MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA INTERFERENCIA DE RNA.

"Interferencia de RNA", "silenciamiento postranscripcional de genes", "acallamiento (quelling)" estos diferentes nombres describen efectos similares que resultan de la sobre-expresión o falta de expresión de transgenes o de la introducción deliberada de RNA bicatenario en células (revisado por Fire A., (1999) Trends Genet 15: 358-363; Sharp PA., (1999) Genes Dev. 13: 139-141; Hunter C., (1999) Cur. Biol. 9: R440-R442; Baulcombe DC., (1999) Curr. Biol. 9: R599-R601; Vaucheret et al., (1998) Plant J. 16: 1-659). La inyección de RNA bicatenario en el nemátodo Caenorhabditis elegans, por ejemplo, actúa sistemáticamente causando el empobrecimiento postranscripcional del RNA endógeno homólogo (Fire et al., (1998) Nature 391: 806-811; y Montgomery et al., (1998) PNAS 95: 15502­ 15507). La interferencia de RNA usualmente conocida como RNAi, ofrece un modo de inactivar específicamente y potencialmente un gen clonado, y está demostrando ser una potente herramienta para investigar la función de los genes. Aunque el fenómeno es interesante por sí mismo, el mecanismo ha sido bastante misterioso, pero la investigación reciente - por ejemplo el trabajo recientemente descrito por Smardon et al., (2000) Curr. Biol. 10: 169-178 está empezando a derramar luz sobre la naturaleza y evolución de los procesos biológicos que subyacen en la RNAi. La RNAi fue descubierta cuando los investigadores intentaron usar el método del RNA antisentido para inactivar un gen de C. elegans y encontraron que la inyección de un RNA de cadena con sentido era realmente tan eficaz como el RNA antisentido en inhibir la función del gen (Guo et al., (1995) Cell 81: 611-620). Posterior investigación reveló que el agente activo era cantidades modestas de RNA bicatenario que contaminan las preparaciones de RNA in vitro. Los investigadores determinaron rápidamente las reglas y efectos de la RNAi que ha llegado a ser el paradigma para el pensamiento sobre el mecanismo que media este efecto. Se requieren secuencias de exones, mientras que las secuencias de intrones y promotores, aunque ineficaces, no parecen comprometer la RNAi (aunque para esta regla puede haber excepciones específicas de genes). La RNAi actúa sistémicamente pues la inyección en un tejido inhibe la función de los genes en las células de todo el animal. Los resultados de una variedad de experimentos, en C. elegans y otros organismos, indican que la RNAi actúa desestabilizando el RNA celular después del procesamiento del RNA. La potencia de la RNAi inspiró a Timmons and Fire (1998, Nature 395: 854) a realizar un sencillo experimento que produjo un resultado asombroso. Dichos autores alimentaron a bacterias de nemátodos que habían sido manipuladas por ingeniería genética para expresar RNA bicatenario correspondiente al gen unc-22 de C. elegans. Asombrosamente estos nemátodos desarrollaron un fenotipo similar al de mutantes de unc-22 que era dependiente de su fuente de alimentos. La capacidad de exponer condicionalmente grandes números de nemátodos a RNA bicatenarios específico de genes formó la base de un cribado muy potente para seleccionar mutantes de C. elegans defectuosos para la RNAi y luego identificar los genes correspondientes. Los RNA bicatenarios (abreviadamente a veces en lo sucesivo dsRNA por la expresión inglesa double-stranded RNA) pueden provocar silenciamiento de genes en numerosos contextos in vivo incluyendo Drosophila, Caenorhabditis elegans, planaria, hydra, tripanosomas, hongos y plantas. Sin embargo, la capacidad para repetir este fenómeno en eucariotas superiores, particularmente células de mamíferos, no ha sido conseguida en la técnica. Tampoco la técnica anterior demostró que se pudiera observar este fenómeno en células eucariotas cultivadas. Adicionalmente, las ''reglas'' establecidas por la técnica anterior han pensado que la RNAi requiere secuencias de exones, y por tanto no se creyó que construcciones que consisten en intrones o promotores fueran reactivos eficaces en mediar la RNAi. La presente invención aborda cada una de estas deficiencias de la técnica anterior y proporciona pruebas tanto de que la RNAi puede