Miembro de unión para el receptor GM-CSF.

Un miembro de unión para la cadena alfa del Receptor del factor de estimulación de colonias degranulocitos/macrófagos (GM-CSFRα

) aislado, en el que el miembro de unión:

inhibe la unión de GM-CSF a GM-CSFRα humano; y

tiene una KD inferior a 5 nM para la unión a GM-CSFRα humano determinada por resonancia de plasmónsuperficial;

y en el que el miembro de unión comprende:

un conjunto de regiones determinantes de la complementariedad de VH (CDR): CDR1 de VH que comprende la SECID Nº: CDR2 de VH que comprende la SEC ID Nº: CDR3 de VH que comprende la SEC ID Nº: 55, opcionalmente,con hasta 10 sustituciones de aminoácidos en dicho conjunto de CDR de VH, en un marco estructural del dominioVH del anticuerpo o un andamiaje de proteína, y opcionalmente

un conjunto de CDR de VL: CDR1 de VL que comprende la SEC ID Nº: CDR2 de VL que comprende la SEC ID Nº:59 y CDR3 de VL que comprende la SEC ID Nº: 60, opcionalmente, con hasta 10 sustituciones de aminoácidos endicho conjunto de CDR de VL, en una marco estructural del dominio VL del anticuerpo o un andamiaje de proteína.

Miembro de unión para el receptor GM-CSF

La presente invención se refiere a miembros de unión para la cadena alfa del Receptor del Factor de Estimulación de Colonias de Granulocitos/Macrófagos (GM-CSFR!) , especialmente moléculas de anticuerpo anti-GM-CSFR!. También se refiere al uso de estos miembros de unión en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, respiratorias y autoinmunitarias mediadas por GM-CSFR!, incuidas la artritis reumatoide, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y la esclerosis múltiple.

El GM-CSF es una citocina proinflamatoria de tipo I, que mejora la supervivencia, la proliferación y/o la diferenciación de una amplia serie de tipos de células hematopoyéticas que incluyen neutrófilos, eosinófilos, macrófagos y sus células progenitoras. El receptor GM-CSF es un miembro de la superfamilia del receptor de la hematopoyetina. Es heterodimérico, está constituido por una subunidad alfa y una beta. La subunidad alfa es altamente específica para el GM-CSF mientras que la subunidad beta está compartida con otros receptores de citocinas, que incluyen la IL3 y la IL5. Esto se refleja en una distribución en el tejido más amplia de la subunidad beta del receptor. La subunidad alfa, GM-CSFR!, se expresa principalmente en las células mieloides y en las células no hematopoyéticas, tales como los neutrófilos, los macrófagos, los eosinófilos, las células dendríticas, las células endoteliales y las células epiteliales respiratorias. El GM-CSFR! de longitud completa es una glicoproteína de membrana de tipo I de 400 aminoácidos que pertenece a la familia de receptores de citocinas de tipo I, y está constituida por un péptido señal de 22 aminoácidos (posiciones 1-22) , un dominio extracelular de 298 aminoácidos (posiciones 23-320) , un dominio transmembrana en las posiciones 321 - 345 y un dominio intra-celular corto de 55 aminoácidos. El péptido señal se escinde para proporcionar la forma madura de GM-CSFR! como una proteína de 378 aminoácidos. Están disponibles los clones de ADNc de GM-CSFR! humano y murino y, a nivel de proteína, las subunidades del receptor tienen el 36 % de identidad. El GM-CSF es capaz de unirse con una afinidad relativamente baja a la subunidad ! sola (Kd 1-5 nm) pero no se une en absoluto a la subunidad ∀ sola. Sin embargo, la presencia de ambas subunidades ! y ∀ dan lugar a un complejo ligando-receptor de alta afinidad (Kd ≈ 100pM) . La señalización de GM-CSF se produce mediante su unión inicial a la cadena ! de GM-CSFR y el entrecruzamiento posterior con una subunidad más grande de la cadena ∀ común para generar la interacción de alta afinidad, que fosforila la ruta JAK-STAT. La unión de GM-CSFR al GMCSF se examina en la ref. [1]. Esta interacción además es capaz de señalizar mediante la fosforilación de tirosina y la activación de la ruta de la cinasa MAP.

