Métodos y productos para genotipado in vitro de variaciones génicas humanas asociadas a reacciones adversas a fármacos.

El método de genotipado se basa en la combinación de un diseño experimental de DNA-chips de genotipado y en el desarrollo de un sistema secuencial de procesamiento e interpretación de los datos experimentales generados por dichos DNA-chips de genotipado basado en el aumento de la señal de hibridación, lo que garantiza unos elevados niveles de especificidad, sensibilidad y reproducibilidad de los resultados, que permiten que dichos DNA-chips puedan ser utilizados como herramientas fiables de diagnóstico genético clínico; en particular, en la detección de variaciones génicas, por ejemplo, polimorfismos o mutaciones génicas asociadas con la resistencia a tratamientos farmacológicos.

Métodos y productos para genotipado in vitro de variaciones génicas humanas asociadas a reacciones adversas a fármacos.

Campo de la invención

La invención se adscribe al sector técnico-industrial del diagnóstico in vitro, extracorpóreo, de muestras biológicas, mediante DNA-chips, para la detección de variaciones génicas, por ejemplo, polimorfismos o mutaciones génicas asociadas con la resistencia a tratamientos farmacológicos.

Antecedentes de la invención

DNA-chips

En el año 2001, el Consorcio para el Proyecto Genoma Humano y la empresa privada Celera presentaron un primer borrador completo del genoma humano con 30.000 genes. A partir de este momento se iniciaba la posibilidad del estudio del genoma completo o estudios a gran escala (high-throughput). Los denominados "DNA-chips", también denominados "microarrays", "DNAarrays" o "bio-chips de DNA" son herramientas que la Genómica Funcional puede usar para los estudios a gran escala que se plantean en la actualidad. La Genómica Funcional estudia los cambios en la expresión de los genes debidos al ambiente al que está sometido el individuo y a las características genéticas del mismo. La secuencias de los genes presentan pequeñas variaciones interindividuales de un único nucleótido que reciben el nombre de SNP ("single nucleotide polymorphism") que en un pequeño tanto por ciento están implicados en cambios en la expresión de los genes que causan determinadas patologías. La mayoría de los estudios que aplican DNA-chips son de expresión génica aunque también se utilizan en la detección de SNPs.

El primer DNA-chip fue el "Southern blot" en el que moléculas de ácidos nucleicos marcadas se utilizaban para interrogar moléculas de ácidos nucleicos unidas a un soporte sólido. El soporte sobre el que se llevaba a cabo la interrogación en los primeros DNA-chips eran membranas de nylon. Aunque se partía de una buena idea, la técnica era todavía muy laboriosa.

Dos avances marcaron el arranque definitivo de los DNA-chips. Por una parte, el uso de un soporte sólido no poroso, como el vidrio, que facilitó la miniaturización y la detección basada en fluorescencia. Por otra parte, la adaptación de técnicas fotolitográficas utilizadas en la elaboración de semiconductores para la producción de DNA-chips conteniendo cada uno de ellos más de 400.000 oligonucleótidos distintos, en una región de aproximadamente 20 μm², los denominados DNA-chips de alta densidad.

Concretamente un DNA-chip es un soporte sólido que contiene cientos de fragmentos de secuencias de genes diferentes representadas en forma de DNA, cDNA u oligonucleótidos inmovilizadas o unidas en su superficie en posiciones fijas. Los soportes son generalmente portaobjetos de vidrio para microscopio, membranas de nylon o "chips" de silicio. Es importante que estas secuencias o sondas estén unidas al soporte en un orden fijo ya que la localización robotizada de cada uno de ellos determina el gen cuya expresión se está midiendo. En función de la tecnología empleada para la producción de los DNA-chips se pueden clasificar en:

- DNA-chips de alta densidad: Los oligonucleótidos que se encuentran en la superficie del portaobjetos de vidrio han sido sintetizados "in situ", mediante una metodología denominada fotolitografía.

