MINICÉLULAS BACTERIANAS PURIFICADAS.

Una preparación de minicélulas derivada de bacterias purificada que contiene menos de aproximadamente 1 célula bacteriana parental contaminante por 10 10 minicélulas

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E08101712.

Solicitante: ENGENEIC MOLECULAR DELIVERY PTY LTD.

Nacionalidad solicitante: Australia.

Dirección: BUILDING 2, 25 SIRIUS ROAD LANE COVE WEST SYDNEY NSW 2066 AUSTRALIA.

Inventor/es: BRAHMBHATT, HIMANSHU, MACDIARMID,JENNIFER.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 23 de Junio de 2004.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N1/02 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › Separación de microorganismos de sus medios de cultivo.
  • C12N1/20 C12N 1/00 […] › Bacterias; Sus medios de cultivo.

Clasificación PCT:

  • C12N1/02 C12N 1/00 […] › Separación de microorganismos de sus medios de cultivo.
  • C12N1/20 C12N 1/00 […] › Bacterias; Sus medios de cultivo.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre.

PDF original: ES-2367535_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

La presente invención se refiere a minicélulas bacterianas purificadas. Una minicélula es una forma anucleada de una célula bacteriana E. coli u otra, engendrada por una perturbación en la coordinación, durante la fisión binaria, de la división celular con segregación de ADN. La replicación cromosómica procariota está ligada a fisión binaria normal, que implica formación de tabique celular medio. En E. coli, por ejemplo, la mutación de genes min, tales como minCD, pueden eliminar la inhibición de formación de tabique en los polos celulares durante la división celular dando como resultado producción de una célula hija normal y una minicélula anucleada (de Boer y col., 1992; Raskin & de Boer, 1999; Hu & Lutkenhaus, 1999; Harry, 2001). Además de las mutaciones de operón min, las minicélulas anucleadas también se generan después de una serie de otros reordenamientos genéticos o mutaciones que afectan a la formación del tabique, por ejemplo, en el divIVB1 en B. subtilis (Reeve y Cornett, 1975; Levin y col., 1992). También pueden formarse minicélulas después de una perturbación en los niveles de expresión génica de proteínas implicadas en la división celular/segregación cromosómica. Por ejemplo, la sobreexpresión de minE conduce a división polar y producción de minicélulas. De forma similar, pueden resultar minicélulas sin cromosomas de defectos en segregación cromosómica, por ejemplo la mutación smc en Bacillus subtilis (Britton y col., 1998), delección spoOJ en B. subtilis (Ireton y col., 1994), mutación mukB en E. coli (Hiraga y col., 1989) y mutación parC en E. coli (Stewart y DAri, 1992). Pueden proporcionarse productos génicos en trans. Cuando se sobreexpresa de un plásmido de alto número de copias, por ejemplo, CafA puede potenciar la tasa de división celular y/o inhibir la partición de cromosomas después de la replicación (Okada y col., 1994), dando como resultado la formación de células encadenadas y minicélulas anucleadas (Wachi y col., 1989; Okada y col., 1993). Las minicélulas son distintas de otras vesículas pequeñas que se generan y se liberan espontáneamente en ciertas situaciones y, a diferencia de las minicélulas, no se deben a reordenamientos genéticos específicos o expresión génica episomal. Son ejemplares de tales otras vesículas las ampollas bacterianas, que son vesículas de membrana pequeñas (Dorward y col., 1989). Se han observado ampollas en varias especies bacterianas de Agrobacterium, Bacillus, Bordetella, Escherichia, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella y Shigella, por ejemplo. Pueden producirse ampollas bacterianas, por ejemplo, a través de la manipulación del ambiente de crecimiento (Katsui y col., 1982) y a través del uso de agentes desestabilizadores de membrana exógenos (Matsuzaki y col., 1997). Debido a que la replicación plasmídica dentro de células procariotas es independiente de la replicación cromosómica, los plásmidos pueden segregar en tanto células hijas normales como minicélulas durante la división celular aberrante descrita anteriormente. Por lo tanto, las minicélulas derivadas de E. coli min recombinante portan números significativos de copias de plásmidos, con todos los componentes celulares bacterianos excepto cromosomas y se han usado como tal en el estudio de la expresión génica codificada por plásmido in vitro. Véase Brahmbhatt (1987), Harlow y col. (1995) y Kihara y col. (1996). Brahmbhatt (1987) demostró, por ejemplo, que las minicélulas de E. coli pueden portar plásmidos recombinantes con insertos de ADN de hasta 20 kb, sin ningún ADN cromosómico y pueden expresar nueve o más proteínas recombinantes simultáneamente. Una solicitud de patente reciente, el documento WO 03033519, describió minicélulas intactas recombinantes que contienen moléculas de ácido nucleico terapéuticas. Tales minicélulas son vectores eficaces para suministrar oligonucleótidos y polinucleótidos a células huésped in vitro e in vivo. En consecuencia, son particularmente útiles para introducir moléculas de ácido nucleico que, tras la transcripción y/o traducción, actúan para aliviar o tratar de otro modo una enfermedad o modificar un rasgo asociado con un tipo de célula, tejido u órgano particular de un sujeto. Las aplicaciones de minicélulas in vivo generalmente requieren preparaciones de