Procedimientos y composiciones para modular la activación del factor de crecimiento de hepatocitos.

Un procedimiento de identificación de una sustancia inhibidora candidata que inhibe la activación por hepsina del factor de crecimiento de hepatocitos

(HGF), comprendiendo dicho procedimiento: (a) poner en contacto una sustancia candidata con una primera muestra que comprende hepsina y un sustrato de pro-HGF, y (b) comparar la cantidad de activación del sustrato de pro-HGF en la muestra con la cantidad de activación del sustrato de pro-HGF en una muestra de referencia que comprende cantidades similares de hepsina y sustrato de pro-HGF como la primera muestra, pero que no se ha puesto en contacto con dicha sustancia candidata, por lo que una disminución en la cantidad de activación del sustrato de pro-HGF en la primera muestra en comparación con la muestra de referencia indica que la sustancia candidata es capaz de inhibir la activación por hepsina de HGF monocatenario (pro-HGF).

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2005/026446.

Solicitante: GENENTECH, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 1 DNA WAY SOUTH SAN FRANCISCO, CA 94080-4990 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: KIRCHHOFER,DANIEL,K, MORAN,PAUL M, PEEK,MARK D.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/68 (en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/37 (peptidasa o proteinasa)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/74 (en los que intervienen hormonas)

PDF original: ES-2532610_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Procedimientos y composiciones para modular la activación del factor de crecimiento de hepatocitos

Campo técnico

La presente invención se refiere generalmente a los campos de la biología molecular y la regulación de factores de crecimiento. Más específicamente, la invención se refiere a moduladores de la ruta de señalización de HGF/c-met, y a usos de dichos moduladores.

Antecedentes

La hepsina (también conocida como TMRPRSS 1) es una serina proteasa similar a quimotripsina expresada en la superficie celular y un miembro de la familia de las serina proteasas de transmembrana tipo II (TTSP) , que también 15 incluye matriptasa (también conocida como MT-SP1) y enteropeptidasa (1) . El gen de hepsina humano, localizado sobre el cromosoma 19 en q11-13.2 (2) , codifica un polipéptido de 417 aminoácidos (3) que comprende una cola citoplásmica corta del extremo N, una región transmembrana y un dominio extracelular (Arg45 -Leu417) compuesto de los dominios ricos en cisteína del receptor secuestrante (SRCR) y de proteasa. El zimógeno de hepsina se activa autocatalíticamente por la escisión en Arg162 -Ile163 (4) , formando una enzima heterodimérica con el dominio de proteasa ligado por disulfuro (Cys153-Cys277) al dominio SRCR. Además del enlace Cys-Cys covalente, la estructura cristalina recientemente determinada de la hepsina reveló que los dominios SRCR y de proteasa comparten una amplia región de interfase, enterrando cada dominio aproximadamente 1200Ã2 (5) . Debido a que esta región de interfase se localiza próxima a los residuos proximales a la membrana del dominio SRCR, el dominio de la proteasa hepsina y el sitio activo pueden posicionarse próximos a la superficie celular (5) . Esto es fundamentalmente diferente de otras serinas proteasas ensambladas en la superficie celular, tales como los factores de coagulación VIIa (FVIIa) 1, IXa y Xa, cuyos sitios activos están localizados muy por encima (60 -80 Ã) de la superficie de la membrana (6-8) .

La función fisiológica de la hepsina ha sido imprecisa. Excepto por el factor de coagulación VII, no se conocen sustratos macromoleculares y no se han identificado inhibidores fisiológicamente relevantes. Se sugirió una función de la hepsina en la coagulación de la sangre por Kazama y col. (1995) (9) , demostrando que las células transfectadas con hepsina pueden activar el factor de coagulación VII. Sin embargo, ratones deficientes en hepsina fueron viables y no mostraron trastornos de la coagulación de la sangre (10, 11) , poniendo en entredicho la importancia de la hepsina en la hemostasia normal. Sin embargo, es posible que la hepsina pueda contribuir a la 35 formación de fibrina en situaciones patológicas, tales como carcinoma de células renales (12) , en las que el iniciador primario de la coagulación de la sangre, el factor tisular, (13, 14) , está ausente. Además, otros estudios han sugerido un enlace funcional entre la hepsina y el crecimiento celular. Dependiendo de la línea celular tumoral y las condiciones experimentales usadas, se ha informado que la hepsina tiene actividad promotora del crecimiento (15) o supresora del crecimiento (16) . Información adicional referente a la hepsina puede encontrarse en, entre otros, la publicación PCT nº WO2004/009803; patente de EE.UU. nº 6.482.630; patente de EE.UU. nº 6.423.543; patente de EE.UU. nº 5.981.830; publicación de solicitud de patente de EE.UU. nº 2004/0009911 A1; publicación de solicitud de patente de EE.UU. nº 2004/0001801 A1; publicación de solicitud de patente de EE.UU. nº 2003/0223973 A1; publicación de solicitud de patente de EE.UU. nº 2003/0175736 A1; publicación de solicitud de patente de EE.UU. nº 2003/0013097 A1 (también WO02/059373) ; publicación de solicitud de patente de EE.UU. nº 2003/0049645

(también WO02/064839) ; y publicación de solicitud de patente de EE.UU. nº 2004/0132156.

