Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España en los últimos 80 años. Clasificación Internacional de Patentes CIP 2013.

MODIFICACION GENETICA DE CELULAS SOMATICAS Y USOS DE LAS MISMAS.

Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen:

Un procedimiento de transferencia nuclear que comprende:

(a) preparar una célula somática no humana para la transferencia nuclear por un procedimiento que comprende modificar el material genético de la célula somática no humana mediante un acontecimiento de modificación génica dirigida en un locus endógeno; y

(b) transferir el material genético desde la célula somática no humana hasta una célula receptora no humana.

Solicitante: PPL THERAPEUTICS (SCOTLAND) LIMITED.

Nacionalidad solicitante: Reino Unido.

Dirección: ROSLIN,,EDINBURGH, MIDLOTHIAN EH25.

Inventor/es: COLMAN,ALAN, SCHNIEKE,ANGELIKA ELISABETH, KIND,ALEXANDER JARVIS, AYARES,DAVID LEE, DAI,YIFAN.

Fecha de Publicación de la Concesión: 11 de Mayo de 2010.

Fecha Concesión Europea: 23 de Diciembre de 2009.

Clasificación Internacional de Patentes: A01K67/027M, H04L12/24C2, H04L12/24F3, C12N15/10B, C12N15/90B4, H04L12/24A2.

Clasificación PCT: C12N15/88 (...utilizando la micro-encapsulación, p. ej. utilizando vesículas liposómicas [5]), C12N15/10 (..Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C 07 H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C 12 P 19/34) [5]), A01K67/027 (.Nuevas razas de vertebrados [5]), C12N5/06 (.Células o tejidos animales [5]), C12N15/90 (...Introducción estable de ADN extraño en el cromosoma [5]).

Clasificación antigua: A01K67/027 (.Nuevas razas de vertebrados [5]).

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MODIFICACION GENETICA DE CELULAS SOMATICAS Y USOS DE LAS MISMAS.
Descripción:

Modificación genética de células somáticas y usos de las mismas.

La presente invención describe la producción de animales modificados genéticamente en los que las modificaciones genéticas están diseñadas en células somáticas cultivadas in vitro usando la técnica de modificación génica dirigida. Las células modificadas genéticamente después se usan como donantes nucleares para producir inter ali, animales vivos.

Los procedimientos descritos también pueden usarse para validar loci en cromosomas animales que son sitios adecuados para adición de transgenes a las células. El procedimiento es particularmente útil para células en las que es necesario que no tengan efectos perjudiciales imprevistos, tales como células destinadas a transplante autólogo.

La técnica de transferencia nuclear permite la producción de descendencia por la reconstrucción de un embrión temprano. El material genético de una célula donante o carioplasto se transfiere a una célula receptora adecuada de la que se ha eliminado el material genético nuclear o genómico. En las primeras demostraciones de esta técnica, se obtuvo un desarrollo satisfactorio solamente cuando el material genético donante se tomaba de blastómeros de embriones tempranos. Posteriormente, se ha obtenido el desarrollo usando material genético donante de células diferenciadas mantenidas en cultivo y aisladas de tejidos embrionarios (Campbell y col., Nature 380, 64-66, 1996), fetales y adultos (Wilmut y col., Nature 385, 810-813, 1997); estos informes forman la base de las solicitudes de patente WO 97/07669 y WO 97/07668 que se incorporan en la presente solicitud en su totalidad, incluyendo todas las tablas y diagramas.

Los procedimientos para la transferencia nuclear también se han descrito en las solicitudes de patente publicadas WO 98/39416, WO 98/30683, WO 98/07841, WO 97/37009, WO 98/27214, WO 99/01163 y WO 99/01164.

Se ha obtenido descendencia viva en ratones usando poblaciones de células quiescentes obtenidas directamente ex vivo como donantes nucleares (Wakayama y col., Nature 394, 369-373 1998). El uso satisfactorio de células diferenciadas también se ha demostrado en ovejas (Wilmut y col., Nature 385, 810-813, 1997), ganado vacuno (Kato y col., Science 282, 2095-2098, 1998; Wells, y col., Theriogenology 1, 217, 1999; Zakhartchenko, y col., Theriogenology 1, 218, 1999; Vignon, y col., Theriogenology 1, 216, 1999) y ratones (Wakayama y col., Nature 394, 369-373).

En todas las referencias citadas anteriormente, la célula donante nuclear y la receptora se toman de la misma especie. Sin embargo, se ha informado de éxito en la consecución del desarrollo de embriones reconstruidos usando células nucleares donantes y receptoras de diferentes especies (Dominko, y col., Theriogenology 49, 385, 1998; Mitalipova, y col., Theriogenology 49, 389, 1998).

El uso de la tecnología de transferencia nuclear tiene muchos beneficios y usos demostrados y potenciales en la producción de embriones, fetos y descendencia de mamíferos. Estos incluyen, entre otros;

1. La capacidad para modificar genéticamente células cultivadas que se van a usar como donantes nucleares antes de la reconstrucción del embrión.

2. La capacidad para realizar múltiples modificaciones genéticas en un único animal mediante modificaciones genéticas múltiples de una población celular en cultivo o mediante modificación genética, transferencia nuclear y re-aislamiento secuencial de una población celular del embrión, feto o animal producido de este modo.

3. La capacidad para aumentar la vida de poblaciones celulares cultivadas que se van a usar para modificación genética mediante transferencia nuclear y re-aislamiento de una población celular del embrión, feto o animal adulto producido de este modo.

4. La capacidad para producir múltiples copias de un animal a partir de una población celular modificada genéticamente, seleccionada y clonada.

5. La capacidad para producir múltiples copias de cualquier embrión, feto o animal adulto por transferencia nuclear desde células tomadas directamente ex vivo, o poblaciones celulares obtenidas de cualquier tejido tomado de cualquiera de estas fases con o sin cultivo in vitro.

6. La capacidad para producir verdaderos clones (que no solo comparten la identidad genética nuclear, sino también la identidad genética mitocondrial) utilizando ovocitos de la línea materna del donante celular como receptores de citoplastos para la reconstrucción de embriones.

7. La capacidad para almacenar genomas intactos durante largos periodos (por ejemplo, congelando poblaciones celulares en N2 líquido) y de usar estas células almacenadas posteriormente para la producción de descendencia por transferencia nuclear.

8. La capacidad para desdiferenciar núcleos somáticos y de producir células no diferenciadas que pueden usarse para producir embriones, fetos y animales adultos quiméricos por agregación del embrión, o inyección. Esto también puede usarse para producir poblaciones de células madre embrionarias o células germinales embrionarias.

9. La capacidad para desdiferenciar cualquier tipo de célula somática por transferencia nuclear y de aislar del embrión producido de este modo, células madre embrionarias, o cualquier otro tipo celular especializado o no especializado deseado, por ejemplo, neuronas.

10. La posibilidad de conseguir cualquiera de los objetivos indicados en 1-9, usando células nucleares donantes y receptoras de diferentes especies.

Este proceso puede acoplarse con las técnicas de manipulación genética para la producción de descendencia transgénica (Schnieke y col., Science 278, 2130-2133, 1997). El uso de transferencia nuclear acoplada a la modificación genética de células en cultivo y su selección antes de la producción del animal tiene varias ventajas demostradas, incluyendo;

1. Producción de animales no mosaico que aseguran la transmisión por la línea germinal de la(s) modificación(es) genética(s) (Schnieke y col., Supra).

2. Una eficacia aumentada en la producción de dichos animales modificados genéticamente (Schnieke y col., Supra).

3. La producción de múltiples copias de la descendencia reduciendo de este modo el intervalo de generación para producir rebaños o manadas de animales comercialmente importantes o aumento la cantidad de animales para la diseminación de la modificación genética en la población como conjunto (Cibelli, y col., Nat. Biotechnol. 16, 642-6, 1998).