minicélulas de una alta pureza, particularmente con respecto a las bacterias parentales vivas, endotoxina libre y residuos celulares (incluyendo bacterias parentales muertas, fragmentos de membrana, ácidos nucleicos y componentes intracelulares) que podrían inducir una respuesta inflamatoria en un huésped inmunizado. Además, el uso de minicélulas en productos farmacéuticos comerciales requerirá procedimientos para purificar minicélulas según patrones farmacéuticos internacionales aprobados. Para este fin, los procedimientos convencionales de purificación de minicélulas generalmente son insatisfactorios. Las técnicas convencionales implican (a) centrifugación a baja velocidad, para reducir la biocarga de células parentales y (b) sedimentación de tasa diferencial en un gradiente de glicerol, sacarosa o percol. Un diferencial inicial, la centrifugación a baja velocidad normalmente reduce las células parentales hasta en 100 veces, dejando de 50 % a 70 % de las minicélulas en el fluido sobrenadante. Dos ciclos posteriores de sedimentación de tasa diferencial producen después preparaciones de minicélulas que tienen una pureza de aproximadamente 1 célula vegetativa por 10 6 - 10 7 minicélulas. Tales procedimientos convencionales se revisan en Frazer & Curtiss (1975) y se describen por Reeve (1979), Clark-Curtiss & Curtiss (1983) y la Patente de Estados Unidos Nº 4.311.797 (de Khachatourians). 2 La pureza conseguida por procedimientos de purificación convencionales puede no ser adecuada para todas las aplicaciones in vivo, algunas de las cuales pueden requerir dosis mayores de 10 6 minicélulas o incluso 10 10 minicélulas. A la relación de contaminación anteriormente mencionada, esto se traduciría en 10.000 células parentales vivas por dosis. Un nivel de contaminación tal podría ser letal, particularmente en pacientes inmunocomprometidos tales como pacientes de cáncer y SIDA. Por ejemplo, la DI50 (dosis infecciosa en 50 % de las personas infectadas) para organismos Shigella dysenteriae, Salmonella enteritidis y Listeria monocytogenes es de aproximadamente 10, 1.000, y 10 respectivamente. Además, estudios anteriores han indicado que el nivel de contaminación de células parentales varía con las diferentes cepas bacterianas (Clarke-Curtiss y Curtiss, 1983). A este respecto, las aplicaciones de terapia génica descritas en el documento WO 03033519 pueden emplear minicélulas derivadas de una serie de cepas bacterianas mutantes Gram-negativas y Gram-positivas y requerirían minicélulas que están esencialmente sin contaminación de células bacterianas parentales vivas. Por lo tanto, los procedimientos de purificación de minicélulas convencionales no permiten el control de calidad para fabricación cGMP (buenas prácticas de fabricación actuales) de dosis biofarmáceuticas de minicélulas. Como un inconveniente adicional, los medios de formación de gradiente (percol, sacarosa y glicerol) empleados por procedimientos de purificación convencionales son incompatibles con usos in vivo. El percol es tóxico y, por lo tanto, se restringe a contextos de fines de investigación solamente. La sacarosa transmite una alta osmolaridad a gradientes que puede provocar cambios fisiológicos en las minicélulas. De hecho, los presentes inventores han determinado que las minicélulas experimentan un choque osmótico en gradientes de sacarosa y, como consecuencia, se vuelven estructuralmente deformadas. El glicerol es altamente viscoso y difícil de retirar completamente de las suspensiones de minicélulas. En consecuencia, aunque estos medios de gradiente de densidad separan eficazmente células y orgánulos o componentes celulares, no son adecuados para separar células biológicas que están destinadas a uso clínico en seres humanos. Se han desarrollado varios enfoques para mejorar las técnicas de purificación de minicélulas convencionales. Un enfoque emplea células parentales que portan una mutación recA cromosómica y tratamiento con dosis bajas de radiación ultravioleta (UV) (Sancar y col., 1979). El fundamento de este enfoque es que la radiación UV degradará preferentemente el ADN cromosómico debido a su gran tamaño de diana, a diferencia de ADN plasmídico menor. Sin embargo, las minicélulas recombinantes usadas para terapia génica y aplicaciones de vacuna deben estar sin ninguna mutación y los procedimientos de mutagénesis no específicos tales como radiación UV no asegurarían que todos los ADN plasmídicos permanezcan no mutados. Otro enfoque para mejorar la purificación de... 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Reivindicaciones:

1. Una preparación de minicélulas derivada de bacterias purificada que contiene menos de aproximadamente 1 célula bacteriana parental contaminante por 10 10 minicélulas. 2. La preparación de la reivindicación 1, en la que dicha preparación contiene menos de aproximadamente 1 célula bacteriana parental contaminante por 10 11 minicélulas. 3. La preparación de la reivindicación 1 ó 2, estando dicha preparación sustancialmente libre de endotoxinas. 4. La preparación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, estando dicha preparación sustancialmente libre de residuos celulares. 14 ES 2 367 535 T3 ES 2 367 535 T3 16 ES 2 367 535 T3 17 ES 2 367 535 T3 18 ES 2 367 535 T3 19 ES 2 367 535 T3 ES 2 367 535 T3 21 ES 2 367 535 T3 22 ES 2 367 535 T3 23 ES 2 367 535 T3 24

 

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