.

24. Un método para preparar productos cosméticos o productos alimenticios que comprende un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23 y la formulación del alternano resultante en una forma adecuada para uso como producto cosmético o alimenticio.


 

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