La tecnología de transferencia nuclear existente y publicada acoplada con la modificación genética de células en cultivo proporciona animales que contienen modificaciones genéticas sencillas y múltiples en los que los transgenes se incorporan en localizaciones no seleccionadas dentro del genoma hospedador. Sin embargo, la producción de células cultivadas que incorporan una modificación genética deseada diseñada en una localización precisa y predeterminada en el genoma hospedador (modificación genética dirigida) solamente se ha descrito previamente en la técnica para ratones usando células ES y los procedimientos publicados no implican tecnología de transferencia nuclear. No existen dichos procedimientos equivalentes para otros mamíferos. Dichas modificaciones tendrían varias ventajas cuando se aplican a una diversidad de especies animales incluyendo ganado vacuno, ovejas, cabras, caballos, camellos, conejos y roedores. Dichas ventajas incluyen, aunque sin limitación:

1. La producción de animales transgénicos con características superiores de expresión de transgenes colocando el transgén en un sitio predeterminado.

2. La eliminación, modificación, inactivación o reemplazo de un gen o genes endógenos elegidos y/o sus secuencias de control.

3. Si se descubre que dichas modificaciones no tienen efecto prejudicial imprevisto sobre el animal resultante que pudieran atribuirse a, por ejemplo, la alteración de genes endógenos, la activación de oncogenes, etc., esto constituiría la validación del locus elegido como sitio preferido para modificación genética, particularmente si el sitio también confería buena expresión de los transgenes colocados en el locus.

Un objetivo de esta memoria descriptiva de patente es rectificar esta situación y describir por primera vez procedimientos que puedan utilizarse para producir dichas células modificadas que después puedan usarse opcionalmente para producir, inter ali, animales completos por transferencia nuclear. Estos procedimientos (y otros) también pueden usarse para identificar loci cromosómicos específicos como dianas preferidas para la adición de transgenes como parte del proceso de terapia génica ex vivo.

La presente invención proporciona, de acuerdo con un primer aspecto, un procedimiento de transferencia nuclear que comprende: (a) preparar una célula somática no humana para transferencia nuclear por un procedimiento que comprende modificar el material genético de célula somática no humana por un acontecimiento de modificación genética dirigida en un locus endógeno; y (b) transferir el material genético desde la célula somática no humana a una célula receptora no humana. Preferiblemente, la célula somática no humana es una célula somática primaria. Preferiblemente, la célula somática es una célula somática de animal vertebrado. Preferiblemente, la célula no es una célula inmortalizada. Tradicionalmente, las células pueden definirse como "somáticas", o "de la línea germinal". Algunas células, por ejemplo, las células ES, pueden no coincidir fácilmente en ninguna de estas dos categorías tradicionales porque se obtienen de embriones antes de que puedan distinguirse los distintos linajes somático y germinal. Su equivalente funcional, las células EG (germinales embrionarias) se definen más fácilmente como células "de la línea germinal" porque se obtienen de células germinales primordiales. En el presente texto, el término "somática" no cubre células ES o EG.

El uso de este procedimiento no está restringido a un tipo celular donante particular. Las células adecuadas incluyen células somáticas embrionarias, fetales y adultas (de cariotipo normal). En este texto una célula "adulta" o un animal "adulto" es una célula o animal que ha nacido. Por tanto, un animal y sus células se consideran "adultos" desde el nacimiento. Dichos animales adultos, de hecho, cubren animales desde el nacimiento en adelante, y por tanto incluyen "recién nacidos" y "juveniles". La invención incluye el uso de células no diferenciadas, por ejemplo, células madre somáticas tales como células madre hematopoyéticas, células al menos parcialmente diferenciadas y células completamente diferenciadas. Ejemplos de células parcialmente diferenciadas incluyen células de linaje embrionario o células precursoras (por ejemplo, células precursoras neurales).

Células somáticas adecuadas de acuerdo con el primer aspecto de la invención están preferiblemente, aunque no necesariamente, en cultivo. Las células somáticas adecuadas incluyen fibroblastos, células epiteliales, células endoteliales, células neurales, queratinocitos, células hematopoyéticas, melanocitos, condrocitos, linfocitos (B y T), eritrocitos de ave, macrófagos, monocitos, células mononucleares, células de músculo cardiaco, otras células musculares, células de la granulosa, células del cumulus y células epidérmicas. Las células para el procedimiento del primer aspecto de la invención pueden obtenerse de una diversidad de diferentes órganos tales como piel, mesénquima, pulmón, páncreas, corazón, intestino, estómago, vejiga, vasos sanguíneos principales, riñón, uretra, órganos reproductores etc. o una preparación disgregada de un feto o embrión completo o partes del mismo.

Las células adecuadas pueden obtenerse o derivarse de cualquier animal no humano, incluyendo pájaros tales como aves de corral domésticas, especies de anfibios y especies de peces. En la práctica, sin embargo, son los mamíferos los animales que contemplan la mayor ventaja comercial. Un animal preferido del que se obtiene la célula somática es un ungulado, seleccionado entre un bóvido, óvido, cérvido, suido, équido o camélido. En particular, el ungulado es una vaca o toro, oveja, cabra, bisonte, búfalo asiático o cerdo. También se contemplan por la presente invención células somáticas obtenidas o derivadas de un caballo, camello, roedor (por ejemplo, rata, ratones) o un lagomorfo (por ejemplo, conejo).

Las fuentes adecuadas para células receptoras no humanas en el proceso de transferencia nuclear no son limitantes. La célula receptora es preferiblemente un ovocito no humano, un cigoto fertilizado no humano o un embrión de dos células no humano, todos los cuales se han enucleado.

El acontecimiento de modificación genética dirigida puede ser cualquier que posibilite la modificación del material genético de la célula somática en un sitio predeterminado. Dicho acontecimiento de modificación genética dirigida incluye inactivación, eliminación o modificación del material genético: regulación positiva de la función del material genético; reemplazo del material genético; e introducción de material genético. El material genético en particular comprende un gen o una parte del mismo o una región que influye en la expresión de un gen o genes. Por consiguiente, los acontecimientos de modificación genética dirigida pueden incluir inactivación, eliminación o modificación de un gen, regulación positiva de un gen, reemplazo génico o reemplazo transgénico en un locus predeterminado.

Preferiblemente, el acontecimiento de modificación genética dirigida sucede por recombinación homóloga.

Preferiblemente, la derivación de clones celulares con modificación génica dirigida sucede a elevada eficacia. De acuerdo con este aspecto de la invención, elevada eficacia se define como una proporción de clones celulares con modificación génica dirigida:transfectados aleatoriamente dentro de la misma población celular seleccionada que es igual a o mayor de 1:100.

Los detalles precisos de modificación genética dirigida pueden variarse para mejorar la eficacia. De acuerdo con la diversidad de modificaciones, la modificación genética dirigida de una célula somática adecuada para transferencia nuclear puede diseñarse para maximizar la frecuencia de modificación dirigida homóloga. Un factor que puede usarse para aumentar la modificación genética dirigida por recombinación homóloga es el efecto de la transcripción sobre el material genético diana. Preferiblemente, la diana genética se transcribe activamente o está adyacente a un locus genético que se transcribe activamente. Dichas dianas genéticas o loci pueden identificarse dependiendo del tipo de célula somática usada, y también posiblemente de la fase de dicha célula. Dichos genes pueden identificarse en base a la abundancia de las moléculas de ARNm correspondientes. Los genes adecuados producirían ARNm que están en la clase intermedia definida arbitrariamente, o en la clase abundante de ARNm que están presentes a 300 o más copias de cada molécula por célula (Alberts y col. 1994, Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, Nueva York y Londres). Un ejemplo de una diana génica adecuada en fibroblastos es cualquier gen o locus que codifique colágeno, en particular los loci de los genes COLIA1 o COLIA2. Sin embargo, muchos loci adecuados están presentes en un material genético celular, tal como los genes de la proteína de la leche, por ejemplo, en células epiteliales mamarias; inmunoglobulinas en linfocitos; HSA y transferrina en células hepáticas; y colágeno tipo VII en queratinocitos.

De acuerdo con este aspecto de la invención, pueden usarse medios eficaces de transfección que maximizan la cantidad de clones celulares derivados que han experimentado un acontecimiento de modificación génica dirigida. Por ejemplo, pueden usarse reactivos de transfección mediada por lípidos por ejemplo "LipofectaAMINA" (Gibco/Life Sciences) o "GenePorter" (Gene Therapy Systems).

Como alternativa, o adicionalmente, pueden incluirse largas regiones de homología al locus diana en el vector de modificación génica dirigida. La longitud total de homología presente en el vector de modificación dirigida es preferiblemente mayor de 7 kb.

Como alternativa, o adicionalmente, puede usarse ADN de un vector de modificación génica dirigida no lineal, es decir, ADN que no se ha linealizado por escisión con enzimas de restricción. En esta realización de la invención, el ADN introducido por transfección está predominantemente en una forma circular, que puede estar sustancialmente superenrollado o sustancialmente relajado.

Las características anteriores de los procedimientos de transfección pueden usarse solos o en combinación entre sí.

Una estrategia particularmente útil para aumentar la modificación genética dirigida es la inducción artificial de expresión génica o la inducción de cambios en la cromatina en un tipo de célula somática. Preferiblemente, el acontecimiento de modificación genética dirigida se facilita por un agente que inhibe la desacetilación de histonas o por un factor que estimula la transcripción en el locus diana. El factor puede expresarse en la célula hospedadora. Esta estrategia se describe con más detalle en el resto de este texto.

De acuerdo con la modificación genética dirigida de la presente invención, puede ser útil o necesario, en algún punto después del acontecimiento y preferiblemente antes de cualquier transferencia nuclear, retirar partes del material genético de la célula. Dicho material puede ser un marcador de selección, o por ejemplo, un activador de la transcripción genética introducido. Dicha eliminación puede realizarse por procedimientos descritos a continuación, o por otros procedimientos bien conocidos en la técnica.

La preparación de la célula somática (por modificación del material genético de la célula) puede ser una etapa precedente a la transferencia nuclear. La presente invención proporciona, por primera vez, un procedimiento por el que una célula somática puede modificarse genéticamente y que también apoya la transferencia nuclear satisfactoria. El apoyo de la transferencia nuclear satisfactoria requiere que el embrión reconstituido avance para producir un animal viable nacido vivo, o un embrión o feto que pueda usarse como fuente de tejido, incluyendo células EG y células ES.

El procedimiento de transferencia nuclear para la presente invención no está limitado. Puede usarse cualquier procedimiento de transferencia nuclear. La transferencia nuclear puede incluir material genético de una especie animal o un tipo de animal a una célula receptora de la misma o diferente especie o tipo de animal.

Las células receptoras pueden ser cualquier célula receptora adecuada para cualquier procedimiento de transferencia nuclear, incluyendo un ovocito, un cigoto fertilizado o un embrión de dos células que se ha enucleado.

La transferencia del material genético de una célula somática a una célula receptora proporciona un embrión animal (el embrión animal comprende el resultado de la transferencia nuclear de la célula única a través de todas y cada una de las fases multi-celulares).

El procedimiento de la invención también puede comprender la producción de células totipotentes o pluripotentes clonadas de un embrión o feto obtenido por transferencia nuclear. Los procedimientos para la obtención de células totipotentes o pluripotentes, tales como células madre, de embriones (células ES y células tipo ES) y de células germinales primordiales de embriones y fetos de fases posteriores (células EG) se han descrito por muchos autores que se citan posteriormente en este texto. Las células madre pluripotentes son particularmente útiles para la producción de células diferenciadas y sus precursores in vitro que pueden proporcionar una fuente de células para transplante (preferiblemente para seres humanos).

Las células (incluyendo células somáticas) obtenidas de embriones o fetos (o adultos) también pueden usarse para rondas adicionales de transferencia nuclear. La reobtención de células de un embrión o feto producido por transferencia nuclear puede facilitar manipulaciones genéticas múltiples o secuenciales que de otro modo no son posibles en las células primarias iniciales.

Como alternativa, el procedimiento para obtener un embrión animal de acuerdo con la invención puede comprender adicionalmente causar que un animal se desarrolle a término a partir del embrión. En dicho procedimiento, el embrión animal se desarrolla preferiblemente a término in vivo. Si el desarrollo hasta blastocisto ha tenido lugar in vitro, después la transferencia en un animal sustituto tiene lugar en este estado. Si el desarrollo del blastocisto ha tenido lugar in vivo, aunque en principio el blastocisto puede dejarse desarrollar a término en el hospedador pre-blastocisto, en la práctica el blastocisto habitualmente se moverá desde el receptor pre-blastocisto temporal y, después de la disección del medio protector, se transferirá al receptor post-blastocisto permanente. El desarrollo a partir del embrión hasta un adulto progresa a través de la fase de un feto.

Un segundo aspecto de la invención proporciona un embrión o feto transgénico obtenido por un procedimiento de acuerdo con la invención. Las características preferidas del aspecto uno solamente se aplican al segundo aspecto.

Un tercer aspecto de la invención proporciona un procedimiento para preparar un animal transgénico que comprende causar que un animal no humano se desarrolle a término a partir de un embrión o feto no humano de acuerdo con el segundo aspecto de la invención. Opcionalmente, el animal no humano transgénico del tercer aspecto puede reproducirse y dicha descendencia (incluyendo embriones, fetos y adultos) también está incluida por la presente invención. Las características preferidas de los aspectos uno y dos solamente se aplican al tercer aspecto.

Un cuarto aspecto de la invención proporciona un animal transgénico, o descendencia del mismo, de acuerdo con el tercer aspecto de la invención. Las características preferidas de los aspectos uno a tres solamente se aplican al cuarto aspecto.

Los procedimientos de transferencia nuclear de la presente invención incluyen, aunque sin limitación, un procedimiento de transferencia nuclear doble. Dicho procedimiento, así como los detalles de los procedimientos de transferencia nuclear de una única etapa, se describen en el documento WO 0042174 y se describen a continuación.

La invención no se refiere a la clonación reproductora humana. Por tanto, la "célula receptora", "población celular totipotente", "embrión transgénico", "célula transgénica", "célula somática" y "embrión animal" usados con la invención no incluyen células o embriones humanos.

En general, los ovocitos detenidos en la metafase de la segunda división meiótica se han usado como receptores de citoplasto. El material genético donante se ha introducido en el citoplasma celular receptor por los procesos de 1) fusión celular 2) inyección de células intacta, células lisadas o núcleos. La transferencia de material genético puede suceder en el momento de la activación, precedente a la activación (véanse las solicitudes de patente WO 97/07669 y WO 97/07668) o después de la activación (Campbell y col., Biol. Reprod. 49 9330942 (1993); Campbell y col., Biol. Reprod. 50 1385-1393 (1994)). En cada uno de estos casos, la ploidía del embrión reconstruido debe mantenerse por el uso de material genético donante en una fase apropiada del ciclo celular (para una revisión véase Campbell y col., Reviews of Reproduction 1:40-46 (1996)). Este proceso puede acoplarse con técnicas de manipulación genética para la producción de descendencia transgénica (Schnieke y col., Science 278:2130-2133 (1997)). El uso de transferencia nuclear acoplada a modificación genética de células en cultivo y su selección antes de la producción del animal tiene varias ventajas como se ha descrito anteriormente.

En cerdos, el uso de transferencia nuclear para la producción de descendencia viva se ha asociado con dificultades. Aunque la descendencia se ha producido intercambiando los pronúcleos de cigotos fertilizados, solamente se ha producido 1 lechón a partir de una fase de desarrollo posterior (4 células) (Prather y col., Biol Reprod 1989 Sep 41:3 414-8).

El proceso de reconstrucción de embriones y producción de descendencia viable por transferencia nuclear es un procedimiento de múltiples etapas. Cada una de estas etapas se describirá ahora con más detalle. La siguiente descripción pretende dar una explicación de las etapas y no es una descripción exhaustiva ni limitante.

La Célula Receptora o Citoplasto

Se han usado ovocitos, cigotos fertilizados y embriones de dos células como receptores de citoplasto para la transferencia nuclear. En general, los ovocitos detenidos en metafase de la segunda división meiótica (también llamados óvulos sin fertilizar) se han convertido en el citoplasto de elección. En este punto en el desarrollo del ovocito, el material genético se ordena sobre el huso meiótico y se elimina fácilmente usando medios mecánicos. Varios informes han demostrado que durante la maduración, es decir, entre la fase de vesícula germinal (profase de la primera división meiótica) y la detención en la metafase de la segunda división meiótica, el ADN genómico puede eliminarse y el citoplasto resultante usarse para transferencia nuclear (Kato Y., Tsunoda Y., Mol Reprod Dev (1993) Oct 36:2 276-8). Se ha informado del uso de cigotos fertilizados como receptores de citoplasto en ratones (Kwon O.Y., Kono T., Proc Natl Acad Sci U.S.A (1996) Nov 12, 93:23 13010-3), ganado vacuno (Prather R.S., First N.L., J Reprod Fertil Suppl (1990) 41), y cerdos (Prather y col., Biol Reprod (1989) Sep 41:3, 414-8). En ganado vacuno y cerdos, el desarrollo de embriones reconstruidos usando cigotos como receptores de citoplasto es bajo y globalmente restringido al intercambio de pronúcleos, lo que sugiere que factores esenciales para el desarrollo satisfactorio se elimina con los pronúcleos. El procedimiento de transferencia nuclear doble produce una estructura tipo pronúcleo (incluyendo un pronúcleo) por transferencia de un núcleo adecuado, preferiblemente a un ovocito en Metafase II enucleado. La estructura tipo pronúcleo formada de este modo contendrá factores, que generalmente se eliminan durante la enucleación del cigoto. Esta estructura tipo pronúcleo después se usa como donante de material genético para la reconstrucción de embriones por una segunda transferencia nuclear. Pueden usarse núcleos o células de cualquier fase del ciclo celular como donantes de material genético preferiblemente, sin embrago, la fase del ciclo celular del citoplasto receptor debe controlarse en consecuencia.

Preparación de un Receptor de Citoplasto por Eliminación del Material Genético Genómico

Este proceso se ha llamado en general enucleación. En la mayoría de los receptores utilizados, el ADN genómico no está encerrado dentro de una membrana nuclear en el momento de la eliminación. La eliminación del material genético de acuerdo con la presente invención y descrita por el término "enucleación" no requiere que el material genético esté presente en una membrana nuclear (puede estar o no estar, o puede estar parcialmente). La enucleación puede conseguirse físicamente por la eliminación real del núcleo, los pronúcleos o la placa metafásica (dependiendo de la célula receptora), o funcionalmente, tal como por la aplicación de radiación ultra-violeta u otra influencia de enucleación. La eliminación del material genético es posible por medios físicos y/o químicos. En los primeros informes de transferencia nuclear, los ovocitos MII simplemente se cortaban por la mitad en base a que una mitad contendría el material genético y la otra no. Se han hecho modificaciones a este enfoque para reducir el volumen de citoplasma, que se había eliminado. Esto puede conseguirse por aspiración de una pequeña cantidad de citoplasma de debajo directamente del primer cuerpo polar usando micropipetas de vidrio o usando una cuchilla para cortar la parte del ovocito por debajo del cuerpo polar. Para facilitar la plasticidad del ovocito éste puede pre-tratarse con el inhibidor de microtúbulos citocalasina B u otro de dichos agentes que alteran el citoesqueleto. En contraste con la enucleación física, el tratamiento químico ha demostrado que produce la eliminación completa del material genético en ratones.

El tratamiento de ovocitos en maduración con el inhibidor de topoisomerasa etopósido provoca la expulsión de todos el material genómico con el primer cuerpo polar (Elsheikh A.S. y col. Jpn J Vet Res (1998) Feb 45:4, 217-20), sin embargo no se ha descrito desarrollo a término usando receptores de citoplasto producidos por este procedimiento y no hay informes de este procedimiento en otras especies. Se ha informado de que la centrifugación de ovocitos MII combinada con tratamiento con citocalasina B causa enucleación en ovocitos de hámster y ganado vacuno (Tatham y col., Hum Reprod (1996) Jul 11:7 1499-503). Se ha informado el desarrollo de embriones reconstruidos a partir de dichos citoplastos en ganado vacuno, sin embargo, la frecuencia de desarrollo es baja.

Cuando se usan cigotos, el material genético puede eliminarse por aspiración mecánica de ambos pronúcleos. En función de la especie, para facilitar la visualización de los pronúcleos pueden centrifugarse los cigotos antes de la enucleación.

Introducción de material genético (reconstrucción de embriones)

Con una célula o citoplasto receptor adecuado preparado se introducirá el material genético donante. Se ha informado de diversas técnicas, incluidas;

1. Fusión celular inducida por medios químicos, virales o eléctricos.

2. Inyección de una célula intacta por cualquier procedimiento.

3. Inyección de una célula lisada o dañada.

4. Inyección de un núcleo.

Cualquiera de estos procedimientos puede usarse en cualquier especie con algunas modificaciones de protocolos individuales.

Activación del embrión reconstruido

Además de la transferencia del material genético donante del carioplasto al citoplasto, el citoplasto debe estimularse para que inicie el desarrollo. Cuando se usa un cigoto fertilizado como receptor de citoplasto, el desarrollo ya se ha iniciado mediante la entrada de esperma en la fertilización. Cuando se usan ovocitos MII como receptores de citoplasto, el ovocito debe activarse mediante otros estímulos. Se ha informado que diversos tratamientos inducen la activación del ovocito y estimulan el desarrollo embrionario temprano entre los que se incluyen la aplicación de un estímulo eléctrico de CC, el tratamiento con etanol, ionomicina, inositol tri-fosfato (IP3), ionóforo de calcio A23187, el tratamiento con extractos de esperma o cualquier otro tratamiento que induzca la entrada de calcio en el ovocito o libere los almacenes internos de calcio y provoque el inicio del desarrollo. Además, cualquiera de estos tratamientos, solos o en combinación, puede aplicarse, al mismo tiempo o en diferentes momentos, o en combinación con inhibidores de la síntesis de proteínas (es decir, cicloheximida o puromicina) o inhibidores de las proteína cinasas de serina y treonina (es decir 6-DMAP).

Cultivo de embriones reconstruidos

Los embriones reconstruidos por transferencia nuclear pueden cultivarse in vitro hasta una fase adecuada para la transferencia a un receptor final usando cualquier medio de cultivo adecuado o proceso de cultivo. Como alternativa, los embriones pueden cultivarse in vivo en el oviducto ligado de un animal hospedador adecuado (en general, ovejas) hasta que se alcance una fase adecuada para la transferencia a un receptor sustituto final. Los embriones de ganado vacuno, ovejas y otras especies pueden cultivarse en un receptor transespecie, por simplicidad una oveja proporciona un receptor adecuado para especies bovinas, ovinas y porcinas. Para evitar el daño mecánico o ataque por macrófagos a los embriones reconstruidos mientras están en el oviducto del receptor temporal, es habitual incluir los embriones en una capa protectora de agar o material similar.