Recientes experimentos de expresión génica identificaron hepsina como uno de los genes más altamente regulados por incremento en cáncer de próstata (17-22) . La tinción in situ mostró expresión de hepsina sobre células epiteliales de las glándulas secretoras de la próstata (19) . La expresión de hepsina se correlacionó con la transformación neoplásica (19) , siendo la mayor en tumores de pacientes con enfermedad avanzada y la menor en hiperplasia benigna (18, 22) . A diferencia, un estudio encontró que la baja expresión de la proteína hepsina se correlacionó con altas puntuaciones de Gleason y tumores grandes (20) . No es evidente si esta aparente contradicción está relacionada con los procedimientos usados, es decir, inmunohistoquímica (20) frente a la cuantificación de ARN (18, 22) . Además, la hepsina también está fuertemente regulada por incremento en cáncer de ovario (23) y en 55 carcinoma de células renales, en los que está asociado principalmente al tipo de célula epitelial (12) .

En la superficie de células epiteliales, la hepsina está situada idealmente para interaccionar con componentes de la matriz extracelular y otras proteínas asociadas a la membrana. Se sabe que las serina proteasas similares a quimotripsina, que incluyen la TTSP matriptasa (sinónimo MT-SP1) (24, 25) que está estructuralmente relacionada con la hepsina, activan enzimas fibrinolíticas, metaloproteasas de matriz y formas latentes de factores de crecimiento, tales como factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) . El HGF promueve la proliferación celular, migración, angiogénesis, supervivencia y morfogénesis, activando la tirosina cinasa de receptor Met (revisada en (26, 27) ) . Además de su importancia en la fisiología normal, la ruta de HGF/Met participa en el crecimiento tumoral invasivo y la metástasis tumoral (26) . El HGF tiene alta similitud con la serina proteasa plasminógeno y está 65 compuesto por una cadena α que contiene un dominio N y cuatro dominios Kringle y una cadena β con homología por proteasas similares a quimotripsina. Es secretada en la matriz extracelular como un precursor monocatenario

inactivo (pro-HGF) y requiere la escisión por activación en Arg494 -Val495 para formar el heterodímero α/β ligado a disulfuro biológicamente competente (28-31) . Esta etapa está mediada por pro-HGF, que convierte las serina proteasas, tales como el activador del factor de crecimiento de hepatocitos (HGFA) (32) , matriptasa (33, 34) , activador del plasminógeno tipo urocinasa (u-PA) (35) , factor XIIa (36) , factor XIa y calicreína del plasma (34) . El HGFA y la matriptasa se inhiben por inhibidores tipo Kunitz expresados en la superficie celular, tales como las dos variantes de corte y empalme del inhibidor del activador de factores de crecimiento de hepatocitos HAI-1 (37, 38) y HAI-1 B (34) y por HAI-2 (39) . HAI-2 (también conocido como bikunina placentaria) (40) también inhibe potentemente el factor XIa y la calicreína del plasma (41) , mientras que HAI-1 B tiene poca o ninguna actividad inhibidora (34) . Por tanto, la disponibilidad biológica del conjunto de pro-HGF en la matriz extracelular está regulada por las actividades de pro-HGF convertasas y sus inhibidores.

El perfil de expresión de la hepsina en tejidos con cáncer como se ha descrito anteriormente, acoplado a su posible función en actuar de regulador de otros factores de crecimiento, cuya desregulación podría subyacer la carcinogénesis, sugiere que la modulación de la interacción de hepsinas con su sustrato podría demostrar ser un enfoque terapéutico eficaz. A este respecto, hay una clara necesidad en identificar sustrato fisiológico para hepsina y/o su (s) modulador (es) fisiológico (s) . La invención cumple esta necesidad y proporciona otros beneficios.

Divulgación de la invención

Como se ha escrito en el presente documento, un sustrato... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento de identificación de una sustancia inhibidora candidata que inhibe la activación por hepsina del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) , comprendiendo dicho procedimiento: (a) poner en contacto una sustancia candidata con una primera muestra que comprende hepsina y un sustrato de pro-HGF, y (b) comparar la cantidad de activación del sustrato de pro-HGF en la muestra con la cantidad de activación del sustrato de pro-HGF en una muestra de referencia que comprende cantidades similares de hepsina y sustrato de pro-HGF como la primera muestra, pero que no se ha puesto en contacto con dicha sustancia candidata, por lo que una disminución en la cantidad de activación del sustrato de pro-HGF en la primera muestra en comparación con la muestra de referencia indica que la sustancia candidata es capaz de inhibir la activación por hepsina de HGF monocatenario (pro-HGF) .

