Modificación del ADN inducida por el efector TAL.

Un método para modificar el material genético de una célula, que comprende:

(a) proporcionar una célula que contiene una secuencia de ADN diana; y

(b) introducir en la célula un vector que codifica una endonucleasa de efector de tipo activador de la transcripción (TAL), comprendiendo la endonucleasa de efector TAL:

(i) un dominio de endonucleasa que puede romper un ADN de cadena doble, donde el dominio de endonucleasa procede de una endonucleasa de restricción de tipo II, y

(ii) un dominio de efector TAL que comprende una pluralidad de secuencias de repetición de efector TAL que, combinadas, se unen a una secuencia de nucleótidos específica de la secuencia de ADN diana, de tal modo que la endonucleasa de efector TAL rompe la secuencia de ADN diana dentro de, o adyacente a, la secuencia de nucleótidos específica de la célula o de su progenie.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2010/059932.

Solicitante: REGENTS OF THE UNIVERSITY OF MINNESOTA.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 1000 WESTGATE DRIVE, SUITE 160 ST. PAUL, MINNESOTA 55114-8658 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: ZHANG, FENG, WANG, LI, VOYTAS,DANIEL F, BOGDANOVE,ADAM, CHRISTIAN,MICHELLE, CERMAK,TOMAS, SCHMIDT,CLARICE LAUER, DOYLE,ERIN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/10 (Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34))

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Fragmento de la descripción:

Modificación del ADN inducida por el efector TAL Campo técnico

La presente invención se refiere a métodos de modificación genética dirigida (del inglés "gene targeting"), y particularmente a métodos que incluyen el uso de secuencias efectoras de tipo activador de transcripción (TAL, del inglés "transcription activator-like").

Antecedentes

La capacidad para modificar cromosomas mediante recombinación homologa (modificación genética dirigida) ha sido una meta largo tiempo perseguida por los biólogos. Por ejemplo, en plantas, los métodos de modificación genética dirigida pueden ayudar a discernir la función de genes vegetales, abriendo nuevas posibilidades para la mejora de cultivos. Por ejemplo, con los métodos de modificación genética dirigida es posible llevar a cabo la cirugía genética requerida para reosquestar rutas metabólicas para crear cultivos de alto valor, que incluyen semillas con perfiles alterados de aceites o carbohidratos, alimentos con cualidades nutricionales mejoradas, o plantas con resistencia incrementada frente a enfermedades y estrés. En animales (p.ej. mamíferos), la modificación genética dirigida puede usarse para el tratamiento de una enfermedad. Por ejemplo, la modificación genética dirigida puede usarse para diseñar correcciones en genes que sean defectuosos debido a diversos tipos de mutaciones. Ha sido difícil alcanzar métodos eficientes para dicha modificación génica dirigida.

Sumario

Los efectores TAL de bacterias patógenas vegetales del género Xanthomonas desempeñan funciones importantes en la enfermedad, o en la activación de defensas, uniéndose a ADN hospedante y activando genes hospedantes específicos de efector (véase, p.ej., Gu et al. (25) Nature 435: 1122; Yang et al. (26) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 13: 153; Kay et al. (27) Science 318: 648; Sugio et al. (27) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 14: 172; y Rómer et al. (27) Science 318: 645). La especificidad depende de un número variable con el efector de repeticiones de aminoácidos imperfectas, normalmente 34 (Schornack et al. (26) J. Plant Physiol. 163: 256). Existen polimorfismos principalmente en las posiciones de repetición 12 y 13, que en la presente memoria se denominan diresiduo-variable de repetición (RVD, del inglés "repeat variable-diresidue").

La presente invención se basa en parte en el hecho de que los RVDs de efectores TAL se corresponden con los nucleótidos de sus sitios diana de un modo directo y lineal, un RVD por nucleótido, con alguna degeneración y sin dependencia de contexto aparente. Este sorprendente descubrimiento representa un nuevo mecanismo para el reconocimiento proteína-ADN que permite la predicción de sitios diana para nuevos efectores TAL específicos de diana. Tal como se describe en la presente memoria, estas proteínas pueden ser útiles en investigación y biotecnología como nucleasas quiméricas dirigidas que pueden facilitar la recombinación homologa en modificaciones genómicas (p.ej., para añadir o potenciar rasgos útiles para biocombustibles o productos biorrenovables en plantas). Dichas proteínas también podrían ser útiles, por ejemplo, como factores de transcripción, y especialmente para aplicaciones terapéuticas que requieran un nivel muy elevado de especificidad, tal como los agentes terapéuticos contra patógenos (p.ej. virus), como ejemplos no limitativos.

