Métodos relacionados con la glucosilación de la superficie celular.

Un método para determinar una o más características del patrón de glucosilación de una glucoproteína de interésno perteneciente a la superficie celular producida por una célula,

comprendiendo el método las etapas de:

a) determinar una diferencia en el patrón de glucosilación entre:

(i) un primer patrón de glucosilación de superficie presente bajo un primer conjunto de condiciones enla superficie de una célula que produce la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficiecelular; y

(ii) un segundo patrón de glucosilación de superficie presente bajo un segundo conjunto decondiciones en la superficie de la célula; y

b) basándose en la diferencia determinada, establecer una o más características del patrón de glucosilaciónde la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular producida por la célula.

Métodos relacionados con la glucosilación de la superficie celular

Antecedentes El patrón de glucosilación de una glucoproteína juega a menudo un papel significativo en la función de esa glucoproteína. Para dar unos pocos ejemplos, un patrón de glucosilación de una glucoproteína puede afectar a su capacidad para plegarse correctamente, a su estabilidad (por ejemplo, resistencia a la degradación proteolítica y/u otra degradación) , a la actividad catalítica, a las propiedades farmacodinámicas y/o farmacocinéticas, y/o a la capacidad de esa glucoproteína para interactuar apropiadamente con otras moléculas. Como alternativa, o adicionalmente, un patrón de glucosilación de una glucoproteína puede afectar al transporte y a la selección de dianas de la glucoproteína. Por ejemplo, un patrón de glucosilación de una glucoproteína puede afectar a si la glucoproteína sigue siendo intracelular (incluyendo, por ejemplo, el envío correcto de la glucoproteína al compartimiento o compartimientos subcelulares apropiados) , a si la glucoproteína estará unida a la membrana, y/o a si la glucoproteína será segregada a partir de la célula. Por estas razones, es importante ser capaces de identificar y/o caracterizar patrones de glucosilación de glucoproteínas.

El documento WO 2007/012695 describe métodos para producir composiciones de hidratos de carbono a partir de tejidos animales, así como métodos para el análisis de glicomas.

Suzuki et al. (International Journal of Oncology, 28, 155-160, 2006) enseñan que la alteración de la sialilación de la superficie celular o la expresión de N-glucano regula la adhesión celular a galectina-1 en linfoma maligno humano.

Stamatos et al. (Journal of Leukocyte Biology, 75, 307-313, 2004) enseña que la desialilación de glucoconjugados en la superficie de monocitos purificados usando neuraminidasa exógena activa cinasa 1/2 extracelular regulada por señales, un intermedio en las rutas de señalización intracelulares.

Sumario La descripción se basa, en parte, en el reconocimiento de que los glucanos de la superficie celular pueden proporcionar información sobre el estado de la célula, por ejemplo como se refleja en la glucosilación de proteínas producidas por la célula. En particular, se ha encontrado que los glucanos de la superficie celular pueden proporcionar información sobre el estado de glucosilación de una glucoproteína producida (y opcionalmente segregada) por la célula. De este modo, no es necesario aislar una proteína diana de una célula a fin de obtener información sobre su estado de glucosilación. En su lugar, la glucosilación de una o más proteínas o lípidos sobre la superficie celular se puede evaluar para revelar indirectamente uno o más aspectos de la glucosilación de una proteína diana. Esto puede simplificar y facilitar el análisis de la glucosilación de proteínas diana.

Entre otras cosas, la presente descripción incluye métodos en los que se analizan glucanos de la superficie celular sobre células que producen al menos una glucoproteína diana. La detección de los glucanos de la superficie celular sirve como un poder para la detección de glucosilación sobre la glucoproteína diana (esto es, los glucanos detectados no están en o proceden de las glucoproteínas diana) . En muchos casos, la glucoproteína diana es una glucoproteína que no pertenece a la superficie celular. Por ejemplo, la glucoproteína diana es soluble o se segrega a partir de la célula. En tales casos, la detección de los glucanos de la superficie celular sirve como un poder para la determinación de estructuras de glucanos particulares en la glucoproteína producida que no pertenece a la superficie celular.