Patológicamente, se ha demostrado que el GM-CSF desempeña un papel en la exacerbación de las enfermedades inflamatorias, respiratorias y autoinmunitarias. La neutralización de la unión de GM-CSF al GM-CSFR! es, por lo tanto, un enfoque terapéutico para el tratamiento de las enfermedades y las afecciones mediadas por GM-CSFR.

Nicola y col.. [2] han descrito un anticuerpo murino contra el GM-CSFR! humano, que se denominó 2B7-17-A o "2B7", que se ha informado que tiene una afinidad relativamente alta por el GM-CSFR! humano y es un potente inhibidor de la acción biológica del GM-CSF humano en varios bioensayos diferentes. El anticuerpo 2B7 está

disponible comercialmente de Chemicon como MAB1037, y la ficha de especificaciones técnicas para el MAB1037 indica que este es un potente inhibidor de la acción biológica de GM-CSF.El 2B7 se ha descrito también en el documento WO94/09149.

Usando una combinación de selecciones de las bibliotecas de fagos scFv vírgenes, mutagénesis aleatoria y ensayos 45 biológicos y bioquímicos diseñados adecuadamente (ver la Parte experimental más abajo) , hemos identificado moléculas de anticuerpo muy potentes que se unen al GM-CSFR! humano e inhiben la acción de GM-CSF humano en su receptor. Los resultados presentados en el presente documento indican que nuestros anticuerpos se unen a una región o epítopo diferente de GM-CSFR! en comparación con el anticuerpo 2B7 anti-GM-CSFR! conocido y sorprendentemente, son aún más potentes que 2B7, como se ha demostrado en una diversidad de ensayos 50 biológicos.

En consecuencia, la presente invención se refiere a miembros de unión que se unen al GM-CSFR! humano e inhiben la unión de GM-CSF humano al GM-CSFR!, tal como se establece en las reivindicaciones adjuntas 1 a 6. Los miembros de unión de la invención pueden ser antagonistas de GM-CSFR. Los miembros de unión pueden ser

inhibidores reversibles competitivos de la señalización de GM-CSF a través del GM-CSFR.

Los anticuerpos y otros miembros de unión de la invención son particularmente valiosos en la unión a, y neutralización de, GM-CSFR! y, por lo tanto, se usan en tratamientos de enfermedades mediadas por el GM-CSFR!, incluidas enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias, tal como se indica mediante la experimentación 60 contenida en el presente documento y en la literatura técnica de apoyo adicional. Por ejemplo, se ha demostrado en ensayos basados en células que los anticuerpos de la invención son capaces de inhibir la liberación de citocinas (por ejemplo, IL-6 y TNF!) inducida por la unión de GM-CSF nativo a su receptor. Tal como se explica con más detalle más adelante, la inhibición de la actividad de GM-CSF mediante el bloqueo de la unión al GM-CSFR! es un enfoque terapéutico para el tratamiento de enfermedades tales como la artritis reumatoide (AR) , el asma, la inflamación de

las vías respiratorias inducida por el humo, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , reacciones alérgicas, la esclerosis múltiple (EM) , la leucemia mieloide y la aterosclerosis.

Los miembros de unión de acuerdo con la invención generalmente se unen al dominio extracelular de GM-CSFR!.

Preferentemente, un miembro de unión de la invención se une a al menos un residuo de Tyr-Leu-Asp-Phe-Gln (YLDFQ) , SEC ID Nº: 201, en las posiciones 226 a 230 de GM-CSFR! humano maduro (SEC ID Nº: 206) . El miembro de unión puede unirse a al menos un residuo en la secuencia YLDFQ de GM-CSFR! humano, por ejemplo, se puede unir a uno, dos, tres o cuatro residuos de la secuencia YLDFQ. Así, el miembro de unión puede reconocer uno o más residuos dentro de esta secuencia, y opcionalmente puede unirse también a residuos flanqueantes adicionales o residuos estructuralmente vecinos en el dominio extracelular de GM-CSFR!.