En un aspecto, la presente descripción presenta un método para modificar el material genético de una célula, que comprende (a) proporcionar una célula que contiene una secuencia de ADN diana; y (b) introducir una enzima modificadora de ADN-efector de tipo de activador de transcripción (TAL) en la célula, comprendiendo dicha enzima modificadora de ADN-efector TAL (i) un dominio enzimático modificador de ADN que pueda modificar ADN de cadena doble, y (ii) un dominio de efector TAL que comprenda una pluralidad de secuencias de repetición de efector TAL que, combinadas, se unan a una secuencia de nucleótidos específica de la secuencia de ADN diana, de tal modo que la enzima modificadora de ADN-efector TAL modifique el ADN diana en, o adyacente a, la secuencia de nucleótidos específica de la célula o de su progenie. El método puede comprender además proporcionar a la célula un ácido nucleico que comprende una secuencia homologa a al menos una porción de la secuencia de ADN diana, de tal modo que se produzca la recombinación homologa entre la secuencia de ADN diana y el ácido nucleico. La célula puede ser una célula eucariótica, una célula de mamífero, una célula vegetal o una célula procariótica. El ADN diana puede ser ADN cromosomal. La introducción puede comprender transfectar la célula con un vector que codifica la enzima modificadora de ADN-efector TAL, inyectar mecánicamente la enzima modificadora de ADN- efector TAL al interior de la célula como una proteína, administrar la enzima modificadora de ADN-efector TAL al interior de la célula como una proteína mediante un sistema de secreción bacteriana de tipo III, o introducir la enzima modificadora de ADN-efector de TAL en el interior de la célula como una proteína mediante electroporación. La enzima modificadora de ADN puede ser una endonucleasa (p.ej., una endonucleasa de restricción de tipo II, tal como Fok\).

El dominio de efector TAL que se une a una secuencia de nucleótidos específica dentro del ADN diana puede comprender 1 o más repeticiones de unión a ADN, y preferiblemente 15 o más repeticiones de unión a ADN. Cada repetición de unión a ADN puede incluir un diresiduo-variable de repetición (RVD) que determina el reconocimiento

de un par base en la secuencia de ADN diana, donde cada repetición de unión a ADN es responsable del reconocimiento de un par base de la secuencia de ADN diana, y donde el RVD comprende uno o más de: HD para reconocer C; NG para reconocer T; NI para reconocer A; NN para reconocer G ó A; NS para reconocer A ó C ó G ó T; N* para reconocer C ó T, donde * representa un hueco en la segunda posición del RVD; HG para reconocer T; H* para reconocer T, donde * representa un hueco en la segunda posición del RVD; IG para reconocer T; NK para reconocer G; HA para reconocer C; ND para reconocer C; Hl para reconocer C; HN para reconocer G; NA para reconocer G; SN para reconocer G ó A; e YG para reconocer T. Cada repetición de unión a ADN puede comprender un RVD que determina el reconocimiento de un par base de la secuencia de ADN diana, donde cada repetición de unión a ADN es responsable del reconocimiento de un par base de la secuencia de ADN diana, y donde el RVD comprende uno o más de: HA para reconocer C; ND para reconocer C; Hl para reconocer C; HN para reconocer G; NA para reconocer G; SN para reconocer G ó A; YG para reconocer T; y NK para reconocer G, y uno o más de: HD para reconocer C; NG para reconocer T; NI para reconocer A; NN para reconocer G ó A; NS para reconocer A ó C ó G ó T; N* para reconocer C ó T, donde * representa un hueco en la segunda posición del RVD; HG para reconocer T; H* para reconocer T, donde * representa un hueco en la segunda posición del RVD; e IG para reconocer T.

En otro aspecto, la presente descripción presenta un método para generar un ácido nucleico que codifica un efector TAL específico de una secuencia de nucleótidos seleccionada, que comprende: (1) linealizar un plásmido de partida con PspXI, comprendiendo dicho plásmido de partida una secuencia de nucleótidos que codifica un primer dominio de repetición de ADN de efector TAL que tiene un diresiduo-variable de repetición (RVD) específico del primer nucleótido de la secuencia de nucleótidos seleccionada, donde el primer dominio de repetición de unión a ADN de efector TAL tiene un sitio único PspXI en su extremo 3; (2) ligar en el sitio PspXI del plásmido de partida un módulo de... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para modificar el material genético de una célula, que comprende:

(a) proporcionar una célula que contiene una secuencia de ADN diana; y

(b) introducir en la célula un vector que codifica una endonucleasa de efector de tipo activador de la transcripción (TAL), comprendiendo la endonucleasa de efector TAL:

(i) un dominio de endonucleasa que puede romper un ADN de cadena doble, donde el dominio de endonucleasa procede de una endonucleasa de restricción de tipo II, y

(ii) un dominio de efector TAL que comprende una pluralidad de secuencias de repetición de efector TAL que, combinadas, se unen a una secuencia de nucleótidos específica de la secuencia de ADN diana,

de tal modo que la endonucleasa de efector TAL rompe la secuencia de ADN diana dentro de, o adyacente a, la secuencia de nucleótidos específica de la célula o de su progenie.

2. El método de la reivindicación 1, que además comprende proporcionar a la célula un ácido nucleico que comprende una secuencia homologa a al menos una porción de la secuencia de ADN diana, de tal modo que se produzca la recombinación homologa entre la secuencia de ADN diana y el ácido nucleico.

3. El método de la reivindicación 1 ó de la reivindicación 2, en el que la célula es una célula de mamífero.

4. El método de la reivindicación 1 ó de la reivindicación 2, en el que la célula es una célula vegetal.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la introducción comprende transfectar la célula con un vector que codifica la endonucleasa de efector TAL.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la endonucleasa de restricción de tipo II es Fok\.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el dominio de efector TAL que se une a una secuencia de nucleótidos específica dentro de la secuencia de ADN diana comprende 1 ó más secuencias de repetición de efector TAL, más preferiblemente 15 ó más secuencias de repetición de efector TAL.

8. El método de la reivindicación 7, en el que la secuencia de repetición de efector TAL comprende un diresiduo variable de repetición (RVD) que determina el reconocimiento de un par base de la secuencia de ADN diana, donde cada secuencia de repetición de efector TAL es responsable del reconocimiento de un par base de la secuencia de ADN diana, y donde el RVD comprende uno o más de:

HD para reconocer C;

NG para reconocer T;

NI para reconocer A;

NN para reconocer G;

NS para reconocer A;

HG para reconocer T;

IG para reconocer T;

NK para reconocer G;

HA para reconocer C;

ND para reconocer C;

Hl para reconocer C;

HN para reconocer G; y

NA para reconocer G.

9. Un método para generar un ácido nucleico que codifica una endonucleasa de efector TAL, comprendiendo dicho método:

(a) identificar una primera secuencia de nucleótidos única en el genoma de una célula; y

(b) sintetizar un ácido nucleico que codifica una endonucleasa de efector TAL que comprende (i) una pluralidad de secuencias de repetición de efector TAL que, combinadas, se unen a la primera secuencia de nucleótidos única, y (¡i) una endonucleasa que genera una ruptura de cadena doble en, o adyacente a, la primera secuencia de nucleótidos, donde cada secuencia de repetición de efector TAL comprende un RVD que determina el reconocimiento de un par base del ADN diana, donde cada secuencia de repetición de efector TAL es responsable del reconocimiento de un par base del ADN diana, y donde la endonucleasa de efector TAL comprende uno o más de los siguientes RVDs:

HD para reconocer C;

NG para reconocer T;

NI para reconocer A;

NN para reconocer G;

NS para reconocer A;

HG para reconocer T;

IG para reconocer T;

NK para reconocer G;

HA para reconocer C;

ND para reconocer C;

Hl para reconocer C;

HN para reconocer G; y

NA para reconocer G.

1. El método de la reivindicación 9, en el que la primera secuencia de nucleótidos cumple al menos uno de los siguientes criterios:

i) tiene un mínimo de 15 bases de longitud y está orientada de 5 a 3 con una T precediendo de forma inmediata al sitio del extremo 5;

ii) no tiene una T en la primera (5) posición o una A en la segunda posición;

iii) acaba en T en la última (3) posición y no tiene una G en la siguiente a la última posición; y

iv) tiene una composición de bases de -63% de A, 11-63% de C, -25% de G y 2-42% de T.

11. El método de la reivindicación 9 ó de la reivindicación 1, que comprende además la identificación de una segunda secuencia de nucleótidos en el genoma de la célula, donde la primera y la segunda secuencias de nucleótidos están separadas por 15-18 pb.

12. El método de la una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la endonucleasa genera una ruptura de cadena doble entre la primera y la segunda secuencias de nucleótidos.

13. Un monómero de endonucleasa de efector TAL que comprende un dominio de endonucleasa y un dominio de unión de ADN de efector TAL específico de una diana de ADN, donde el dominio de endonucleasa procede de una endonucleasa de restricción de tipo II, donde el dominio de unión de ADN comprende una pluralidad de secuencias de repetición de efector TAL, comprendiendo cada secuencia de repetición de efector TAL un RVD que determina el reconocimiento de un par base de la diana de ADN, y donde cada secuencia de repetición de efector TAL es responsable del reconocimiento de un par base de la diana de ADN.

