Molécula de ARNnpU1 humana modificada, gen que codifica para la molécula de ARNnpU1 humana modificada, vector de expresión que incluye el gen y el uso del mismo en terapia génica.

Una molécula de ARNnpU1 humana modificada, que puede corregir el salto de un exón provocado por una mutación localizada en la secuencia comprendida entre 50 pares de bases en el sentido de 5' y 20 pares de bases en el sentido de 3' de un exón

, caracterizándose la molécula de ARNnpU1 humana modificada porque una parte de la secuencia monocatenaria de nucleótidos de la región en 5' del ARNnpU1 humano silvestre se reemplaza por una secuencia monocatenaria de unión de nucleótidos que puede hibridarse con una secuencia de nucleótidos diana en el pre-ARNm transcrito de un gen diana de interés terapéutico que porta una mutación que induce salto de exón, que se selecciona del grupo que consiste en mutaciones en la secuencia comprendida entre 50 pares de bases en el sentido de 5' y 20 pares de bases en el sentido de 3' de un exón, estando la secuencia diana ubicada en una región del pre-ARNm del gen diana comprendida entre 2 y 50 pares de bases en el sentido de 3' de un sitio de unión exón/intrón, cuyo corte y empalme se ve afectado por dicha mutación.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/IB2011/054573.

Solicitante: Universita' degli Studi di Ferrara.

Nacionalidad solicitante: Italia.

Dirección: Via Savonarola, 9 44100 Ferrara ITALIA.

Inventor/es: PAGANI,FRANCO, PINOTTI,MIRKO.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K48/00 (Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen ingredientes... > A61K31/7105 (Acidos ribonucleicos naturales, es decir conteniendo unicamente ribosas unidas a la adenina, la guanina, la citosina, o el uracilo y teniendo enlaces 3'-5' fosfodiester)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/113 (Acidos nucleicos no codificantes que modulan la expresión de genes, p.ej. oligonucleótidos antisentido)

PDF original: ES-2545815_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Molécula de ARNnpUl humana modificada, gen que codifica para la molécula de ARNnpUl humana modificada, vector de expresión que Incluye el gen y el uso del mismo en terapia gènica

La presente Invención se refiere a moléculas de ARNnp humanas modificadas (a continuación en el presente documento designadas como U1 especificas de exón, ExSpeUl), que son adecuadas para usarse en métodos de terapia gènica. En particular, la Invención se refiere a moléculas de ARNnp que pueden corregir procesos de corte y empalme aberrantes provocados por mutaciones genéticas y relacionados con enfermedades humanas con diferentes historiales clínicos, que son a menudo muy graves.

Muchas enfermedades genéticas humanas (aproximadamente el 15%) están provocadas permutaciones genéticas que, al Interferir en la maduración ¡ntracelular correcta del ARN mensajero, comprometen la posterior blosíntesis de proteínas exacta e Inducen la síntesis de proteínas no funcionales. Principalmente, las mutaciones puntuales responsables de defectos de corte y empalme se producen en secuencias génlcas que son críticas para el reconocimiento del transcrito primarlo por la maquinarla destinada al procesamiento del mismo. Los sitios donador y aceptor ubicados en los límites exón-lntrón, así como elementos reguladores específicos de gen en exones o ¡ntrones (Cartegni L ef a/., 2002; Pagan! ef a/., 2004) están entre las secuencias más significativas. Como consecuencia de estas mutaciones, pueden Inducirse diversos acontecimientos moleculares, que lo más frecuentemente producen la exclusión de un exón del transcrito maduro, el denominado salto de exón.

Se sabe desde hace mucho tiempo que cambios moleculares en el procesamiento del ARN mensajero, que implican por ejemplo salto de exón, representan el mecanismo etlopatógeno principal de diversas enfermedades humanas, entre las cuales se encuentran la hemofilia B, flbrosls quístlca y atrofia muscular espinal, que comparten la gravedad de su evolución clínica. Diferente tipos de mutaciones pueden Inducir salto de exón, y específicamente mutaciones en el sitio donador (o sitio de corte y empalme en 5'), mutaciones en el sitio aceptor (sitio de corte y empalme en 3') o mutaciones exónlcas. Como ejemplos de diferentes tipos de mutaciones que inducen salto de exón, a continuación se describen tres modelos de enfermedades humanas.