Los sistemas de cultivo in vitro actualmente disponibles para embriones porcinos soportan el desarrollo hasta la fase de blastocisto, sin embargo, la frecuencia de nacimientos vivos a partir de dichos embriones es baja (Machaty y col., Biology of Reproduction, (1998) 59, 451-455). En el procedimiento de transferencia nuclear doble, el embrión reconstruido por la primera transferencia nuclear puede cultivarse por cualquiera de estos procedimientos hasta que suceda la formación un cuerpo tipo pronuclear y el embrión se usa para la segunda reconstrucción por transferencia nuclear. En la práctica, actualmente se prefiere que este primer periodo de cultivo se realice usando un medio adecuado in vitro.

Cada una de las etapas implicadas en la reconstrucción de embriones mamíferos por transferencia nuclear es ineficaz. En cerdos esto es particularmente evidente por la ausencia de informes sobre la producción de descendencia viva a partir de embriones reconstruidos por transferencia nuclear. La base de la transferencia nuclear doble es minimizar las etapas ineficaces implicadas en el proceso de reconstrucción usando un procedimiento de reconstrucción de embrión de múltiples etapas y cultivando los embriones en el receptor sustituto final. El procedimiento de transferencia nuclear doble proporciona un procedimiento para reconstruir un embrión animal. El proceso comprende transferir un núcleo en un primer ovocito seguido de la eliminación y transferencia de dicho núcleo de dicho ovocito a una célula receptora adicional. Preferiblemente, el núcleo transferido desde el primer ovocito está en forma de una estructura tipo pronúcleo. Preferiblemente, la segunda célula receptora es un ovocito o un cigoto fertilizado enucleado. Esto implica un procedimiento de transferencia nuclear doble. La primera etapa de este procedimiento es producir una estructura tipo pronúcleo por transferencia de un núcleo donante a un ovocito. Preferiblemente, el ovocito es un ovocito en metafase II maduro (óvulo no fertilizado), que se ha activado previamente o se activa simultánea o posteriormente, o un ovocito MII activado (la activación es habitualmente por introducción física o química). Un ejemplo de la primera etapa se muestra en la Figura 21 (por beneficios de simplicidad, el uso de un receptor activado en la Figura 21 no se muestra, pero esto está documentado en la siguiente Tabla 1). En la segunda etapa del procedimiento, la estructura tipo pronúcleo generada por la primera etapa se retira del primer embrión reconstruido y se transfiere a un ovocito o a un partenote activado o cigoto fertilizado enucleado (Figura 21). Cuando la transferencia es a un ovocito, preferiblemente la estructura tipo pronúcleo se retira del primer embrión reconstruido y se transfiere a un ovocito que es un ovocito MII enucleado antes de, de forma concomitante con o después de la activación. Después de la segunda transferencia nuclear, el embrión reconstruido puede transferirse directamente a un receptor sustituto final para el desarrollo a término.

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Posibles combinaciones del ciclo celular de las células donante y receptora para la primera TN para mantener la ploidía del(de los) núcleo(s) de los cigotos reconstruidos


Cualquier célula diferenciada, parcialmente diferenciada o no diferenciada tomada directamente de cualquier fase en el desarrollo de un animal, tal como un embrión, feto, animal juvenil o adulto o cualquier línea celular derivada de los mismos puede proporcionar el material genético donante para la reconstrucción de embriones. En informes previos, la fase del ciclo celular del núcleo donante ha demostrado ser crítica para el desarrollo. En la presente invención, puede usarse una célula en cualquier fase del ciclo celular como donante de material genético para el primer proceso de reconstrucción. Sin embargo, la combinación de las fases del ciclo celular del núcleo donante y el citoplasma receptor variará dependiendo de la fase del ciclo celular de la célula a usar como donante de material genético en el momento de la transferencia. No se requiere que el material genético donante y las células receptoras, sean de la misma especie animal, aunque puede preferirse esto.

Preparación de células donantes

Los procedimientos y materiales para el cultivo, sincronización y selección de células donantes a usar como donantes nucleares para la reconstrucción de embriones por transferencia nuclear son bien conocidos para cualquier especialista en la técnica. Cualquier población celular obtenida directamente de cualquier fase en la vida de un animal (por ejemplo, embrión, feto o animal adulto) puede usarse como material genético donante, como alternativa puede usarse una célula de cualquier población (por ejemplo, un población de células no diferenciadas, parcialmente diferenciadas o diferenciadas) obtenida de cualquier fase (por ejemplo embrión, feto, animal juvenil o adulto) y mantenerse en cultivo o cualquier célula (por ejemplo, célula no diferenciada, parcialmente diferenciada o diferenciada) resultante durante el cultivo de aislados primarios o como resultado del tratamiento de la población celular cultivada con hormonas, factores de crecimiento o agentes químicos que alteran el estado diferenciado. La fase del ciclo celular de células mantenidas en cultivo puede manipularse para asegurar la coordinación con el citoplasto receptor usando cualquier medio disponible para cualquier especialista en la técnica. Los siguientes ejemplos son no limitantes y son simplemente representativos de diversos aspectos de la técnica.

Fase G0

Puede usarse cualquier procedimiento que provoque la producción de células diploides quiescentes (sin crecimiento) que han detenido el ciclo celular después de la mitosis y la división celular pero antes de la aparición replicación del ADN o fase S. Los procedimientos adecuados incluyen, entre otros;

I. Quiescencia inducida por inhibición por contacto de poblaciones celulares cultivadas

II. Quiescencia inducida por la eliminación o reducción en la concentración de suero u otro nutriente esencial en el medio de cultivo, es decir, leucina u otro aminoácido, factor(es) de crecimiento específico(s).

III. Quiescencia inducida por senescencia.

IV. Quiescencia inducida por la adición de un factor de crecimiento específico u otra sustancia.

V. Quiescencia inducida por cualquier medio físico tal como choque por calor, presión hiperbárica o tratamiento con compuestos químicos que inducen un choque por calor o respuesta de estrés, por ejemplo, puromicina, azacitidina.

Fase G1

Los núcleos donantes pueden detenerse en la fase G1 del ciclo celular por tratamiento con cualquier agente químico, hormona, factor de crecimiento u otra sustancia que cause la detención o por cualquier estrés físico que induzca la detención del ciclo celular, es decir, la inducción de una respuesta de choque por calor como resultado de elevada temperatura o tratamiento con compuestos que inducen dicha respuesta, es decir, puromicina, azacitidina. Como alternativa, las células en fase G1 pueden obtenerse por sincronización de la población celular por cualquier medio y selección de células G1 en un momento apropiado. Por ejemplo, las células pueden detenerse en la fase M del ciclo celular mediante tratamiento con fármacos que alteran los microtúbulos tales como colcemid o nocodazol, después las células mitóticas pueden seleccionarse de la población por agitación y colocarse en un recipiente de cultivo diferente. Las células G1 después pueden seleccionarse en un momento apropiado después de la agitación. Como una variación de esta técnica, las células mitóticas también pueden seleccionarse de una población no sincronizada. Las células G1 pueden enriquecerse induciendo la salida de las células del ciclo celular y su detencón en una fase quiescente o G0 (como en lo que antecede) y, después, re-estimulando el crecimiento mediante la nueva adición del factor de restricción. Las células G1 después pueden seleccionarse en un momento después de la re-estimulación para hallarse por experimentación para cada tipo/población celular individual. Esta técnica puede combinarse con cualquier técnica que después detenga las células en la fase G1 del ciclo celular, o en el límite fase G1/S, es decir, el tratamiento con hidroxiurea o afidicolina.