14. El monómero de endonucleasa de efector TAL de la reivindicación 13, donde la endonucleasa de restricción de tipo II es Fok\.

15. El monómero de endonucleasa de efector TAL de la reivindicación 14, donde dicho monómero actúa como un dímero con otro monómero a través de un sitio de reconocimiento bipartito con un espaciador, lo que permite que la Fok\ se dimerice y cree una ruptura de cadena doble en dicha diana de ADN dentro de dicho espaciador.

16. El monómero de endonucleasa de efector TAL de la reivindicación 13, donde el monómero de endonucleasa de efector TAL comprende uno o más de los siguientes RVDs:

HD para reconocer C;

NG para reconocer T;

NI para reconocer A;

NN para reconocer G;

NS para reconocer A;

HG para reconocer T;

IG para reconocer T;

NK para reconocer G;

HA para reconocer C;

ND para reconocer C;

Hl para reconocer C;

HN para reconocer G; y NA para reconocer G.

17. El monómero de endonucleasa de efector TAL de la reivindicación 13, donde la secuencia de aminoácidos de dicha endonucleasa de efector TAL tiene al menos un 95% de Identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 33 a SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 72 y SEQ ID NO: 73.

18. Un método para generar un animal no humano, que comprende:

i) proporcionar una célula eucariótica que comprende una secuencia de ADN diana en la cual se desea introducir una modificación genética, donde la célula comprende un ácido nucleico que codifica una endonucleasa de efector TAL según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17;

ii) generar una ruptura de cadena doble dentro de la secuencia de ADN diana con la endonucleasa de efector TAL; y

iii) generar un animal no humano a partir de la célula, o de su progenie, en la cual se ha producido la ruptura de cadena doble.

19. El método de la reivindicación 18, que además comprende:

introducir en la célula un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia homologa a al menos una porción del ADN diana, donde la introducción se realiza en las condiciones que permitan que se produzca una recombinación homologa entre el ácido nucleico exógeno y la secuencia de ADN diana de la célula o de su progenie; y

generar un animal no humano a partir de la célula, o de su progenie, en la que se ha producido la recombinación homologa.

2. Un método para generar una planta, que comprende:

I) proporcionar una célula vegetal que comprende una secuencia de ADN diana en la cual se desea introducir una modificación genética preseleccionada, donde la célula vegetal comprende un ácido nucleico que codifica una endonucleasa de efector TAL según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17;

¡I) generar una ruptura de cadena doble dentro de la secuencia de ADN diana con la endonucleasa de efector TAL; y iii) generar una planta a partir de la célula, o de su progenie, en la cual se ha producido la ruptura de cadena doble.

21. El método de la reivindicación 2, que además comprende:

introducir en la célula vegetal un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia homologa a al menos una porción de la secuencia de ADN diana, donde la introducción se realiza en las condiciones que permitan que se produzca una recombinación homologa entre el ácido nucleico exógeno y la secuencia de ADN diana de la célula o de su progenie; y

generar una planta a partir de la célula, o de su progenie, en la que se ha producido la recombinación homologa.

22. Un método para la recombinación genética dirigida en una célula, que comprende:

i) introducir en la célula un ácido nucleico que codifica una endonucleasa de efector TAL según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, donde dicha endonucleasa de efector TAL está dirigida a una secuencia de ADN diana seleccionada;

ii) inducir la expresión de la endonucleasa de efector TAL dentro de la célula; y

iii) Identificar una célula en la que la secuencia de ADN diana seleccionada exhiba una mutación.

23. El método de la reivindicación 22, en el que la mutación se selecciona del grupo que consiste en eliminación de material genético, inserción de material genético y ambas, eliminación e inserción de material genético.

24. El método de la reivindicación 22, que además comprende introducir ADN donante en la célula.

25. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en el que la célula es una célula de insecto, una 1 célula vegetal, una célula de pez o una célula de mamífero.

26. Un ácido nucleico que codifica una endonucleasa de efector TAL que comprende (i) un dominio de endonucleasa que puede romper ADN de cadena doble, donde el dominio de endonucleasa procede de una endonucleasa de restricción de tipo II, y (¡i) un dominio de efector TAL que comprende una pluralidad de secuencias de repetición de efector TAL que, combinadas, se unen a una secuencia de ADN diana seleccionada.

27. El ácido nucleico de la reivindicación 26, donde dicho dominio de endonucleasa procede de Fok\.

28. Una casete de expresión que comprende un promotor ligado operativamente al ácido nucleico de la reivindicación 26 ó de la reivindicación 27.

29. Una célula hospedante que comprende la casete de expresión de la reivindicación 28.