En ciertos casos, la presente descripción incluye métodos en los que una célula que produce una glucoproteína de interés (por ejemplo, una glucoproteína no perteneciente a la superficie celular, o cualquier otra glucoproteína distinta de aquella cuyos glucanos asociados están siendo analizados directamente) se cultiva en condiciones que permiten la expresión de la glucoproteína de interés, y después se pone en contacto con uno o más reactivos que detectan la glucosilación de un glucano de la superficie celular que no es parte de la glucoproteína de interés. Típicamente, tales métodos no incluirán una etapa de aislar la glucoproteína de interés. Además, en muchos casos, las etapas no incluyen ningún análisis directo de la glucoproteína de interés. De este modo, en tales casos, el análisis del glucano de la superficie celular se usa como un poder para evaluar la glucosilación de la glucoproteína diana.

En algunos casos de la descripción, la célula relevante es una célula de mamífero, por ejemplo una célula de CHO. En algunos casos de la descripción, la glucoproteína diana es una glucoproteína terapéutica; en algunos casos, la glucoproteína diana comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

En algunos casos, la descripción incluye métodos para identificar una propiedad de glucosilación de una glucoproteína producida mediante una célula evaluando una propiedad de un glucano de la superficie celular de la célula (por ejemplo, un glucano de la superficie celular en una glucoproteína o glucolípido sobre la superficie de la célula) . En otros casos, una propiedad de glucano de la superficie celular se puede correlacionar más generalmente con el estado de la célula, por ejemplo con la viabilidad, morfología, densidad u otra propiedad de la célula que se puede ver afectada por diferentes condiciones del procedimiento, por ejemplo en un procedimiento para cultivar la célula, por ejemplo en un procedimiento para producir un producto de glucoproteína a partir de una célula. De este modo, se pueden usar casos de la descripción en una variedad de diferentes contextos, por ejemplo, entre otras cosas, los glucanos de la superficie celular se pueden evaluar a fin de:

(a) evaluar o predecir las características de glucosilación de un producto de glucoproteína, por ejemplo un producto de glucoproteína terapéutico,

(b) monitorizar la calidad del producto de glucoproteína (por ejemplo, estructura de glucano) durante una o más etapas en un procedimiento para producir el producto de glucoproteína,

(c) detectar cambios en las condiciones del procedimiento en un procedimiento para producir un producto de glucoproteína,

(d) proporcionar información sobre (por ejemplo, comparar) diferentes lotes de una preparación de glucoproteína,

(e) proporcionar información sobre (por ejemplo, comparar) el estado celular o el estado del producto de glucoproteína durante diferentes etapas en un procedimiento para producir el producto de glucoproteína,

(f) proporcionar información sobre (por ejemplo, comparar) el estado celular o el estado del producto de glucoproteína durante la misma etapa en una pluralidad de procedimientos para producir el producto de glucoproteína; y/o

(g) proporcionar información sobre (por ejemplo, comparar) características de glucosilación de un producto de glucoproteína producido mediante dos o más células o poblaciones de células (por ejemplo, poblaciones clonales derivadas de células individuales seleccionadas de una población celular inicial) que se hacen crecer en condiciones similares o idénticas.

Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para determinar una o más características del patrón de glucosilación de una glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular producida por una célula, comprendiendo el método las etapas de:

a) determinar una diferencia en el patrón de glucosilación entre:

(i) un primer patrón de glucosilación de superficie presente bajo un primer conjunto de condiciones en la superficie de una célula que produce la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular; y

(ii) un segundo patrón de glucosilación de superficie presente bajo un segundo conjunto de condiciones en la superficie de la célula; y

b) basándose en la diferencia determinada, establecer una o más características del patrón de glucosilación de la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular producida por la célula.

Según un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un método que comprende las etapas de a) determinar una diferencia en el patrón de glucosilación entre:

(i) un primer patrón de glucosilación de superficie presente en la superficie de células en un primer cultivo de células; y

(ii) un segundo patrón de glucosilación de superficie presente en la superficie de células en cultivo, en el que el primer cultivo... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar una o más características del patrón de glucosilación de una glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular producida por una célula, comprendiendo el método las etapas de:

a) determinar una diferencia en el patrón de glucosilación entre:

(i) un primer patrón de glucosilación de superficie presente bajo un primer conjunto de condiciones en la superficie de una célula que produce la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular; y

(ii) un segundo patrón de glucosilación de superficie presente bajo un segundo conjunto de condiciones en la superficie de la célula; y

b) basándose en la diferencia determinada, establecer una o más características del patrón de glucosilación de la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular producida por la célula.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la una o más características comprende un cambio en el patrón de glucosilación de la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa para determinar una diferencia comprende determinar una diferencia en la sialilación entre los patrones de glucosilación de superficie primero y segundo.

4. El método de la reivindicación 3, en el que la etapa de establecer una o más características comprende establecer una extensión de la sialilación presente en el patrón de glucosilación de la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular.

5. El método de la reivindicación 1, en el que:

la célula productora de la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular es un cultivo de células que produce la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular;

el primer conjunto de condiciones representa un primer punto de tiempo de manera que el primer patrón de glucosilación de superficie es un patrón presente en la superficie de las células en cultivo en el primer punto de tiempo; y

el segundo conjunto de condiciones representa un segundo punto de tiempo de manera que el segundo patrón de glucosilación de superficie es un patrón presente en la superficie de las células en cultivo en el segundo punto de tiempo,

de manera que la etapa de establecer una o más características del patrón de glucosilación de la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular implica establecer un cambio a lo largo del tiempo en el patrón de glucosilación de la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular, y de ese modo permite la evaluación del estado o calidad de la producción.

6. El método de la reivindicación 1, en el que:

la célula que produce la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular es un cultivo de células que produce la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular;

los conjuntos primero y segundo de condiciones representan diferentes colecciones de parámetros de crecimiento aplicados al cultivo de células que producen la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular,

de manera que se establezcan los parámetros de crecimiento deseables para la producción de la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular.

7. Un método que comprende las etapas de a) determinar una diferencia en el patrón de glucosilación entre:

(i) un primer patrón de glucosilación de superficie presente en la superficie de células en un primer cultivo de células; y

(ii) un segundo patrón de glucosilación de superficie presente en la superficie de células en cultivo, en el que el primer cultivo y el segundo cultivo difieren entre sí con respecto a al menos un parámetro; y

b) basándose en la diferencia determinada, establecer efectos del al menos un parámetro sobre la glucosilación de glucoproteínas de interés producidas por células en cultivo;

caracterizado porque las glucoproteínas de interés son glucoproteínas no pertenecientes a la superficie celular.

8. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 7, en el que la etapa de determinar una diferencia comprende determinar una diferencia en una característica seleccionada del grupo que consiste en: grado de ocupación de sitios de glucosilación, identidad de glucanos enlazados, cantidades relativas de glucanos enlazados, composición completa o parcial de glucanos enlazados, cantidades relativas de glucanos enlazados, y sus combinaciones.

9. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de determinación comprende liberar al menos un glucano de la superficie celular a partir de la célula, y analizar el glucano liberado.

10. El método de la reivindicación 9, en el que la etapa de liberación comprende exponer la célula a una proteasa.

11. El método de la reivindicación 10, en el que la etapa de exposición comprende someter a tratamiento con proteasa de manera que se libere al menos una glucoproteína de la superficie celular, en el que el tratamiento con proteasa no rompe sustancialmente las membranas celulares.

12. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 7, en el que la etapa de determinación no implica liberar glucanos a partir de células.

13. El método de la reivindicación 9, en el que la etapa de liberación comprende:

a) escindir uno o más glucanos de la superficie celular enlazados a proteínas a partir de glucoproteínas de la superficie celular; y

b) caracterizar el uno o más glucanos de la superficie celular escindidos enlazados a proteína.

14. El método de la reivindicación 13, en el que el glucano de la superficie celular enlazado a proteína es un glucano enlazado mediante N.

15. El método de la reivindicación 13, en el que el glucano de la superficie celular enlazado a proteína es un glucano enlazado mediante O.

16. El método de la reivindicación 13, en el que el glucano de la superficie celular enlazado a proteína comprende un glucano complejo, y comprende al menos un resto de ácido siálico.

17. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 7, que comprende además una etapa de registrar información sobre la diferencia determinada o sobre al menos uno de los patrones de glucosilación en un medio fijo.

18. Un método para determinar una o más características del patrón de glucosilación de una glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular producida por una célula, comprendiendo el método:

a) proporcionar una célula que produce la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular, célula la cual tiene al menos un glucano de la superficie celular unido a la superficie de la célula, de manera que la célula tiene un patrón de glucosilación de la superficie celular; y

b) determinar al menos una característica del patrón de glucosilación de la superficie celular; y

c) basándose en la característica determinada, establecer una o más características del patrón de glucosilación de la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular, en el que la característica determinada se correlaciona con la una o más características del patrón de glucosilación de la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular.

19. Un método para determinar una o más diferencias en el patrón de glucosilación de una glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular, que comprende:

a) proporcionar una primera célula que comprende al menos un primer glucano de la superficie celular unido a la superficie de la primera célula, primera célula la cual produce la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular;

b) caracterizar el al menos un primer glucano de la superficie celular;

c) proporcionar una segunda célula que comprende al menos un segundo glucano de la superficie celular unido a la superficie de la segunda célula, segunda célula la cual produce la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular;

d) caracterizar el al menos un segundo glucano de la superficie celular;

e) determinar una o más diferencias entre el primer glucano de la superficie celular y el segundo glucano de la superficie celular; y

f) establecer una o más diferencias en el patrón de glucosilación de la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular, en el que la diferencia o diferencias determinadas entre el primer glucano de la superficie celular y el segundo glucano de la superficie celular se correlacionan con la una o más diferencias en el patrón de glucosilación de la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular.

20. Un método para determinar una o más características del patrón de glucosilación de una glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular, que comprende las etapas de:

a) proporcionar una célula que comprende al menos un glucano de la superficie celular unido a la superficie de la célula, célula la cual produce la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular; y

b) caracterizar el al menos un glucano de la superficie celular; y

c) determinar una o más características del patrón de glucosilación de la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular, en el que el al menos un glucano caracterizado se correlaciona con la una o más características del patrón de glucosilación de la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular.

21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular es aquella que no es producida de forma natural por la célula.

22. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la célula que produce la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular se ha manipulado para producir la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular.

23. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular es aquella que es producida de forma natural por la célula, y en el que la célula que produce la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular se ha manipulado para producir la glucoproteína de interés no perteneciente a la superficie celular en un nivel elevado o en condiciones predeterminadas.

Figura 1: Pérdida de fucosilación central en glucoproteína de anticuerpo expresada producida en medio de cultivo celular que contiene una concentración elevada de glucosamina Pérdida de fucosilación central en el producto Figura 2: Pérdida de fucosilación central en glucoproteínas de la superficie celular producidas en medio de cultivo celular que contiene una concentración elevada de glucosamina Pérdida de fucosilación central en glucanos de la superficie celular Figura 3A: Estructuras de glucanos de glucoproteínas de la superficie celular que se hacen crecer en medio de control

Figura 3B: Estructuras de glucanos de glucoproteínas de la superficie celular que se hacen crecer en medio que contiene una concentración elevada de glucosamina Figura 4: Análisis mediante cromatografía de líquidos de los niveles de ácido siálico de glucoproteínas expresadas de anticuerpo recombinante y de la superficie celular Figura 5: Niveles de ácido siálico en glucoproteína de anticuerpo expresada producida en medio de cultivo celular

que contiene una concentración elevada de N-acetilmanosamina Nivel de ácido siálico en el producto Figura 6: Niveles de ácido siálico en glucoproteínas de la superficie celular producidas en medio de cultivo celular que contiene una concentración elevada de N-acetilmanosamina Niveles de ácido siálico en la superficie celular Figura 7: Niveles de ácido siálico en glucoproteínas de la superficie celular producidas en medio de cultivo celular

que contiene una concentración elevada de N-acetilmanosamina Nivel de ácido siálico en la superficie celular Figura 8: Contenido de ácido siálico de la superficie celular determinado mediante cromatografía de intercambio aniónico de glucanos de la superficie celular