La unión se puede determinar por cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo se puede usar un análisis de unión a péptidos, tal como un inmunoensayo de unión a enzima (ELISA) basado en PEPSCAN, tal como se describe con detalle en otra parte en el presente documento. En un análisis de unión a péptidos, tal como el tipo 15 proporcionado por PEPSCAN Systems, se examinan sistemáticamente péptidos cortos superpuestos derivados de los antígenos para determinar la unión a un miembro de unión. Los péptidos se pueden acoplar covalentemente a una superficie de apoyo para formar una matriz de péptidos. En resumen, un análisis de unión a péptidos (por ejemplo, "PEPSCAN") incluye la identificación de (por ejemplo, por medio del uso del ELISA) un conjunto de péptidos a los que se une el miembro de unión, en el que los péptidos tienen secuencias de aminoácidos que 20 corresponden a los fragmentos de SEC ID Nº: 206 (por ejemplo, los péptidos de aproximadamente 15 residuos contiguos de SEC ID Nº: 206) y la alineación de los péptidos con el fin de determinar una huella de los residuos unidos por el miembro de unión, en la que la huella comprende los residuos comunes a los péptidos superpuestos. De acuerdo con la invención, la huella identificada mediante el análisis de la unión a péptidos o PEPSCAN puede comprender al menos un residuo de YLDFQ correspondiente a las posiciones 226 a 230 de la SEC ID Nº: 206. La 25 huella puede comprender uno, dos, tres, cuatro o todos los residuos de YLDFQ. Un miembro de unión de acuerdo con la presente invención se puede unir a un fragmento de péptido (por ejemplo, de 15 residuos) de SEC ID Nº: 206 que comprende uno o más, preferentemente todos, los residuos de YLDFQ correspondientes a las posiciones 226 a 230 de la SEC ID Nº: 206, por ejemplo, tal como se determina por un procedimiento de análisis de unión a péptidos o PEPSCAN descritos en el presente documento. Así, un miembro de unión de la invención se puede unir a un péptido que tiene una secuencia de aminoácido de 15 residuos contiguos de la SEC ID Nº:... [Seguir leyendo]

1. Un miembro de unión para la cadena alfa del Receptor del factor de estimulación de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSFR!) aislado, en el que el miembro de unión:

inhibe la unión de GM-CSF a GM-CSFR! humano; y

tiene una KD inferior a 5 nM para la unión a GM-CSFR! humano determinada por resonancia de plasmón superficial; 10 y en el que el miembro de unión comprende:

un conjunto de regiones determinantes de la complementariedad de VH (CDR) : CDR1 de VH que comprende la SEC ID Nº: CDR2 de VH que comprende la SEC ID Nº: CDR3 de VH que comprende la SEC ID Nº: 55, opcionalmente, 15 con hasta 10 sustituciones de aminoácidos en dicho conjunto de CDR de VH, en un marco estructural del dominio VH del anticuerpo o un andamiaje de proteína, y opcionalmente un conjunto de CDR de VL: CDR1 de VL que comprende la SEC ID Nº: CDR2 de VL que comprende la SEC ID Nº: 59 y CDR3 de VL que comprende la SEC ID Nº: 60, opcionalmente, con hasta 10 sustituciones de aminoácidos en 20 dicho conjunto de CDR de VL, en una marco estructural del dominio VL del anticuerpo o un andamiaje de proteína.

2. Un miembro de unión según la reivindicación 1, en el que el miembro de unión es una molécula de anticuerpo que comprende un dominio VH de anticuerpo que comprende CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH y un dominio VL de anticuerpo que comprende CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL.

3. Un miembro de unión según la reivindicación 2, en el que el dominio VH comprende:

4. Un miembro de unión según la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en el que el dominio VL comprende:

5. Un miembro de unión según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4,

S en el residuo de Kabat H17 del marco estructural de VH;

I en el residuo de Kabat H34 de CDR1 de VH;

E en el residuo de Kabat H54 de CDR2 de VH;

I en el residuo de Kabat H57 de CDR2 de VH;

I, L, V, A o M en el residuo de Kabat H94 del marco estructural de VH;

V, N, A o L en el residuo de Kabat H95 de CDR3 de VH;

S en el residuo de Kabat H97 de CDR3 de VH;

S, F, H, P, T o W en el residuo de Kabat H99 de CDR3 de VH;

A, T, P, S, V o H en el residuo de Kabat H100B de CDR3 de VH.

S en el residuo de Kabat 27A de CDR1 de VL;

N en el residuo de Kabat 27B de CDR1 de VL;

I en el residuo de Kabat 27C de CDR1 de VL;

D en el residuo de Kabat 32 de CDR1 de VL;

N en el residuo de Kabat 51 de CDR2 de VL;

N en el residuo de Kabat 52 de CDR2 de VL;

K en el residuo de Kabat 53 de CDR2 de VL;

S, T or M en el residuo de Kabat L90 de CDR3 de VL;

D, E, Q, S, M or T en el residuo de Kabat L92 de CDR3 de VL; y/o

S, P, I or V en el residuo de Kabat L96 de CDR3 de VL

en el que el conjunto de CDR de VH comprende CDR1 de VH con la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 3 o la 35 SEC ID Nº: 173, CDR2 de VH con la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 4 y CDR3 de VH con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID Nº: 5; SEC ID Nº: 15; SEC ID Nº: 35; SEC ID Nº: 45; SEC ID Nº: 55; SEC ID Nº: 65; SEC ID Nº: 75; SEC ID Nº: 85; SEC ID Nº: 95; SEC ID Nº: 105; SEC ID Nº: 115; SEC ID Nº: 125; SEC ID Nº: 135; SEC ID Nº: 145; SEC ID Nº: 155; SEC ID Nº: 165; SEC ID Nº: 175; SEC ID Nº: 185; y SEC ID Nº: 195; y en el que el conjunto de CDR de VL comprende CDR1 de VL con SEC ID Nº: 8, CDR2 de VL con SEC ID Nº: 9 y CDR3 de VL con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID Nº: 10; SEC ID Nº: 20; SEC ID Nº: 40; SEC ID Nº: 50; SEC ID Nº: 60; SEC ID Nº: 70; SEC ID Nº: 80; SEC ID Nº: 90; SEC ID Nº: 100; SEC ID Nº: 110; SEC ID Nº: 120; SEC ID Nº: 130; SEC ID Nº: 140; SEC ID Nº: 150; SEC ID Nº: 160; SEC ID Nº: 170; SEC ID Nº: 180; SEC ID Nº: 190; y SEC ID Nº: 200.

6. Un miembro de unión según la reivindicación 5, que comprende un domino VH y un domino VL seleccionado entre los siguientes: dominio VH SEC ID Nº: 2 y dominio VL SEC ID Nº: 208; dominio VH SEC ID Nº: 12 y dominio VL SEC ID Nº: 210; dominio VH SEC ID Nº: 32 y dominio VL SEC ID Nº: 214; dominio VH SEC ID Nº: 42 y dominio VL SEC ID Nº: 216; dominio VH SEC ID Nº: 52 y dominio VL SEC ID Nº: 218; dominio VH SEC ID Nº: 62 y dominio VL SEC ID Nº: 220; dominio VH SEC ID Nº: 72 y dominio VL SEC ID Nº: 222; dominio VH SEC ID Nº: 82 y dominio VL SEC ID Nº: 224; dominio VH SEC ID Nº: 92 y dominio VL SEC ID Nº: 226; dominio VH SEC ID Nº: 102 y dominio VL SEC ID Nº: 228; dominio VH SEC ID Nº: 112 y dominio VL SEC ID Nº: 230; dominio VH SEC ID Nº: 122 y dominio VL SEC ID Nº: 232; dominio VH SEC ID Nº: 132 y dominio VL SEC ID Nº: 234; dominio VH SEC ID Nº: 142 y dominio VL SEC ID Nº: 236; dominio VH SEC ID Nº: 152 y dominio VL SEC ID Nº: 238; dominio VH SEC ID Nº: 162 y dominio VL SEC ID Nº: 240; dominio VH SEC ID Nº: 172 y dominio VL SEC ID Nº: 242; dominio VH SEC ID Nº: 182 y dominio VL SEC ID Nº: 244; y dominio VH SEC ID Nº: 192 y dominio VL SEC ID Nº: 246.

7. Un procedimiento de producción de un miembro de unión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende cultivar una célula huésped que contiene una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el miembro de unión y después purificar el miembro de unión.