Fase S

Las células en fase S pueden seleccionarse o enriquecerse por tratamiento con cualquier agente químico que interfiera con cualquier punto del procedimiento de replicación, por ejemplo, afidicolina que inhibe la elongación de cadena de un modo dependiente de la concentración, hidroxiurea que inhibe la enzima ribonucleótido reductasa. Las células sincronizadas en cualquier otra fase del ciclo celular pueden liberarse y puede determinarse experimentalmente la coordinación de la fase S después de la liberación. Además, estos dos procesos pueden combinarse o utilizarse cualquier otro procedimiento de selección o sincronización o combinación de los mismos.

Fase G2

Las células en fase G2 pueden seleccionarse de una población en crecimiento que se ha sincronizado mediante cualquier procedimiento físico, químico o selectivo. Como alternativa, las células G2 pueden enriquecerse por tratamiento de una población celular sincronizada o no sincronizada con cualquier agente que detenga específicamente el ciclo celular después de completarse la fase S y antes de la aparición de la mitosis.

Fase M

Las células mitóticas pueden seleccionarse de una población no sincronizada usando cualquier medio posible incluyendo, aunque sin limitación, agitación mitótica, elutriación, FACS (separación de células activadas por fluorescencia). Como alternativa, las células pueden detenerse en mitosis por tratamiento con agentes que alteran los microtúbulos tales como colcemid o nocodazol, por tratamiento con DMAP o cualquier otro inhibidor de proteína cinasas de serina y treonina o por cualquier otro medio químico o físico que altere el progreso normal de crecimiento y cause la detención en mitosis.

Poblaciones celulares no sincronizadas

Las poblaciones celulares no sincronizadas pueden obtenerse de cualquier tejido embrionario, fetal o adulto y cultivarse in vitro, o puede extraerse cualquier célula directamente de un embrión, feto, animal juvenil o adulto. Una célula no sincronizada se define como una célula cuya fase del ciclo celular es desconocida en el momento de la transferencia a un citoplasto receptor.

Transferencia nuclear

I) Ovocitos

Los ovocitos que van a actuar como receptores de citoplasto adecuados pueden obtenerse usando una diversidad de técnicas y protocolos, estos incluyen, entre otros,

i) Maduración in vitro después de la aspiración del folículo desde los ovarios obtenidos en el sacrificio o extraídos quirúrgicamente.

ii) Punción transvaginal del folículo seguida de maduración in vitro.

iii) Maduración in vivo aunque se recogen por punción transvaginal del folículo antes de la ovulación, después se completa la maduración in vitro.

iv) Maduración in vivo y recuperación quirúrgica.

v) Maduración in vivo y recuperación en el sacrificio.

Es preferible, pero no esencial, que todos los ovocitos madurados in vivo se recojan por lavado abundante desde el oviducto en solución salina tamponada con fosfato (PBS) libre de calcio y magnesio (u otro medio adecuado desprovisto de iones calcio y magnesio) que contiene suero bovino fetal (FCS) al 1,0%. Asimismo, los ovocitos madurados in vitro se recogen y transfieren a un medio adecuado desprovisto de iones calcio y magnesio (por ejemplo medio M2 preparado sin la adición de iones calcio y magnesio). El medio elegido puede suplementarse con FCS, BSA u otra fuente de proteínas. Los ovocitos se limpian de células del cumulus y se enuclean como se ha descrito previamente (Campbell y col., 1993, 1994) con la excepción de que se prefiere medio libre de calcio, aunque no el esencial para todos los procedimientos. Los procedimientos de fusión son modificaciones de los previamente presentados (Campbell y col., 1993, 1994) y son como se describen en la siguiente sección pertinente, como alternativa el núcleo puede introducirse por inyección manual de la célula donante en el ovocito enucleado (Ritchie y Campbell, J. Reproduction and Fertility Abstract Series Nº 15, p60) o usando un aparato de piezo inyección disponible en el mercado como se ha demostrado en ratones (Wakayama y col., 1998). La coordinación de estos acontecimientos depende de la especie. Estos protocolos definen el uso de ovocitos ovinos, bovinos y porcinos madurados in vivo e in vitro acoplado con el uso de cigotos producidos in vitro o in vivo. El procedimiento no se limita a estos protocolos definidos.

II) Cigotos

Para actuar como receptores para la segunda transferencia nuclear, se requieren cigotos u ovocitos fertilizados (antes de, de forma concomitante con o después de la activación). Actualmente se prefiere cigotos fertilizados, aunque no es esencial. Los ovocitos madurados pueden obtenerse por cualquier de los procedimientos mostrados anteriormente. El material genético puede eliminarse del ovocito como se ha descrito previamente. Los ovocitos pueden activarse tratando los ovocitos madurados con cualquier estímulo físico o químico o combinación de los mismos, que causa la activación y estimula el desarrollo. La coordinación de la aplicación del estímulo de activación variará en algún grado según tanto la especie como el procedimiento de maduración. Los cigotos fertilizados pueden obtenerse por fertilización in vitro de ovocitos madurados obtenidos de cualquiera de las fuentes anteriores o, como alternativa, pueden recuperarse ex vivo después de la copulación o IA usando animales donantes estimulados o no estimulados.

Primera fase de reconstrucción de embriones por transferencia nuclear

Pueden usarse células donantes en diferentes fases del ciclo celular para la reconstrucción de embriones. El receptor de citoplasto usado y cualquier tratamiento adicional requerido variarán en algún grado, dependiendo de la fase del ciclo celular de las células donante y receptora. La Tabla A da una serie de posibles combinaciones.

De hecho, puede usarse cualquier procedimiento que provoque la producción de una o más estructuras tipo pronúcleo, preferiblemente de diploidía normal o tetraploidía.

Segunda fase de transferencia nuclear de

En la segunda fase, una estructura tipo pronúcleo (preferiblemente identificada como una forma hinchaza del núcleo) del embrión reconstruido por la primera transferencia nuclear se transfiere a un MII enucleado (antes de, de forma concomitante con o después de la activación) o a un partenote activado o cigoto fertilizado que se ha enucleado por eliminación de los pronúcleos. Aunque cada uno de estos receptores de citoplasto es adecuado para la segunda transferencia nuclear, en la práctica un cigoto fertilizado enucleado es la elección preferida. El cigoto para actuar como receptor de citoplasto para la segunda transferencia nuclear puede producirse in vivo o in vitro, aunque en la práctica el uso de en cigotos producidos in vivo es el procedimiento de elección actualmente. Como alternativa, puede usarse cualquier célula resultante del desarrollo del embrión de la primera transferencia nuclear o población celular cultivada derivada de este embrión como donante de material genético para la producción del embrión de la segunda transferencia nuclear.

Fuente de ovocito activado o cigoto

Pueden usarse ovocitos obtenidos de cualquier fuente in vitro o in vivo y posteriormente madurados in vitro, u ovocitos madurados in vivo como receptores para la segunda transferencia nuclear después de la enucleación y posterior activación o la activación y posterior enucleación. En la práctica, se prefiere que el citoplasto receptor para la segunda transferencia nuclear se prepare a partir de un cigoto fertilizado. El cigoto necesario para la producción de un receptor de citoplasto para la segunda transferencia nuclear puede obtenerse de cualquier fuente adecuada que puede incluir, aunque sin limitación, cigotos fertilizados producidos in vivo que se recuperan de un animal donante adecuado. Los cigotos pueden producirse por copulación natural, por copulación natural después de superovulación o por IA usando semen reciente o congelado. Como alternativa, los cigotos fertilizados pueden producirse in vitro. La fertilización in vitro puede realizarse sobre ovocitos madurados in vivo de donantes adecuados con o sin superovulación o usando ovocitos madurados in vitro después de la recuperación del material del matadero o de la aspiración de los folículos in vivo. En la práctica, se prefiere que el cigoto para la segunda transferencia nuclear se obtenga después de maduración y fertilización in vivo.

Enucleación de cigotos

Después de la fertilización satisfactoria, la cromatina masculina y femenina en el cigoto recién formado se descondensa y forma dos pronúcleos. El material genético puede eliminarse en cualquier punto después de la fertilización. Sin embargo, en la práctica, el presente procedimiento de elección es retirar el material genético después de la formación de los pronúcleos. Debido a la naturaleza del citoplasma, a menudo es difícil visualizar y eliminar los pronúcleos de un cigoto fertilizado. Puede ayudarse a la visualización de los pronúcleos por centrifugación de los cigotos antes de su manipulación, aunque esto no es esencial.

Preparación de un donante de carioplasto del embrión de la primera transferencia nuclear

El(los) pronúcleo(s) formado(s) en los embriones reconstruidos por la primera transferencia nuclear debe(n) eliminarse y transferirse al segundo receptor de citoplasto. Para visualizar el(los) pronúcleo(s), los embriones preferiblemente se centrifugan. Después se realiza la aspiración de un pronúcleo rodeado por citoplasma y envuelto en una membrana celular, preferiblemente por microcirugía. Para facilitar este proceso, aunque sin necesidad, el embrión puede hacerse más plegable por tratamiento con uno o más compuestos químicos, que alteran el citoesqueleto, por ejemplo, citocalasina B, o nocodazol. El embrión centrifugado es preincuba en el(los) agente(s) de elección y después se transfiere a una cámara de manipulación. Usando una pipeta de vidrio fino, se aspira un carioplasto que contiene un pronúcleo.

Reconstrucción del embrión de la segunda transferencia nuclear

El carioplasto formado a partir del embrión de la primera transferencia nuclear se usa para transferir el material genético ahora contenido dentro de la estructura tipo pronúcleo al segundo citoplasto receptor enucleado. Puede usarse cualquier medio de transferencia incluyendo la fusión del carioplasto al citoplasto por medios virales, químicos o eléctricos o como alternativa el pronúcleo puede inyectarse en la célula receptora. Debido al tamaño del pronúcleo, se prefiere, aunque no es esencial, que el material genético se transfiera por el proceso de fusión celular. Para la fusión celular, el carioplasto se transfiere por debajo de la zona pelúcida del segundo receptor de citoplasto y se pone en contacto con el cigoto enucleado. Después puede aplicarse cualquier medio físico, químico o viral para inducir la fusión celular. Sin embargo, actualmente es preferible, aunque no esencial, usar fusión eléctrica. Para fusión eléctrica, el pareado se coloca en un medio adecuado en una cámara de fusión adecuada. Después se pasa un pulso eléctrico de CC a través del pareado a ángulos rectos al plano de contacto entre el citoplasto y el carioplasto. Primero puede usarse un pulso eléctrico de CA para alinear y/o aumentar el contacto entre el citoplasto y el carioplasto. La duración, fuerza y ritmo del(de los) pulsos(s) eléctrico(s) afecta todo a la frecuencia de fusión y puede optimizarse por experimentación.

Cultivo de embriones de la segunda transferencia nuclear

Después de la reconstrucción del embrión de la transferencia nuclear, puede realizarse desarrollo adicional cultivándolo en medio adecuado in vitro hasta alcanzar una fase del desarrollo adecuada para la transferencia a un receptor sustituto final. Como alternativa, los embriones reconstruidos pueden cultivarse en el oviducto ligado de un receptor intermedio, sincronizado y adecuado durante el tiempo suficiente para alcanzar una fase del desarrollo adecuada para la transferencia a un receptor sustituto final. O como es el procedimiento de elección actualmente en especies porcinas, el embrión reconstruido por la segunda transferencia nuclear puede transferirse directamente al receptor sustituto final y mantenerse las preñez por tratamiento hormonal (véase a continuación).

Transferencia al receptor sustituto final

Los embriones reconstruidos pueden cultivarse por cualquier medio in vitro o in vivo hasta cualquier fase adecuada para su transferencia a un receptor final sincronizado para su desarrollo a término. Como alternativa, los embriones reconstruidos pueden transferirse lo más pronto posible a un receptor sincronizado para su desarrollo a término. El último procedimiento es actualmente el procedimiento de elección en especies porcinas. En esta situación, la inducción y mantenimiento de la preñez en el receptor final puede conseguirse por cualquiera de los siguientes procedimientos. En el momento de la transferencia, los embriones producidos in vivo en la misma fase del desarrollo que los embriones reconstruidos por transferencia nuclear pueden transferirse con la transferencia nuclear. Como alternativa, el receptor puede tratarse con una combinación de hormonas para mantener la preñez (Christenson y col., J. Animal Science 1971; 32: 282-286).

Los procedimientos de transferencia nuclear abarcan modificación genética como se conoce en la técnica para proporcionar animales transgénicos en todas las fases. El término "transgénico" se refiere ampliamente a cualquier fase animal cuya línea germinal se haya sometido a intervención técnica por tecnología de ADN recombinante. Esto incluye la introducción de material genético de otras especies así como un animal en cuya línea germinal se ha delecionado, duplicado, activado o modificado un gen endógeno.

El material genético (núcleo donante) puede modificarse en cualquier fase en la metodología de transferencia nuclear doble. Más preferiblemente, la intervención recombinante se realiza antes de la primera etapa de transferencia nuclear. La intervención recombinante puede realizarse entre la primera y la segunda etapas de transferencia nuclear.

Para la intervención recombinante antes de la primera etapa de transferencia nuclear, el material genético, preferiblemente, se modifica como parte de una modificación de la línea celular o se toma de un animal previamente modificado. Puede introducirse un nivel de selección para identificar los núcleos donantes para la etapa de transferencia nuclear. Como alternativa, o adicionalmente, la intervención recombinante puede realizarse después de la primera etapa de transferencia nuclear y antes de la segunda. En este escenario, la célula obtenida puede modificarse genéticamente por el mismo procedimiento o uno diferente.

La presente invención incluye el uso de ovocitos no enucleados como receptores de citoplasto para la reconstrucción de embriones por transferencia nuclear.

El desarrollo de los embriones reconstruidos por transferencia nuclear depende de muchos factores que incluyen la fase del ciclo celular, tanto del citoplasma receptor como del núcleo donante. La capacidad para sincronizar los blastómeros de embriones murinos tempranos ha permitido estudios detallados de combinaciones del ciclo celular de citoplasto/carioplasto. Informes sobre ratones han demostrado el uso de células mitóticamente detenidas como donantes de material genético (Kwon y Kono, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13010-13013).

Cuando se usan células somáticas como donantes nucleares, se ha demostrado que las células detenidas en la fase G0 (quiescentes) del ciclo celular son capaces de dirigir el desarrollo a término de los embriones reconstruidos por transferencia nuclear. Se ha informado de que la cromatina de células quiescentes experimenta condensación, estas células también muestran una reducción en la transcripción y la traducción, el ARNm se degrada activamente y se producen cambios en los poliribosomas (Whitfield, J. F., y col. (1985) En Control of Animal cell proliferation, Eds Boynton A. L. y Leffert, H. L, p331-365, Academic Press Inc: Londres). Las células quiescentes reducen su metabolismo hasta el necesario para mantener la viabilidad.

