Procedimiento de preparación de moléculas biológicas conjugadas.

Un procedimiento de preparación de un compuesto de la fórmula general:**Fórmula**

en la que cada uno de X e X' representa polietilenglicol, y el otro representa un átomo de hidrógeno;

cada Q representa independientemente un grupo de unión;

W representa un grupo ceto CO, un grupo éster -O-CO- o un grupo sulfona -SO2-, o un grupo obtenido por reducción de tal grupo; o, si X' representa polietilenglicol, X-Q-W- juntos representan un grupo ciano;

Z representa una proteína que está unida a A y B por medio de dos grupos tiol que se han obtenido de un puente disulfuro de la proteína;

A es una cadena de alquileno o alquenileno C1-5; y

B es un enlace o una cadena de alquileno o alquenileno C1-4;

que comprenden la reducción de un puente disulfuro en una proteína, y hacer reaccionar el producto resultante en un medio de reacción acuoso bien con

(i) un compuesto de la fórmula general**Fórmula**

en la que X, X', Q, A, B y L tienen los significados dados anteriormente, W' representa un grupo ceto o aldehído CO, un grupo éster -O-CO- o un grupo sulfona -SO2-, y cada L representa independientemente un grupo saliente;

o (ii) un compuesto de la fórmula general**Fórmula**

en la que X, X', Q, A, y L tienen los significados dados para la fórmula general II, y m representa un número entero de 1 a 4.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10175143.

Solicitante: POLYTHERICS LIMITED.

Nacionalidad solicitante: Reino Unido.

Dirección: The London Biotechnology Innovation Centre 2 Royal College Street Camden London, NW1 0TU REINO UNIDO.

Inventor/es: BROCCHINI, STEPHEN, JAMES, GODWIN,ANTONY,ROBERT, PEDONE,ELISA, CHOI,JI-WON.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales caracterizadas por los... > A61K47/48 (estando el ingrediente no activo químicamente unido al ingrediente activo, p. ej. conjugados polímero-medicamento)

PDF original: ES-2542531_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Procedimiento de preparación de moléculas biológicas conjugadas

Esta Invención se refiere un procedimiento de preparación de moléculas biológicas conjugadas. Además, se refiere a nuevos derivados químicamente funclonalizados de polietilenglicol.

Muchas moléculas terapéuticamente activas no tienen las propiedades requeridas para lograr eficacia en el uso médico clínico. Por ejemplo, se están descubriendo ahora y produciendo por la Industria farmacéutica y por Ingeniería genética proteínas y pollpéptldos terapéuticamente activos. Aunque en la actualidad se comercializan en los Estados Unidos como mínimo 80 medicinas basadas en proteínas y hay como mínimo 350 medicinas más basadas en proteínas sometidas a ensayos clínicos (Harris J., Chess R: Effect of Pegylatlon on Pharmaceuticals, Nature Revlew Drug Dlscovery, 2003, 2, 214-221), la mayoría de las proteínas naturales no permiten hacer medicinas porque, después de administración a pacientes, hay varios inconvenientes Inherentes entre los que están Incluidos: las proteínas son digeridas por muchas endopeptidasas y exopeptldasas presentes en la sangre o en tejidos, (2) muchas proteínas son ¡nmunógenas en cierta cuantía y (3) las proteínas pueden ser rápidamente excretadas por ultraflltraclón en el riñón. Entre otras moléculas usadas como agentes terapéuticos activos en medicinas que son slstémlcamente tóxicas o carecen de biodisponibilidad y propiedades farmacocinéticas óptimas están Incluidas moléculas de bajo peso molecular de las que una dosis eficaz está limitada por la toxicidad. Tales moléculas se usan rutinariamente para tratar la inflamación y afecciones debidas a neoplasias malignas, infección y enfermedad autolnmune.

Se usan polímeros sintéticos solubles en agua, en particular polialquilenglicoles, para conjugar moléculas terapéuticamente activas tales como proteínas. Estos conjugados terapéuticos han demostrado que alteran favorablemente la farmacoclnétlca por prolongar el tiempo de circulación y disminuir la velocidad de depuración, disminuir la toxicidad slstémlca y, en vahos casos, presentar una eficacia clínica acrecentada. Este procedimiento de conjugar covalentemente polietilenglicol, PEG, a proteínas, se conoce comúnmente como "PEGilación", y se han examinado muchos polímeros diferentes como polímeros de conjugación.

Muchos reactivos polímeros para conjugación comprenden funcionalidad química de conjugación que es hidrópicamente Inestable. Son ejemplos de reactivos polímeros hidrolíticamente inestables de conjugación, ásteres activos que Incluyen, por ejemplo, carbonatas de polióxido de alquileno-N-succinimida (Zalipsky, patente U.S. n°. 5.122.614). Estos reactivos tienen semivldas relativamente cortas en medio acuoso, que incluye sangre o plasma. Esto da por resultado la necesidad de añadir excesos estequiométricos grandes del reactivo de conjugación del polímero. La estabilidad hidrolítica del reactivo es importante porque el requerimiento de añadir excesos estequiométricos para la conjugación de proteínas requiere un esfuerzo y un coste significativos para purificar el conjugado de polímero-proteína de la mezcla de reacción. Además, estos reactivos hidrolíticamente inestables tienden a reaccionar preferiblemente con la funcionalidad química amina de la proteína, en particular con la amina s de los restos de lisina. Puesto que la mayoría de las proteínas de interés tienen más de un resto de lisina y, frecuentemente, muchos restos de lisina, la conjugación tiende a ser inespecífica en cuanto a que se produce en muchos sitios del resto en la proteína. Es posible purificar la mezcla de reacción de conjugación para aislar proteínas conjugadas a una molécula de polímero, aunque no es posible aislara un coste razonable conjugados de polímero- proteína de los que la totalidad están conjugados al mismo grupo amina en la proteína. Frecuentemente, la conjugación no específica da por resultado una función proteínica empeorada. Por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo con unión de polijóxido de etileno) al azar mediante restos de lisina dan por resultado anticuerpos modificados (o fragmentos de anticuerpo modificados) capaces de unirse a antígeno diana con afinidad, avidez o especificad reducida. Además, los reactivos de conjugación de amina específicos para polímeros requieren una condiciones de conjugación que deben seleccionarse para asegurar que las aminas de la proteína no sean protonadas. Estas condiciones requieren un medio con un pH moderadamente alto (8-10), que permite que los restos amina sean lo suficientemente reactivos para reaccionar con el reactivo de conjugación del polímero. Frecuentemente, las condiciones de un pH alto son perjudiciales para la proteína, causando cambios estructurales y desnaturalización. Esto procesos dan por resultado un empeoramiento de la función proteínica. Los reactivos específicos para la conjugación de polímeros a amina tienden a unirse a sitios accesibles de amina de la proteína. Estos reactivos se pueden llamar reactivos cinéticos. Son lábiles y reaccionan con la mayor parte de los sitios nucleófilos amino evaluables de la proteína. Los reactivos que conjugan polímeros específicos a amina que se conjugan por acilación de amina dan por resultado la pérdida de carga positiva en el grupo amina del resto de aminoácido de la proteína que normalmente estaría presente en condiciones fisiológicas para la proteína no conjugada. Estos rasgos de los reactivos de conjugación de polímeros específica a amina frecuentemente dan por resultado un empeoramiento de la función de la proteína. Otros grupos funcionales de conjugación incorporados en polímeros para conjugación a proteínas y que son aminaespecíficos y que con frecuencia son hidrolíticamente lábiles incluyen los isocianatos (documento WO 94/04193) y los carbonatas (documento WO 90/13540).

Es particularmente relevante para una eficacia optimizada y para asegurar la consistencia de dosis a dosis, cuidar de que el número de moléculas de polímero conjugadas por proteína sea el mismo y que cada molécula de polímero esté específicamente conjugada covalentemente al mismo resto de aminoácido en cada molécula de proteína. La conjugación no específica en sitios a lo largo de una molécula de proteína da por resultado una distribución de productos de conjugación y, frecuentemente, proteína no conjugada, obteniéndose una mezcla compleja que es

difícil, laboriosa y cara de purificar.

Se han desarrollado reactivos de conjugación de polímeros específica a tiol para proteínas con el fin tratar las limitaciones a la propensión de los reactivos de conjugación a experimentar hidrólisis que sea competitiva con la conjugación a la proteína, la conjugación no específica de polímero en diferentes restos de aminoácido de la proteína y la necesidad de condiciones de pH alto en la reacción de conjugación. Los reactivos de conjugación específica de polímeros a tiol se pueden utilizar a valores del pH próximos a la neutralidad a los que los restos funcionales amina de los restos de aminoácidos de la proteína se protonan y no pueden así competir eficazmente en la reacción de conjugación con el reactivo de conjugación del polímero. Los reactivos de conjugación específica de polímeros a tiol y que son relativamente más estables hidrópicamente que los reactivos específicos a amina antes mencionados se pueden utilizar en un exceso estequlométrlco menor, reduciendo así el coste durante la purificación del conjugado polímero-proteína. Entre los restos funcionales de conjugación que son ampliamente selectivos para grupos tiol están Incluidos yodoacetamida, maleümlda (documento WO 92/16221), vlnllsulfona (documentos WO 95/13312 y WO 95/34326), vinilpiridinas... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento de preparación de un compuesto de la fórmula general:

xq

X'-

**(Ver fórmula)**

z

(I)

en la que cada uno de X e X representa polietilenglicol, y el otro representa un átomo de hidrógeno;

cada Q representa independientemente un grupo de unión;

W representa un grupo ceto CO, un grupo éster -O-CO- o un grupo sulfona -S02-, o un grupo obtenido por reducción de tal grupo; o, si X representa polietilenglicol, X-Q-W- juntos representan un grupo ciano;

Z representa una proteína que está unida a A y B por medio de dos grupos tiol que se han obtenido de un puente disulfuro de la proteína;

A es una cadena de alquileno o alquenileno Ci_5; y

B es un enlace o una cadena de alquileno o alquenileno C1-4;

que comprenden la reducción de un puente disulfuro en una proteína, y hacer reaccionar el producto resultante en un medio de reacción acuoso bien con (i) un compuesto de la fórmula general

X-Q-W AL

x.- q^BL

(II)

en la que X, X, Q, A, B y L tienen los significados dados anteriormente, W representa un grupo ceto o aldehido CO, un grupo éster -O-CO- o un grupo sulfona -SO2-, y cada L representa independientemente un grupo saliente; o (ii) un compuesto de la fórmula general

**(Ver fórmula)**

en la que X, X, Q, A, y L tienen los significados dados para la fórmula general II, y m representa un número 20 entero de 1 a 4.

2. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 1, llevado a cabo a un pH entre 5,5 y 8.

3. Un procedimiento según se reivindica en cualquier reivindicación 1 o reivindicación 2, llevado a cabo a una temperatura entre 3 y 37 °C.

4. Un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el grupo de

unión Q representa independientemente un enlace directo, un grupo alquileno, o un grupo arilo o heteroarilo

opcionalmente sustituido, cualquiera de los cuales se puede determinar o interrumpir por uno o más átomos de oxígeno o más, átomos de azufre, grupos -NR en los que R representa un grupo alquilo o arilo, grupos ceto, grupos -O-CO- y/o grupos -CO-O-.

5. Un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el o cada

grupo saliente L representa -SR, -S02R, -0S02R,-N+R3,-N+HR2,-N+H2R, halógeno, o -00, en los que R representa

un grupo alquilo o arilo y 0 representa un grupo arilo sustituido que contiene al menos un sustituyente aceptor de electrones.

6. Un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polietilenglicol tiene un peso molecular en el intervalo de 2.000 a 75.000 g/mol.

7. a-metoxi-co-4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil]-acetil]benzamida poli(etilenglicol).

8. El compuesto de la reivindicación 7, derivado de poli(etilenglicol) de peso molecular de 2.000 g/mol a

20.000 g/mol.

9. El compuesto de la reivindicación 8, derivado de poli(etilenglicol) de peso molecular de 2.000 g/mol a

20.000 g/mol.