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la sustancia se une a hepsina o a pro-HGF.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la sustancia compite con hepsina para unirse a pro-HGF.

4. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la sustancia compite con pro-HGF para unirse a hepsina.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que la sustancia comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o el 99 % de identidad de secuencias con pro-HGF.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la secuencia de aminoácidos carece de al menos una porción de

la cadena β de HGF. 25

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la hepsina en la muestra está en una cantidad eficaz para activar dicho pro-HGF.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el sustrato de pro-HGF es un polipéptido que comprende HGF o fragmento del mismo que comprende una forma de tipo salvaje del enlace peptídico R494-V495.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el sustrato de pro-HGF comprende un sitio de escisión de HGF humano que se ajusta al sitio de escisión consenso de proteasas en donde el sitio de escisión comprende residuo básico en la posición P1 y dos residuos de aminoácidos hidrófobos en las posiciones P1' y P2'.

10. Una molécula antagonista que inhibe la activación de pro-HGF por hepsina y puede unirse a pro-HGF o hepsina para su uso en inhibir la activación de pro-HGF por hepsina en el tratamiento de una afección patológica asociada a la activación de c-met en un sujeto, en donde la molécula:

(i) es un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a pro-HGF o hepsina;

(ii) comprende un polipéptido que comprende una secuencia del dominio de Kunitz (KD) que es capaz de inhibir la activación de pro-HGF por hepsina;

(iii) comprende al menos una porción del inhibidor-1, -1 B o -2 del activador del factor de crecimiento de hepatocitos humano (HAI-1, HAI-1B o HAI-2) , o variante de los mismos;

(iv) compite con pro-HGF para unirse a hepsina y comprende un fragmento de HGF que puede unirse a hepsina y que carece de al menos una porción de la cadena β de HGF y tiene actividad de activación de c-met reducida en comparación con HGF de tipo salvaje; o (v) compite con pro-HGF por unirse a hepsina y comprende un HGF mutante que tiene una secuencia de aminoácidos que tienen al menos aproximadamente el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o el 99 % de identidad de secuencias con pro-HGF que puede unirse a hepsina y carece de capacidad para activar c-met.

11. La molécula antagonista para su uso según la reivindicación 10, en la que la secuencia del dominio de Kunitz (KD) comprende una secuencia del dominio 1 de Kunitz (KD-1) .

12. La molécula antagonista para su uso según la reivindicación 10, en la que la porción del inhibidor-1, -1 B o -2 del activador del factor de crecimiento de hepatocitos humano (HAI-1, HAI-1 B o HAI-2) , o variante de los mismos, comprende una secuencia del dominio de Kunitz (KD) que es capaz de inhibir la activación de pro-HGF por hepsina.

13. La molécula antagonista para su uso según las reivindicacióones 10 o 12, en la que la secuencia del dominio de Kunitz (KD) es:

(i) la secuencia del dominio 1 de Kunitz (KD-1) del inhibidor-1, -1 B del activador del factor de crecimiento de hepatocitos humano (HAI-1, HAI-1B) , o variante de los mismos; o (ii) uno o ambos de los dominios de Kunitz del inhibidor-2 del activador del factor de crecimiento de hepatocitos 65 humano (HAI-2) , o variante del mismo.

14. La molécula antagonista para su uso según la reivindicación 10 (v) , en la que la cadena β de HGF está mutada o la molécula carece de al menos una porción de la cadena β de HGF.

15. La molécula antagonista para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en donde la molécula 5 está ligada a una toxina.

16. Uso de una molécula antagonista como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15 en la preparación de un medicamento para inhibir la activación de pro-HGF por hepsina en el tratamiento de una afección patológica asociada a la activación de c-met en un sujeto.

17. La molécula antagonista para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15 o el uso de la reivindicación 16, en donde la afección es un cáncer, un tumor, un trastorno proliferativo de células, un trastorno inmunitario o un trastorno relacionado con la angiogénesis.

18. La molécula antagonista para su uso según la reivindicación 17, en donde el cáncer es cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, carcinoma papilar, cáncer de colon, cáncer pancreático, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer del sistema nervioso central, cáncer de próstata, sarcoma osteogénico, carcinoma renal, carcinoma hepatocelular, cáncer de vejiga, carcinoma gástrico, carcinoma escamoso de cabeza y cuello, melanoma o leucemia. 20

19. Una composición que comprende una molécula como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15 y un vehículo para su uso en el tratamiento como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 10 o 16 a 18.

20. La composición para su uso según la reivindicación 19, en la que el vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable.