Métodos y usos para identificar el origen de un carcinoma de origen primario desconocido.

Un método de identificar el origen de una metástasis de origen desconocido que comprende los pasos de

a.

medir los Biomarcadores asociados con al menos seis carcinomas diferentes en una muestra que contiene células metastásicas en donde los Biomarcadores son niveles de expresión de al menos los genes Marcadores siguientes: SP-B, TTF1, DSG3, PSCA, F5, HPT1, PSA, MGB/MG, WT1 y PDEF;

b. combinar los datos de los Biomarcadores en un algoritmo donde el algoritmo

i. normaliza los Biomarcadores frente a la referencia; y

ii. impone un punto de corte que optimiza la sensibilidad y especificidad de cada Biomarcador, pondera la prevalencia de los carcinomas y selecciona un tejido de origen;

c. determinar el origen en base a la probabilidad más alta determinada por el algoritmo o determinar que el carcinoma no se deriva de un conjunto particular de carcinomas; y

d. medir opcionalmente los Biomarcadores específicos para uno o más carcinomas diferentes adicionales, y repetir los pasos c) y d) para los Biomarcadores adicionales.

CAMPO DE LA INVENCION

La invención proporciona métodos para identificar el origen de un carcinoma de origen primario desconocido.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

El carcinoma de origen primario desconocido (CUP) es un conjunto de tumores malignos confirmados por biopsia, heterogéneos, en donde la enfermedad metastásica presenta sin un sitio del tumor primario identificable o tejido de origen (toO) . Este problema representa aproximadamente un 3-5% de todos los cánceres, haciendo de él el séptimo tumor maligno más común. Ghosh et al. (2005) ; y Mintzer et al. (2004) . El pronóstico y régimen terapéutico de los pacientes son dependientes del origen del tumor primario, destacando la necesidad del sitio del tumos primario. Greco et al. (2004) ; Lembersky et al. (1996) ; y Schlag et al. (1994) .

Se usan actualmente una variedad de métodos para resolver este problema. Varios métodos seguidos se esquematizan en las Figuras 1-2. Se pueden usar Marcadores tumorales séricos para diagnosis diferencial. Aunque carecen de especificidad adecuada, pueden ser usados en combinación con información patológica o clínica. Los métodos de Ghosh et al. (2005) . Immunohistochemical (IHC) pueden ser usados para identificar el linaje tumoral pero pocos Marcadores IHC son 100% específicos. Por lo tanto, los patólogos usan a menudo un panel de Marcadores IHC. Varios estudios han demostrado precisiones del 66-88% usando de cuatro a 14 Marcadores IHC. Brown et al. (1997) ; DeYoung et al. (2000) y Dennis et al. (2005a) . Estudios diagnósticos más caros incluyen métodos de obtención de imágenes como radiografía de tórax, tomografía computarizada (TC) , y tomografías de emisión de positrones (PET) . Cada uno de estos métodos puede identificar el primario en un 30 a 50% de los casos. Ghosh et al. (2005) ; y Pavlidis et al. (2003) . A pesar de estas sofisticadas tecnologías, la capacidad de resolver casos de CUP es sólo del 20-30% ante mortem. Pavlidis et al. (2003) ; y Varadhachar y et al. (2004) .

Un nuevo enfoque prometedor reside en la capacidad de perfilado de expresión génica de todo el genoma para identificar el origen de los tumores. Ma et al. (2006) ; Dennis et al. (2005b) ; Su et al. (2001) ; Ramaswamy et al. (2001) ; Bloom et al. (2004) ; Giordano et al. (2001) y 20060094035. Estos estudios demostraron la factibilidad del tejido de identificación del origen en base al perfil de expresión génica. Para que estas tecnologías de perfilado de expresión sean útiles en el ámbito clínico, se deben superar dos obstáculos principales. Primero, como el perfilado de la expresión génica se realizó completamente en tejidos primarios, los candidatos a marcador de genes deben ser validados en tejidos metastásicos para confirmar que su expresión específica del tejido se conserva en la metástasis. Segundo, la tecnología de perfilado de expresión génica debe de ser capaz de usar tejido fijado en formalina, embebido en parafina (FFPE) , ya que las muestras de tejido fijado son el material estándar en la práctica actual. Los fijación en formalina resulta en la degradación del ARN (Lewis et al. (2001) y Masuda et al. (1999) ) por lo que los protocolos de micromatriz existentes no se realizarán con fiabilidad. Bibikova et al. (2004) . Adicionalmente, la tecnología de perfilado debe ser robusta, reproducible y fácilmente accesible.