Más recientemente, otros investigadores han demostrado que genes transcripcionalmente inactivos se localizan en la heterocromatina centromérica en los núcleos de linfocitos B primarios en proliferacións pero no en los quiescentes. La estimulación de células quiescentes para que vuelvan a entrar en el ciclo de crecimiento causa la recolocación de loci inactivos en las regiones centroméricas (Brown y col., Mol Cell Biol. 3, 207-217). Por tanto, la cromatina de las células quiescentes puede ser más susceptible a sufrir cambios estructurales después de la transferencia nuclear que están asociados con la "reprogramación" de la expresión génica.

La capacidad para utilizar diferentes combinaciones de ciclo celular de las células donantes y receptoras depende de la especie. En ratones, se obtiene un huso organizado intacto cuando los núcleos en fase G2 o M se transfieren a ovocitos MII enucleados. En la activación se produce un acontecimiento "seudo-mitótico/meiótico"; se expulsa un cuerpo polar y se forma un núcleo diploide. Como alternativa, la supresión de la expulsión del cuerpo polar por tratamiento con citocalasina B produce un embrión tetraploide con 2 pronúcleos diploides. Cada uno de estos pronúcleos puede usarse (satisfactoriamente) como donante nuclear para un cigoto enucleado. En ganado vacuno, ovejas y cerdos, después de la transferencia de un núcleo de un blastómero diploide (G1) o una célula somática en un ovocito MII enucleado, no se observa un huso organizado y no hay informes de expulsión del cuerpo polar que sugiera que, de hecho, no se forma un huso organizado. Asimismo, en ganado vacuno, cuando un núcleo G2 se transfiere a un ovocito MII enucleado no se observa un huso organizado, sin embargo, si el ovocito no está enucleado, se observan 2 husos organizados, uno del ovocito MII original y el segundo organizando los cromosomas derivados del núcleo donante.

Estas diferencias en la organización del huso pueden usarse para sacar provecho. Pueden transferirse núcleos en las fases G2 o M del ciclo celular a un ovocito en maduración bien I) en un punto después de la metafase de la primera división meiótica, es decir, entre MI y MII, o ii) en MII. En MII habría 2 husos presentes, uno del ADN materno y el otro del ADN transferido. La activación del ovocito receptor puede evitarse por procedimientos conocidos en la técnica, es decir, eliminación de calcio del medio de cultivo, manipulación o de fusión. La cromatina transferida que se condensa en cromosomas después puede dejarse "acondicionar" en el citoplasma receptor durante un periodo que depende de la especie y de la edad del ovocito receptor. La cromatina materna puede eliminarse después de la formación de un huso intacto que contiene la cromatina donante, o, como alternativa, después de la activación del ovocito reconstruido. La activación puede conseguirse por procedimientos habituales en la técnica, con la excepción de que debe mantenerse la integridad del huso. En la activación, el ADN transferido experimenta una división seudo-mitótica/meiótica y expulsa un cuerpo polar, lo que proporciona un embrión diploide. Como alternativa, la expulsión del cuerpo polar podría evitarse con compuestos habituales en la técnica, por ejemplo, citocalasina B, y el cigoto resultante tendría 2 pronúcleos diploides, cada uno de los cuales podría usarse para su transferencia a un cigoto enucleado o un ovocito enucleado activado.

El ADN del ovocito original o materno podría eliminarse selectivamente después de su identificación por varios medios:

1. Por observación del 1er cuerpo polar y aspiración del citoplasma y el huso meiótico directamente desde debajo del cuerpo polar antes de la activación - esto depende de la edad del ovocito receptor ya que el cuerpo polar se descompone a medida que aumenta la edad.

2. O la cromatina materna o la donante puede teñirse selectivamente antes de la reconstrucción con un colorante específico de ADN que, después, permitirá la eliminación selectiva de los cromosomas teñidos o no teñidos antes de la activación.

3. Como en 3, con la posterior eliminación de los cromosomas o el posterior pronúcleo después de la activación.

4. Por el uso de células donantes transgénicas que contienen un gen marcador específico dirigido por una secuencia promotora específica de G0.

Ejemplos del uso de ovocitos no enucleados

Los protocolos descritos para la producción de ovocitos como receptores para los

Reivindicaciones:

1. Un procedimiento de transferencia nuclear que comprende:

(a) preparar una célula somática no humana para la transferencia nuclear por un procedimiento que comprende modificar el material genético de la célula somática no humana mediante un acontecimiento de modificación génica dirigida en un locus endógeno; y

(b) transferir el material genético desde la célula somática no humana hasta una célula receptora no humana.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el acontecimiento de modificación génica dirigida está mediado por recombinación homóloga.

3. Un procedimiento, de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la modificación es inactivación, eliminación o modificación de un gen; regulación positiva de un gen, reemplazo génico o colocación de transgenes.

4. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el acontecimiento de modificación génica dirigida produce una proporción de clon celular con modificación génica dirigida:clon celular modificado aleatoriamente igual a o mayor que 1:100.

5. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el acontecimiento de modificación génica dirigida se realiza en un locus expresado abundantemente en la célula somática huésped.

6. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que un gen estructural se coloca adyacente a un promotor endógeno.

7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el promotor endógeno es el del gen del colágeno.

8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el promotor endógeno es el del gen de la proteína de la leche.

9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el promotor endógeno dirige la expresión abundante en células fibroblásticas.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el promotor endógeno dirige la expresión abundante en células endoteliales.

11. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el acontecimiento de modificación génica dirigida está mediado por lipofección.

12. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el acontecimiento de modificación génica dirigida implica el uso de un vector dirigido al gen, en el que el vector comprende una región larga de homología con el locus diana.

13. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el acontecimiento de modificación génica dirigida implica el uso de un vector dirigido al gen que está en forma circular.

14. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el acontecimiento de modificación génica dirigida incluye la inducción artificial de expresión génica o la inducción de cambios en la cromatina en la célula.

15. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el acontecimiento de modificación génica dirigida está facilitado por un agente que inhibe la desacetilación de histonas o por la expresión en la célula de un factor que estimula la transcripción en el locus diana.

16. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la célula somática no humana es una célula somática primaria.

17. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que la célula somática no humana es una célula epitelial o una célula fibroblástica o una célula endotelial o una célula muscular.

18. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que la transferencia del material genético desde la célula somática no humana hasta una célula receptora no humana proporciona un embrión animal no humano.

19. Un procedimiento, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, que comprende adicionalmente la producción de una población celular clonada totipotente o pluripotente no humana.

20. Un embrión no humano transgénico o un feto no humano transgénico que se puede obtener mediante un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el genoma contiene ADN exógeno.

21. Una célula no humana transgénica obtenida del embrión no humano o del feto no humano de la reivindicación 20.

22. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en el que se usa una célula del embrión animal no humano para transferencia nuclear adicional.

23. Un procedimiento para preparar un animal no humano transgénico, que comprende causar que un animal no humano se desarrolle a término a partir del embrión no humano de acuerdo con la reivindicación 20 y, opcionalmente, reproducirlo a partir del animal.

24. Un animal transgénico que se puede obtener por el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 23.

25. Un animal transgénico de acuerdo con la reivindicación 24 que es una oveja, una vaca, un toro, una cabra, un cerdo, un caballo, un camello, un conejo, o un roedor.

26. Un animal transgénico que se reproduce a partir de un animal de acuerdo con la reivindicación 24 o la reivindicación 25.

27. Un procedimiento para obtener una población celular pluripotente o totipotente no humana clonal que comprende cultivar una línea celular a partir de un embrión transgénico no humano o de un feto transgénico no humano de acuerdo con la reivindicación 20.

28. Una población celular pluripotente o totipotente no humana clonal que se puede obtener de acuerdo con un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 27.


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