El defecto en el factor de coagulación IX (FIX) explica la aparición de hemofilia B, una enfermedad a la que acompañan grados variables de manifestaciones hemorráglcas, algunas veces muy graves e incapacitantes. En algunos casos, la enfermedad está provocada por defectos de corte y empalme. En particular, la exclusión del exón 5 del ARNm durante el proceso de corte y empalme está provocado tanto por mutaciones en la posición -2 dentro del sitio donador del exón 5 del gen del factor IX (F9), como por mutaciones en las posiciones -8 y -9 dentro de la secuencia de poll-plrlmldlna en el sitio aceptor.

Las limitaciones de la terapia actual para la hemofilia B, que se basa principalmente en la infusión frecuente de FIX exógeno recomblnante o de FIX derivado directamente de plasma, ponen de relieve la necesidad de desarrollar enfoques alternativos que se caractericen por una mayor eficacia y un efecto de larga duración.

La flbrosls quístlca (CF) es la enfermedad hereditaria congènita mortal más frecuente en la población de raza blanca: un recién nacido de cada 2500-2700 lactantes nacidos vivos se ve afectado por la misma.

La patogenia de esta enfermedad es secundarla a una anomalía de una proteina designada como CFTR (regulador de la conductancia transmembrana de la flbrosls quístlca, Cysf/c Bóros/s Transmemórane Conducfance Regu/afor) ubicado en la membrana apical de células epiteliales y que tiene la función de regular los Intercambios hldroelectrolítlcos.

Como consecuencia de la modificación de CFTR, la transferencia de sales a través de las membranas celulares se ve comprometida, provocando principalmente una producción de secreciones que podrían definirse como "deshidratado": un sudor muy rico en sodio y cloro y una mucosldad densa y viscosa que tiende a obstruir los conductos, comprometiendo la función de diversos órganos y sistemas. En el transcurso de varios estudios, se Identificaron muchas modificaciones en la secuencia gènica de CFTR asociadas con flbrosls quístlca, que Inducen salto de exón. En particular, el salto del exón 12 está provocado tanto por mutaciones ubicadas dentro del sitio donador de corte y empalme del propio exón, como por mutaciones exónlcas.

La atrofia muscular espinal (SMA, OMIM 253300, 253550 y 253400) es una enfermedad neuromuscular autosómlca recesiva caracterizada por degeneración de motoneuronas alfa de la médula espinal, con una prevalencla estimada de 1/10.000 nacidos. SMA está asociada con síndromes clínicos que van de extremadamente graves, con ¡"¡Ipotonia muscular crítica y debilidad desde el nacimiento, a formas más leves en las que la aparición se produce más tarde durante la Infancia o la adolescencia. Hasta la fecha, no se ha Identificado aún ningún tratamiento para esta enfermedad, que conduce generalmente a la muerte a una edad que depende de la gravedad del historial clínico.

En el 95% de los casos, la enfermedad está provocada por la ausencia del gen de SMN1. En el genoma humano, hay un gen homólogo a SMN1 denominado SMN2. Sin embargo, la expresión de SMN2 se ve alterada por una mutación sinónima en el exón que da como resultado una maduración aberrante del ARN mensajero con el consiguiente salto del exón 7 y la inactivación del propio gen. Enfoques diseñados para aumentar el número de transcritos de SMN2 que contienen el exón 7 permitirían por tanto aplicar una terapia de compensación para la

ausencia del gen de SMN1 gracias a la expresión correcta de SMN2, con considerables Implicaciones para un posible tratamiento eficaz para SMA.

Durante el proceso de corte y empalme, los ARN nucleares pequeños (ARNnp) desempeñan un papel importante como componentes esenciales del espllceosoma, la maquinarla celular destinada a mediar en todo el proceso de maduración del ARNm. En particular, el ARN pequeño U1 (ARNnpUl), de 164 rlbonucleótidos de longitud, está codificado por genes que aparecen en varias coplas dentro del genoma humano y representa el componente ribonucleico de la partícula nuclear RNPnpUI. Las moléculas de ARNnpUl tienen una estructura tridimensional de tallo y bucle y dentro de la región 5' Incluyen una secuencia monocatenaria, generalmente de 9 nucleótidos de longitud, que puede unirse por apareamiento de bases complementarlas al sitio donador de corte y empalme en la molécula de pre-ARNm (Horowitz ef a/., 1994). La figura 1 muestra una representación esquemática de la estructura de ARNnpUl silvestre. La secuencia en la reglón 5' que puede reconocer el sitio donador de corte y empalme se muestra apareada con la secuencia consenso del sitio donador de corte y empalme en los transcritos primarios de genes eucariotas. Una secuencia de este tipo presenta grados variables de conservación y está ubicada en la unión exón/lntrón. El reconocimiento mediado por la reglón en 5' de ARNnpUl es crítico para definir las uniones exón/lntrón en el transcrito primario y para un correcto ensamblaje del complejo del espllceosoma.

El creciente número de enfermedades genéticas humanas asociadas con defectos de corte y empalme del pre- ARNm, y la frecuente gravedad de la evolución clínica de las mismas, estimuló en los últimos años la investigación de moléculas terapéuticas dirigidas a corregir defectos de corte y empalme a nivel molecular.

El uso de moléculas de ARNnpUl modificadas que pueden Inducir /n v/fro la Inclusión correcta del exón y... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1.

Una molécula de ARNnpUl humana modificada, que puede corregir el salto de un exón provocado por una mutación localizada en la secuencia comprendida entre 50 pares de bases en el sentido de 5' y 20 pares de bases en el sentido de 3' de un exón, caracterizándose la molécula de ARNnpUl humana modificada

porque una parte de la secuencia monocatenarla de nucleótldos de la reglón en 5' del ARNnpUl humano silvestre se reemplaza por una secuencia monocatenarla de unión de nucleótldos que puede hlbrldarse con una secuencia de nucleótldos diana en el pre-ARNm transcrito de un gen diana de Interés terapéutico que porta una mutación que Induce salto de exón, que se selecciona del grupo que consiste en mutaciones en la secuencia comprendida entre 50 pares de bases en el sentido de 5' y 20 pares de bases en el sentido de

3' de un exón, estando la secuencia diana ubicada en una reglón del pre-ARNm del gen diana comprendida entre 2 y 50 pares de bases en el sentido de 3' de un sitio de unión exón/lntrón, cuyo corte y empalme se ve afectado por dicha mutación.

2.

La molécula de ARNnpUl humana modificada según la reivindicación 1, en la que la parte de la región en 5' que se reemplaza por la secuencia de unión de nucleótldos tiene de 9 a 20 nucleótidos de longitud.

15 3.

La molécula de ARNnpUl humana modificada según la reivindicación 1 ó 2, en la que el gen diana de Interés terapéutico es el gen del factor de coagulación IX, el gen de SMN2 o el gen de CFTR.

4.

La molécula de ARNnpUl humana modificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la secuencia de unión de nucleótldos se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7,

8, 9, 10.

20 5.

La molécula de ARNnpUl humana modificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso en el tratamiento terapéutico de una enfermedad genética provocada poro asociada con el salto de exón.

6.

La molécula de ARNnpUl humana modificada para su uso según la reivindicación 5, en la que la enfermedad es flbrosls quístlca, hemofilia B o atrofia muscular espinal.

7.

Un gen aislado que codifica para una molécula de ARNnpUl humana modificada según cualquiera de las

reivindicaciones 1 a 4.

8.

El gen aislado según la reivindicación 7, que comprende una secuencia promotora y una secuencia de señal de polladenllaclón.

9.

El gen aislado según la reivindicación 8, en el que el promotor es el promotor endógeno del gen que codifica para ARNnpUl humano.

30 10.

El gen aislado según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, para su uso en el tratamiento terapéutico de una enfermedad genética provocada por salto de exón.

11.

El gen aislado para su uso según la reivindicación 10, en el que la enfermedad esfibrosis quística, hemofilia B o atrofia muscular espinal.

12.

Un vector de expresión que comprende un gen aislado según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.

35 13.

El vector de expresión según la reivindicación 12, que es un vector de virus adeno-asociado.

14.

El vector de expresión según las reivindicaciones 12 ó 13, para su uso en el tratamiento terapéutico de una enfermedad genética provocada por o asociada con salto de exón.

15.

El vector de expresión para su uso según la reivindicación 14, en el que la enfermedad es fibrosis quística, hemofilia B o atrofia muscular espinal.

40 16.

Una composición farmacéutica que comprende una molécula de ARNnpUl humana modificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un gen aislado según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, o un vector de expresión según la reivindicación 12 ó 13, y un portador farmacéuticamente aceptable.

17.

Un método /n v/fro para restaurar en una célula en cultivo el corte y empalme correcto de un gen diana de interés terapéutico que porta una mutación que Induce salto de exón, que comprende transfectar la célula

en cultivo con un vector de expresión según la reivindicación 12 ó 13.