El RTPCR cuantitativo (qRTPCR) ha demostrado que genera resultados fiables de tejido FFPE. Abrahamsen et al. (2003) ; Specht et al. (2001) ; Godfrey et al. (2000) y Cronin et al. (2004) . Por lo tanto, un enfoque más práctico sería usar un método de todo el genoma como una herramienta de descubrimiento y desarrollar un ensayo diagnóstico basado en una tecnología más robusta. Ramaswamy (2004) . este paradigma, sin embargo, requiere un conjunto de genes más pequeño para ser desarrollado. Oien y sus compañeros usaron análisis en serie de la expresión génica (SAGE) para identificar 61 Marcadores tumorales de los que desarrollaron el método RTPCR en base a once genes para cinco tipos de tumores. Dennis et al. (2002) . Otro estudio que acopla SAGE y qRTPCR desarrolló un panel de cinco genes para cuatro tipos de tumores y consiguió una precisión del 81%. Buckhaults et al. (2003) . Un estudio más reciente acopló perfilado de micromatrices con qRTPCR, pero usó 79 Marcadores. Tothill et al. (2005) .

RESUMEN DE LA INVENCION

La presente invención proporciona un método para identificar el origen de una metástasis de origen desconocido en una muestra que contiene células metastásicas que comprende los pasos de a) medir los Biomarcadores asociados con al menos seis carcinomas diferentes en donde los Biomarcadores son niveles de expresión de genes Marcadores en donde los genes Marcadores son SP-B, TTFI, DSG3, PSCA, F5, HPT1, PSA, MGB/MB, WT1 y PDEF, b) combinar los datos de los Biomarcadores en un algoritmo donde el algoritmo: normaliza los Biomarcadores frente a la referencia; e impone un punto de corte que optimiza la sensibilidad y especificidad de cada Biomarcador, pondera la prevalencia de carcinomas y selecciona un tejido de origen; c) determinar el origen en base a la probabilidad más alta determinada por el algoritmo o determinar que el carcinoma no se deriva de un conjunto particular de carcinomas; y d) medir opcionalmente Biomarcadores específicas para uno o más carcinomas

diferentes adicionales, y repetir los pasos c) y d) como sea necesario para Biomarcadores adicionales.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

Las Figuras 1-2 representan métodos del estado de la técnica para identificar el origen de una metástasis de origen desconocido. La Figura 3 representa el algoritmo de diagnóstico CUP actual. La Figura 4 representa datos de micromatrices que muestran intensidades de dos genes en un panel de tejidos. (A) Antígeno de células madre de próstata (PSCA) . (B) Factor de coagulación V (F5) . Los gráficos de barras muestran la intensidad en el eje y y el tejido en el eje x. Panc Ca, cáncer de páncreas; Panc N, páncreas normal. La Figura 5 representa electroferogramas obtenidos de un Bioanalizador Agilent. El ARN fue aislado de tejido FFPE usando una digestión de proteinasa K de tres horas (A) o dieciséis horas (B) . La muestra C22 (roja) era un bloque de un año de edad mientras que la muestra C23 (azul) era un bloque de cinco años de edad. Se muestra una escala de tamaño en verde. La Figura 6 representa una comparación de valores de Ct obtenidos de tres métodos qRTPCR diferentes: cebado de hexámeros aleatorio en la transcripción inversa seguido por qPCR con el ADNc resultante (paso RH 2) , cebado específico de genes (cebador inverso) en la transcripción inversa seguido por qPCR con el ADNc resultante (paso GSP 2) , o cebado específico de genes y qRTPCR en una reacción de una etapa (paso GSP 1) . Se dividió ARN de once muestran en los tres métodos y se midieron los niveles de ARN para los tres genes; β-actina (A) , HUMSPB (B) , y TTF (C) . El valor de Ct mediano obtenido con cada método se indica por la línea sólida. La Figura 7 representa diagramas de placas de ensayo CUP. La Figura 8 es una serie de gráficos que representan el rendimiento del ensayo sobre un intervalo de concentraciones ARN. La Figura 9 es un diagrama de flujo de trabajo experimental; nominación y validación de candidatos a Marcadores (9A) ; y optimización de ensayos y construcción y prueba del algoritmo de predicción (9B) . La Figura 10 representa la expresión de 10 candidatos a Marcadores de genes específicos de tejidos seleccionados en carcinomas metastásicos de FFPE y adenocarcinoma primario de próstata. Para cada gráfico el eje X representa el valor de expresión del Marcador normalizado. La Figura 11 representa la optimización del ensayo (a y B) Electroferogramas obtenidos de un Bioanalizador Agiletn. El ARN se aisló de tejido FFPE usando una digestión de proteinasa K de tres horas (A) o dieciséis horas. La muestra C22 (roja) era un bloque de un año de edad mientras que la muestra C23 (azul) era un bloque de cinco años de edad. Se muestra una escala de tamaño en verde. (C y D) . Comparación de valores de Ct obtenidos de tres métodos qRTPCR diferentes: cebado de hexámeros aleatorio en la transcripción inversa seguido por qPCR con el ADNc resultante (paso RH 2) , cebado específico de genes (cebador inverso) en la transcripción inversa seguido por qPCR con el ADNc resultante (paso GSP 2) , o cebado específico de genes y qRTPCR en una reacción de una etapa (paso GSP 1) . Se dividió ARN de once muestran en los tres métodos y se midieron los niveles de ARN para los dos genes; β-actina (C) y HUMSPB (D) . El valor de Ct mediano obtenido con cada método se indica por la línea sólida. La Figura 12 es un mapa térmico que muestra los niveles... [Seguir leyendo]

1. Un método de identificar el origen de una metástasis de origen desconocido que comprende los pasos de

a. medir los Biomarcadores asociados con al menos seis carcinomas diferentes en una muestra que contiene células metastásicas en donde los Biomarcadores son niveles de expresión de al menos los genes Marcadores siguientes: SP-B, TTF1, DSG3, PSCA, F5, HPT1, PSA, MGB/MG, WT1 y PDEF;

b. combinar los datos de los Biomarcadores en un algoritmo donde el algoritmo

i. normaliza los Biomarcadores frente a la referencia; y

ii. impone un punto de corte que optimiza la sensibilidad y especificidad de cada Biomarcador, pondera la prevalencia de los carcinomas y selecciona un tejido de origen;

c. determinar el origen en base a la probabilidad más alta determinada por el algoritmo o determinar que el carcinoma no se deriva de un conjunto particular de carcinomas; y

d. medir opcionalmente los Biomarcadores específicos para uno o más carcinomas diferentes adicionales, y repetir los pasos c) y d) para los Biomarcadores adicionales.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 en donde los genes Marcadores comprenden además

(a) KRT6F, p73H, y/o SFTPC; y/o

(b) ITGB6, KLK10, CLDN18, TR10 y/o FKBP10; y/o

(c) CDX1 y/o FABP1

3. El método de una de las reivindicaciones 1 ó 2 en donde la expresión génica se mide usando al menos una de las SEQ ID NOs: 11-58.

4. El método de la reivindicación 3 en donde los genes Marcadores comprenden además genes Marcadores específicos del género seleccionados de al menos uno de

i. en el caso de un paciente masculino KLK2, NGEP o NPY; o

ii. en el caso de un paciente femenino PIP, B305D, B726 o GABA-Pi; y/o PAX8, STAR o EMX2.

5. El método de la reivindicación 4 en donde, en el caso de un paciente masculino, los genes Marcadores comprenden además KLK2.

6. El método de la reivindicación 5 en donde, en el caso de un paciente masculino, los genes Marcadores comprenden además NGEP y/o NPY.

7. El método de la reivindicación 4 en donde, en el caso de un paciente femenino, los genes Marcadores comprenden además, PIP, B305D, B726 o GABA-Pi.

8. El método de la reivindicación 4 en donde, en el caso de un paciente femenino, los genes Marcadores comprenden además PAX8, STAR o EMX2.

9. El método de la reivindicación 8 en donde, en el caso de un paciente femenino, los genes Marcadores comprenden además PIP, B305D, B726 o GABA-Pi.

10. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-2, o 4-9 que comprende además medir la expresión de al menos un gen expresado consecutivamente en la muestra.

11. El método de la reivindicación 1 que comprende además obtener información clínica adicional incluyendo el sitio de metástasis para determinar el origen del carcinoma.

12. Un método de proporcionar un pronóstico o dirección de terapia determinando el origen de una metástasis de origen desconocido de acuerdo con la reivindicación 1 e identificar el pronóstico correspondiente para el mismo o el tratamiento apropiado para el mismo.

13. El uso de un kit para realizar el método de la reivindicación 1, en donde el kit comprende: ARN o ADNc que hibrida con los genes marcadores de la reivindicación 1, una micromatriz o un chip génico.