ser observada en células eucariotas cultivadas como de que las construcciones de RNAi que consisten en secuencias no exónicas pueden reprimir efectivamente la expresión de genes. Sumario de la invención ES 2 368 039 T3 Un aspecto de la presente invención proporciona un método para atenuar la expresión de un gen diana en una célula de mamífero, comprendiendo el método introducir en la célula de célula de mamífero in vitro, un vector de expresión que se integra cromosómicamente que comprende una secuencia que codifica un RNA corto con forma de horquilla (abreviadamente shRNA por la expresión inglesa short hairpin RNA), en donde el shRNA comprende una región bicatenaria que tiene una longitud de entre 20 y 29 bases, comprendiendo la región bicatenaria una secuencia que se hibrida en condiciones rigurosas con una región codificadora del gen diana, con lo cual se atenúa la expresión del gen diana. Otro aspecto de la presente invención proporciona un vector de expresión que se integra cromosómicamente para uso en un método de atenuar la expresión de un gen diana en una célula de mamífero, comprendiendo el vector de expresión una secuencia que codifica un RNA corto con forma de horquilla (shRNA), en donde el shRNA comprende una región bicatenaria que tiene una longitud de entre 19 y 29 pares de bases, comprendiendo la región bicatenaria una secuencia que se hibrida en condiciones rigurosas con una región codificadora del gen diana. 2 ES 2 368 039 T3 La presente invención proporciona además el uso de un vector de expresión que se integra cromosómicamente para la fabricación de un medicamento para uso en terapia, comprendiendo el vector de expresión una secuencia que codifica un RNA corto con forma de horquilla (shRNA), en donde el shRNA comprende una región bicatenaria que tiene una longitud de entre 19 y 29 pares de bases, comprendiendo la región bicatenaria una que se hibrida en condiciones rigurosas con una región codificadora del gen diana, con lo cual se atenúa la expresión del gen diana. En ciertas realizaciones, la célula está en suspensión en cultivo; mientras que en otras realizaciones la célula está en un animal completo, tal como un mamífero no humano. La célula puede ser manipulada por ingeniería genética con: (i) un gen recombinante que codifica actividad de Dicer, (ii) un gen recombinante que codifica una actividad de Argonaut, o (iii) ambos. Por ejemplo, el gen recombinante puede codificar, por ejemplo, una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos al menos 50 por ciento idéntica a la SEQ ID NO. 2 o 4; o ser definida por una secuencia codificadora que se hibrida en condiciones de lavado de 2 x SSC a 22ºC con la SEQ ID NO. 1 o 3. En ciertas realizaciones, el gen recombinante puede codificar, por ejemplo, una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos al menos 50 por ciento idéntica a la secuencia Argonaut mostrada en la Figura 24. En ciertas realizaciones, el gen recombinante puede codificar una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos al menos 60 por ciento, 70 por ciento, 80 por ciento, 85 por ciento, 90 por ciento, o 95 por ciento idéntica a la SEQ ID NO. 2 o 4. En ciertas realizaciones, el gen recombinante puede ser definido por una secuencia codificadora que se hibrida en condiciones rigurosas, que incluyen una etapa de lavado seleccionada de 0,2X-2,0X SSC a 50ºC-65ºC, con la SEQ ID NO. 1 o 3. En lugar de usar una(s) construcción(es) de secuencia(s) de expresión heteróloga(s), se puede activar un gen Dicer o un gen Argonaut endógenos, por ejemplo, por tecnología de activación de genes, expresión de factores de transcripción activados u otra(s) proteína(s) de transducción de señal, que induce(n) la expresión del gen o por tratamiento con un factor endógeno que sobre-regula el nivel de expresión de la proteína o inhibe la degradación de la proteína. El gen diana puede ser un gen endógeno de la célula o el gen diana puede ser un gen heterólogo con respecto al genoma de la célula, tal como un gen patógeno, por ejemplo, un gen viral. La célula puede ser tratada con un agente que inhibe la apoptosis activada por proteína-quinasa activada por RNA (abreviadamente PKR por la expresión inglesa Protein kinase RNA-activated), tal como por tratamiento con agentes que inhiben la expresión de la PKR, causan su destrucción, y/o inhiben la actividad de quinasa de la PKR. La célula puede ser una célula de primate, tal como una célula humana. En ciertas realizaciones preferidas, el dsRNA tiene una longitud de al menos 20, 21 o 22 nucleótidos, por ejemplo, correspondiendo en tamaño a los productos de RNA producidos por escisión dependiente de Dicer. La expresión del gen diana puede ser atenuada en al menos... [Seguir leyendo]

1. Un método para atenuar la expresión de un gen diana en una célula de mamífero, comprendiendo el método introducir en la célula de mamífero in vitro, un vector de expresión que se integra cromosómicamente que comprende una secuencia que codifica un RNA corto con forma de horquilla (shRNA), en donde el shRNA se expresa en la célula de mamífero y comprende una región bicatenaria de una longitud de entre 20 y 29 pares de bases, comprendiendo la región bicatenaria una secuencia que se hibrida en condiciones rigurosas con una región codificadora del gen diana, con los cual se atenúa la expresión del gen diana. 2. El método de la reivindicación 1, en donde el shRNA se expresa establemente en la célula de mamífero. 3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el vector de expresión comprende además una secuencia reguladora de la transcripción unida operativamente a la secuencia que codifica el shRNA. 4. El método de la reivindicación 1, en donde la región bicatenaria tiene una longitud de al menos 21 o 22 nucleótidos. 5. El método de la reivindicación 1, en donde la región bicatenaria tiene una longitud de al menos 25 nucleótidos. 6. El método de la reivindicación 1, en donde la región bicatenaria tiene una longitud de 29 nucleótidos. 7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la expresión del gen diana es atenuada en al menos 10 veces con respecto a una célula no tratada o una célula tratada con una construcción de dsRNA que no corresponde al gen diana. 8. Un vector de expresión que se integra cromosómicamente para uso en un método de atenuar la expresión de un gen diana en un célula de mamífero, comprendiendo el vector de expresión una secuencia que codifica un RNA corto con forma de horquilla (shRNA), en donde el shRNA comprende una región bicatenaria que tiene una longitud de entre 20 y 29 pares de bases, comprendiendo la región bicatenaria una secuencia que se hibrida en condiciones rigurosas con una región codificadora del gen diana. 9. Un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 8, para atenuar la expresión de un gen diana en una célula de mamífero in vivo. 10. Uso de un vector de expresión que se integra cromosómicamente para la fabricación de un medicamento para uso en terapia, comprendiendo el vector de expresión una secuencia que codifica un RNA corto con forma de horquilla (shRNA), en donde el shRNA comprende un región bicatenaria que tiene una longitud entre 20 y 29 pares de bases, comprendiendo la región bicatenaria una secuencia que se hibrida en condiciones rigurosas con una región codificadora del gen diana, con lo cual se atenúa la expresión del gen diana. 42 ES 2 368 039 T3 43 ES 2 368 039 T3 44 ES 2 368 039 T3 ES 2 368 039 T3 46 ES 2 368 039 T3 47 ES 2 368 039 T3 48 ES 2 368 039 T3 49 ES 2 368 039 T3 ES 2 368 039 T3 51 ES 2 368 039 T3 52 ES 2 368 039 T3 53 ES 2 368 039 T3 54 ES 2 368 039 T3 ES 2 368 039 T3 56 ES 2 368 039 T3 57 ES 2 368 039 T3 58 ES 2 368 039 T3 59 ES 2 368 039 T3 ES 2 368 039 T3 61 ES 2 368 039 T3 62 ES 2 368 039 T3 63 ES 2 368 039 T3 64 ES 2 368 039 T3 ES 2 368 039 T3 66 ES 2 368 039 T3 67 ES 2 368 039 T3 68 ES 2 368 039 T3 69 ES 2 368 039 T3 ES 2 368 039 T3 71 ES 2 368 039 T3 72 ES 2 368 039 T3 73 ES 2 368 039 T3 74 ES 2 368 039 T3 ES 2 368 039 T3 76 ES 2 368 039 T3 77 ES 2 368 039 T3 78 ES 2 368 039 T3 79 ES 2 368 039 T3 ES 2 368 039 T3 81 ES 2 368 039 T3 82 ES 2 368 039 T3 83 ES 2 368 039 T3 84 ES 2 368 039 T3 ES 2 368 039 T3 86 ES 2 368 039 T3 87 ES 2 368 039 T3 88 ES 2 368 039 T3 89 ES 2 368 039 T3 ES 2 368 039 T3 91 ES 2 368 039 T3 92 ES 2 368 039 T3 93 ES 2 368 039 T3 94 ES 2 368 039 T3 ES 2 368 039 T3 96 ES 2 368 039 T3 97 ES 2 368 039 T3 98