- DNA-chips de baja densidad: En este caso los oligonucleótidos, cDNA o fragmentos de PCR son depositados en forma de nanogotas en la superficie del cristal mediante un robot que imprime esas secuencias de DNA en el portaobjetos. Existen pocos ejemplos de DNA-chips de baja densidad y, al contrario que en los de alta densidad, son pocas las variaciones génicas detectadas: un DNA-chip para la detección de 5 mutaciones puntuales en el gen de la tirosinasa, un DNA-chip para la detección de mutaciones en p53 y k-ras, un DNA-chip para la detección de 12 mutaciones causantes de cardiomiopatía hipertrófica, un DNA-chip para el genotipado de cepas de Escherichia coli o DNA-chips para la detección de patógenos tales como Cryptosporidium parvum o rotavirus.

Según la estrategia de diseño de los oligonucleótidos se puede hablar de:

- "Standard tiling": Se diseñan 4 oligonucleótidos totalmente complementarios a la secuencia de referencia excepto en la posición central donde se interrogan las 4 posibilidades: A, C, G y T; un ejemplo ilustrativo de esta estrategia es el DNA-chip para el genotipado de HIV-1 (Affymetrix). La posición central asegura máxima especificidad.

- "Alternative tiling": En este caso son 5 los oligonucleótidos diseñados, de forma que el quinto interroga una posible deleción en la secuencia; un ejemplo ilustrativo de esta estrategia es el DNA-chip para la detección de mutaciones en p53 (Affymetrix).

- "Block tiling": Se diseñan 4 oligonucleótidos totalmente complementarios a la secuencia normal y otros 4 totalmente complementarios a la secuencia mutante; el nucleótido que cambia se coloca en la posición central, pero 2 nucleótidos antes o después se coloca un "missmatch" que puede ser una de las cuatro bases (A, C, T o G).; un ejemplo ilustrativo de esta estrategia es el DNA-chip para la detección de mutaciones en el citocromo p450 (Affymetrix). Dentro de esta última estrategia ["block tiling"] Affymetrix usa el "missmatch" para aumentar la especificidad de la hibridación no sólo en una posición sino en las posiciones -4, -1, 0, +1 y +4 para identificar el cambio producido en la posición central ó 0. Esta estrategia se denomina "Alternative block tiling" y un claro ejemplo es el DNA-chip para la detección de 1.500 SNPs (Affymetrix).

En el caso de estudios de expresión génica, las sondas depositadas en el vidrio se hibridan con los cDNAs sintetizados a partir de los mRNAs extraídos del tejido que se quiere analizar. Estas moléculas de cDNA han sido marcadas con un fluoróforo al sintetizarse; cuanto mayor sea el número de moléculas que se unen a su secuencia complementaria en el DNA-chip, mayor será la cantidad de fluoróforo que se detecta y mide tras excitarlo con un láser. Esta medida es, por tanto, reflejo del número de moléculas de cada mRNA que había en el tejido analizado y, consecuentemente, reflejo del nivel de expresión de cada gen representado en el DNA-chip, lo que se denomina un patrón de expresión de la célula. Estos DNA-chips de expresión contienen también sondas que representan genes de control ("house-keeping genes"), lo que permite normalizar los resultados y comparar múltiples experimentos de forma cuantitativa. Con un DNA-chip, se pueden determinar en un solo experimento los niveles de expresión de cientos o miles de genes de una célula. El cDNA de la muestra problema y de la muestra control se pueden marcar con dos fluoróforos distintos por lo que en el mismo DNA-chip se pueden estudiar las diferencias entre la expresión de los genes en la muestra control y en la muestra problema.

Los DNA-chips para la detección de polimorfismos genéticos, cambios o mutaciones en general, variaciones génicas, en la secuencia de DNA, comprenden unas superficies sólidas, típicamente de cristal, en las que está depositado un elevado número de secuencias génicas complementarias de cada una de las variaciones génicas que se desea estudiar. Una de las estrategias utilizadas para detectar variaciones génicas consiste en la hibridación de las secuencias que reconocen específicamente al alelo normal y al mutado con fragmentos de DNA procedentes de la muestra que se va a analizar, amplificados mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y marcados con una molécula fluorescente. Al iluminar el DNA-chip con el láser se identifican aquellas secuencias que se han unido a la muestra problema y así se discrimina específicamente un paciente normal de un heterocigoto o un homocigoto mutante. Otra estrategia básica de detección de variaciones génicas con DNA-chips de genotipado consiste en llevar a cabo una reacción de amplificación o extensión sobre el propio DNA-chip.

Dentro de la estrategia de hibridación se puede hacer una subclasificación en función del método de análisis de la información para el genotipado:

- Aumento de la señal de hibridación: Esta estrategia compara la señal de hibridación de las sondas complementarias a los alelos normales y a los alelos mutantes. En general, las muestras mutadas deben presentar una mayor señal de hibridación en las sondas complementarias a los alelos mutantes que en el caso de los individuos normales.

- Pérdida... [Seguir leyendo]

1. Un DNA-chip de genotipado adecuado para la puesta en práctica de un método in vitro, extracorpóreo, para el genotipado simultáneo de múltiples variaciones génicas humanas presentes en uno o más genes de un sujeto asociadas a reacciones adversas a fármacos,

comprendiendo dicho método:

- extraer el ácido nucleico de una muestra biológica procedente de un sujeto;

- amplificar regiones de dicho ácido nucleico que contienen las variaciones génicas a identificar, y, opcionalmente, marcar dichos productos de amplificación durante la reacción de amplificación, para obtener unos productos de amplificación, opcionalmente marcados, que contienen las variaciones génicas a identificar;

- someter dichos productos de amplificación a una reacción de fragmentación para obtener unos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar, y, en caso de que dichos productos de amplificación no hubieran sido marcados previamente en la etapa de amplificación, marcar dichos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar;

- poner en contacto dichos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar con sondas capaces de identificar mediante hibridación las variaciones génicas correspondientes, bajo condiciones que permiten la hibridación de dichos productos de fragmentación con dichas sondas, en donde dichas sondas están depositadas en un soporte y, por cada variación génica a caracterizar, se usan 4 sondas que se depositan en dicho soporte siguiendo un patrón determinado de forma que se hallen homogéneamente distribuidas pero no agrupadas por variación génica a caracterizar, de las cuales 2 sondas detectan una variación génica y las otras 2 sondas detectan otra variación génica, en donde el número de réplicas de cada una de dichas sondas es de 10, 8 ó 6 réplicas;

- introducir, tras la hibridación, dicho soporte en un escáner y cuantificar la intensidad de los puntos en donde se ha producido la hibridación; y

- genotipar cada una de las variaciones génicas a partir de la media acotada de las intensidades de las 10, 8 ó 6 réplicas de cada una de las 4 sondas, en la que se eliminan los valores extremos, mediante la aplicación de un algoritmo que permite detectar cada una de las variaciones génicas con una sensibilidad, especificidad y reproducibilidad tales que permiten la aplicación clínica del método, en base a que conduce a la obtención de tres funciones lineales que caracterizan a cada uno de los tres genotipos posibles,

comprendiendo dicho DNA-chip un soporte sobre el que están depositadas una pluralidad de sondas útiles para detectar variaciones génicas humanas presentes en uno o más genes, en donde, por cada variación génica a detectar, hay 4 sondas, de las cuales 2 sondas detectan una primera variación génica y las otras 2 detectan una segunda variación génica, en donde el número de réplicas de cada una de dichas sondas es de 10, 8 ó 6 réplicas, depositadas siguiendo una patrón determinado y distribuidas homogéneamente entre las 2 áreas que constituyen el DNA-chip pero no agrupadas por variación génica a detectar, y, opcionalmente, unos oligonucléotidos depositados sobre el soporte útiles como controles positivos y negativos de las reacciones de hibridación, y

en el que dicho soporte comprende una pluralidad de sondas que permiten la detección de las variaciones génicas humanas asociadas a reacciones adversas a fármacos, en donde dichas variaciones génicas humanas relacionadas con reacciones adversas a fármacos se seleccionan del grupo formado por el polimorfismo Arg389Gly en el Receptor adrenérgico beta 1 (ADRB1), los polimorfismos Arg16Gly y Gln27Glu en el Receptor adrenérgico beta 2 (ADRB2), el polimorfismo Ser9Gly del Receptor dopaminérgico D3 (DRD3), los polimorfismos His452Tyr y T102C del Receptor serotonérgico 2A (HTR2A), el polimorfismo Val108Met de Catecol-O-metiltransferasa (COMT), el polimorfismo Ile105Val de Glutation S transferasa clase 1 (GSTP1), el polimorfismo Gly460Trp de Aducina 1 (ADD1), el polimorfismo Arg399Gln de la Proteína de reparación de DNA XRCC1, el polimorfismo Ile462Val del citocromo P450 1A1 (CYP1A1), el polimorfismos A1166C del Receptor tipo 1 de angiotensina II (AGTR1), el polimorfismo C-58T del receptor B2 de bradikinina (BDKRB2), el polimorfismo Met235Thr de Angiotensinógeno (AGT), los polimorfismos C430T, A1075C, 818delA, T1076C y C1080G del citocromo P450 2C9 (CYP2C9), los polimorfismos H324P, V136V, V11M, C882G, C1038T, G4180C, A1847G, C-1584G, C100T, 138insT, C1023T, G1659A, 1707T/del, G1758A/T, 1863ins9bp, 1973insG, 2539delAACT, 2549A/del, 2613delAGA, C2850T, G3183A, C3198G, T3277C, G4042A y 4125insGTGCCCACT del citocromo P450 2D6 (CYP2D6), los polimorfismos A805T, G416A, A1196G, C792G, del citocromo P450 2C8 (CYP2C8), los polimorfismos T341C, C481T, A803G, C282T, G590A, G857A y G191A, de N-acetiltransferasa 2 (NAT2), los polimorfismos G636A, G681A, C680T, A1G, IVS5+2T>A, T358C, G431A y C1297T del citocromo P450 2C19 (CYP2C19), el polimorfismo C2664T del receptor de glutamatérgico ionotrópico N-metil D-aspartato (NMDA) 2B (GRIN2B), el polimorfismo C3435T de la glicoproteína P (ABCB1), los polimorfismos A719G y G238C de Tiopurinmetiltransferasa (TPMT), el polimorfismo C677T de 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa (TPMT), los polimorfismos Asp70Gly y Ala539Thr de Butirilcolinesterasa (BCHE), el polimorfismo A-392G del citocromo P450 3A4 (CYP3A4), los polimorfismos A-163C, A-3860G, G3534A y C558A del citocromo P450 1A2 (CYP1A2), los polimorfismos G14690A, C3699T, G19386A, T29753C y G6986A del citocromo P450 3A5 (CYP3A5), el polimorfismo 44bp deleción del promotor del transportador de serotonina (SLC6A4), el polimorfismo delAGA (alelo*B) de Glutation S-transferasa M3 (GSTM3), el polimorfismo alelo nulo de Glutation S-transferasa M1 (GSTM1), el polimorfismo alelo nulo de Glutation S-transferasa n1 (GSTT1), los polimorfismos Cys112Arg y Arg158Cys de apolipoproteína E (APOE), el polimorfismo G-308A de Tumor necrosis factor (TNF), el polimorfismo G-1082A de Interleucina 10 (IL10) y combinaciones de los mismos.

2. DNA-chip según la reivindicación 1, en el que cada una de dichas 4 sondas para la detección de cada variación génica presentan la base a interrogar en la posición central y tiene una longitud comprendida entre 19 y 27 nucleótidos.

3. Uso de un DNA-chip según la reivindicación 1 ó 2 para el genotipado simultáneo, sensible, específico y reproducible de múltiples variaciones génicas humanas asociadas con reacciones adversas a fármacos.

4. Un kit adecuado para la puesta en práctica de un método in vitro, extracorpóreo, para el genotipado simultáneo de múltiples variaciones génicas humanas presentes en uno o más genes de un sujeto asociadas a reacciones adversas a fármacos que comprende:

- un DNA-chip según la reivindicación 1 ó 2;

- un protocolo de detección de dichas variaciones génicas, basado en el método que comprende: