Método de producción de ligando Apo-2, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una célula huésped quecomprende un vector replicable que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de ligandoApo-2; (b) proporcionar medios de cultivo que contienen un ion metálico divalente, en el que el ion metálico divalentees cinc y está presente en los medios de cultivo a una concentración de aproximadamente 50 micromolar aaproximadamente 250 micromolar; (c) cultivar la célula huésped en los medios de cultivo bajo condicionessuficientes para expresar el ligando Apo-2; y (d) recuperar el ligando Apo-2 de la célula huésped o medios de cultivo,en el que dicha célula huésped es E. coli.

Métodos para producir ligando apo-2 utilizando iones metálicos divalentes.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere en general a la producción de ligando Apo-2 y formulaciones de ligando Apo2 utilizando ion cinc divalente. También se proporciona la utilización de dicho ligando Apo-2 y formulaciones de ligando Apo-2 que presentan la formación y estabilidad mejorada de trímeros de Apo-2L.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El control de la cantidad de células en los mamíferos se cree que está determinado, en parte, por un equilibrio entre la proliferación celular y la muerte celular. Una forma de muerte celular, a veces denominada muerte celular necrótica, se caracteriza habitualmente como una forma patológica de muerte celular resultante de algún trauma o daño celular. En cambio, existe otra forma “fisiológica” de muerte celular que normalmente procede de una manera ordenada o controlada. Esta forma ordenada o controlada de muerte celular se denomina a menudo como “apoptosis” [véase, por ejemplo, Barr et al., Bio/Technology, 12:487-493 (1994) ; Steller et al., Science, 267: 14451449 (1995) ]. La muerte celular apoptótica tiene lugar de forma natural en mucos procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo embrionario y la selección clonal en el sistema inmune [Itoh et al, , Cell, 66:233-243 (1991) ].

Se han identificado varias moléculas, tales como el factor a de necrosis tumoral ("TNF-a") , factor de necrosis tumoral W (UTNF-WU o Ulinfotoxina-a") , linfotoxina-W (ULT-WU) , ligando CD30, ligando CD27, ligando CD40, ligando OX40, ligando 4-1BB, ligando Apo-1 (también referido como ligando Fas o ligando CD95) , ligando Apo-2 (también referido como TRAIL, AIM-1 o AGP-1) , y ligando Apo-3 (también referido como TWEAK) , como miembros de la familia de citoquinas del factor de necrosis tumoral (“TNF”) [Véase, por ejemplo, Gruss y Dower, Blood, 85:33783404 (1995) ; Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996) ; Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995) ; Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993) ; Armitage et al. Nature, 357:80-82 (1992) , WO 97/01633 publicada el 16 de enero de 1997; WO 97/25428 publicada el 17 de Julio de 1997; WO 97/46686 publicada el 11 de diciembre de 1997; WO 97/33899 publicada el 18 de septiembre de 1997; Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998) ; Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997) ]. Entre estas moléculas, se ha descrito que TNF-a, TNF-W, ligando CD30, ligando 4-1BB, ligando Apo-1, ligando Apo-2 (TRAIL) y ligando Apo-3 (TWEAK) están implicadas en la muerte celular apoptótica.

La inducción de diversas respuestas celulares mediadas por estas citoquinas de la familia del TNF se cree que se inicia por su unión a receptores celulares específicos. Se han identificado dos receptores de TNF distintos de aproximadamente 55 kDa (TNFR1) y 75-kDa (TNFR2) [Hohman et al., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989) ; Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990) ; EP 417, 563, publicada el 20 de marzo de 1991] y se han aislado y caracterizado ADNc de humano y ratón correspondiente a ambos tipos de receptores [Loetscher et al., Cell, 61:351 (1990) ; Schall et al., Cell, 61:361 (1990) ; Smith et al., Science, 248:1019-1023 (1990) ; Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991) ; Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991) ]. Se han asociados amplios polimorfismos con ambos genes de receptores de TNF [véase, por ejemplo, Takao et al., Immunogenetics, 37:199-203 (1993) ]. Ambos TNFR comparten la estructura típica de receptores de la superficie celular que incluyen regiones extracelular, transmembrana e intracelular. Las partes extracelulares de ambos receptores se hallan naturalmente también como proteínas de unión a TNF solubles [Nophar, Y. et al., EMBO J., 9:3269 (1990) ; y Kohno,

T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:8331 (1990) ]. La clonación de receptores de TNF solubles recombinantes fue descrita por Hale et al. [J. Cell. Biochem. Supplement 15F, 1991, p. 113 (P424) ].

La parte extracelular de TNFR de tipo 1 y tipo 2 (TNFR1 y TNFR2) contiene un patrón de secuencia de aminoácidos repetitivo de cuatro dominios ricos de cisteína (CRD) designados 1 a 4, empezando desde el extremo terminal NH2. Cada CRD tiene aproximadamente 40 aminoácidos de largo y contiene 4 a 6 residuos de cisteína en las posiciones que están bien conservadas [Schall et al., supra; Loetscher et al., supra; Smith et al., supra; Nophar et al., supra; Kohno et al., supra]. En TNFR1, los límites aproximados de los cuatro CRD son los siguientes: CRD1 aminoácidos 14 a aproximadamente 53; CRD2 aminoácidos de aproximadamente 54 a aproximadamente 97; CDR3 aminoácidos de aproximadamente 98 a aproximadamente 138; CDR4 aminoácidos de aproximadamente 139 a aproximadamente 167. En TNFR2, CRD2 incluye aminoácidos 17 a aproximadamente 54; CDR2 aminoácidos de aproximadamente 55 a aproximadamente 97; CDR3 aminoácidos de aproximadamente 98 a aproximadamente 140; y CRD4 aminoácidos de aproximadamente 141 a aproximadamente 179 [Banner et al., Cell, 73:431-435 (1993) ]. El papel potencial de los CRD en la unión a ligando también se describe en Banner et al., supra.

Un patrón repetitivo similar de CRD existe en varias proteínas de la superficie celular, incluyendo el receptor del factor de crecimiento nervioso p75 (NGFR) [Johnson et al., Cell, 47:545 (1986) ; Radeke et al., Nature, 325:593 (1987) ], el antígeno de células B CD40 [Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403 (1989) ], el antígeno de células T OX40 [Mallet et al., EMBO J., 9:1063 (1990) ] y el antígeno Fas [Yonehara et al., J. Exp. Med., 169:1747-1756 (1989) e Itoh et al., Cell, 66:233-243 (1991) ]. Los CRD también se hallan en las proteínas T2 del tipo TNFR (sTNFR) de poxvirus de Shope y mixoma [Upton et al., Virology. 160:20-29 (1987) ; Smith et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.,

176:335 (1991) ; Upton et al., Virology, 184: 370 (1991) ]. La alineación óptima de estas secuencias indica que las posiciones de los residuos de cisteína están bien conservadas. Estos receptores se denominan a veces colectivamente como miembros de la superfamilia de receptores TNF/NGF. Estudios recientes en p75NGFR mostraron que la deleción de CDR1 [Welcher, A.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 159-163 (1991) ] o una inserción de 5 aminoácidos en este dominio [Yan, H. y Chao, M.V., J. Biol, Chem., 266:12099-12104 (1991) ] presentaban un efecto escaso o nulo en la unión a NGF [Yan, H. y Chao, M.V., supra]. EL NGFR p75 contiene un tramo rico en prolina de aproximadamente 60 aminoácidos, entre su CRD4 y región transmembrana, que no está implicado en la unión a NGF [Peetre, C. et al., Eur. J. Hematol., 41:414-419 (1988) ; Seckinger, P. et al., J. Biol. Chem., 264:11966-11973 (1989) ; Yan, H. y Chao, M.V., supra]. Una región rica en prolina similar se halla en TNFR 2, pero no en TNFR1.

Los ligandos de la familia de TNF identificados hasta la fecha, con la excepción de la linfotoxina a, son proteínas transmembrana del tipo II, cuyo extremo C-terminal es extracelular. En cambio, la mayoría de receptores en la familia de receptores TNF (TNFR) identificados hasta la fecha son proteínas transmembrana de tipo I. Tanto en las familias de ligandos de TNF como los receptores, se ha observado homología entre los miembros de la familia principalmente en el dominio extracelular ("ECD") . Varias de las citoquinas de la familia de TNF, incluyendo TNF-a, el ligando Apo-1 y el ligando CD40, se separan proteolíticamente en la superficie celular; la proteína resultante en cada caso forma habitualmente una molécula homotrimérica que funciona como citoquina soluble. Las proteínas de la familia de receptores de TNF también se separan normalmente proteolíticamente para liberar los ECD de receptores solubles que pueden funcionar como inhibidores de las citoquinas afines.

Recientemente, se han identificado otros miembros de la familia de TNFR. Dichos miembros de la familia de TNFR recientemente identificados incluyen CAR1, HVEM y osteoprotegerina (OPG) [Brojatsch et al., Cell, 87:845855 (1996) ; Montgomer y et al., Cell, 87:427-436 (1996) ; Marsters et al., J. Biol. Chem., 272:14029-14032 (1997) ; Simonet et al., Cell, 89:309-319 (1997) ]. A diferencia de otras moléculas de tipo TNFR conocidas, Simonet et al., supra, describen que la OPG no contiene una secuencia que abarca la transmembrana hidrofóbica. Se cree que la OPG actúa como un receptor señuelo tal como se describe a continuación.

Se ha identificado en ratón otro nuevo... [Seguir leyendo]

1. Método de producción de ligando Apo-2, que comprende las etapas de: (a) proporcionar una célula huésped que comprende un vector replicable que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de ligando Apo-2; (b) proporcionar medios de cultivo que contienen un ion metálico divalente, en el que el ion metálico divalente es cinc y está presente en los medios de cultivo a una concentración de aproximadamente 50 micromolar a aproximadamente 250 micromolar; (c) cultivar la célula huésped en los medios de cultivo bajo condiciones suficientes para expresar el ligando Apo-2; y (d) recuperar el ligando Apo-2 de la célula huésped o medios de cultivo, en el que dicha célula huésped es E. coli.

2. Método, según la reivindicación 1, en el que dicho cinc es sulfato de cinc.

3. Método, según la reivindicación 2, en el que dicho cinc está presente en los medios de cultivo a una concentración de aproximadamente 50 micromolar a aproximadamente 100 micromolar.

4. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el método comprende además la etapa de

(e) purificar el ligando Apo-2.

5. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ligando Apo-2 se recupera o purifica en presencia de un ion metálico divalente, en el ion metálico divalente es cinc.

6. Método, según la reivindicación 5, en el que en la etapa (e) dicho ligando Apo-2 se purifica en presencia de un agente reductor.

7. Método, según la reivindicación 6, en el que dicho agente reductor se selecciona del grupo que consiste en DTT y BME.

8. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que dicho ligando Apo-2 se purifica mediante el contacto secuencial de dicho ligando Apo-2 a un soporte de cromatografía catiónica, soporte de hidroxiapatita y soporte cromatográfico hidrofóbico.

9. Método, según la reivindicación 8, en el que dicho soporte de cromatografía catiónica se selecciona del grupo que consiste en SP-Sefarosa, CM-Sefarosa, y resina cerámica HS Macro-Prep.

10. Método, según la reivindicación 8, en el que dicho soporte cromatográfico hidrofóbico se selecciona del grupo que consiste en fenil agarosa, butil agarosa, resina TSK y resina Toyopearl.

11. Método, según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho vector replicable comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más moléculas de ARNt.

12. Método, según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho vector replicable tiene un promotor de fosfatasa alcalina.

13. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho ligando Apo-2 comprende los aminoácidos 114 a 281 de la figura 1 (SEQ ID NO:1) .

14. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho ligando Apo-2 comprende los aminoácidos 1 a 281 de la figura 1 (SEQ ID NO:1) o un fragmento biológicamente activo o variante del mismo.

15. Método de aumentar la formación de trímeros de ligando Apo-2, que comprende exponer los polipéptidos de ligando Apo-2 a un ion metálico divalente, en el que el ion metálico divalente es cinc y está presente en una concentración de aproximadamente 50 micromolar a aproximadamente 250 micromolar.

16. Método, según la reivindicación 15, en el que se reduce la formación de dímeros de ligando Apo-2 unidos por disulfuro.

17. Formulación que comprende ligando Apo-2 y un ion metálico divalente, en la que el ion metálico divalente es cinc y está presente en la formulación a (i) una proporción molar 100:1 de cinc con respecto al ligando Apo-2, en la que dicho cinc es acetato de cinc o sulfato de cinc; o (ii) una proporción 10:1 ó 1:1 de cinc con respecto al ligando Apo-2, en la que dicho cinc es sulfato de cinc, y en la que dicha formulación tiene un pH de aproximadamente 7, 5.

18. Formulación, según la reivindicación 17, en la que dicha formulación es una formulación farmacéuticamente aceptable.

19. Formulación, según la reivindicación 17, en la que dicho ligando Apo-2 comprende los aminoácidos 114 a 281 de la figura 1 (SEQ ID NO:1) .

20. Formulación, según la reivindicación 17, en la que dicho ligando Apo-2 comprende los aminoácidos 1 a 281 de la figura 1 (SEQ ID NO:1) o un fragmento biológicamente activo o variante del mismo.

21. Método de producción de una formulación farmacéuticamente aceptable de ligando Apo-2, según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, que comprende mezclar ligando Apo-2 e ion cinc divalente, y un portador farmacéuticamente aceptable.

Figura 1 Figura 2A Figura 2B Datos cristalográficos

Apo-2L (114-281) Apo-2L (91-281) D218A Apo-2L (91-281) D218

Cristal Grupo espacial P63 R32 R32 Celda unidad (Å) a = 72, 5 c =140 a = 66, 4 c= 197, 6 a = 66, 4 c =197, 7 Resolución (Å) 3, 9 1, 9 1, 3 Cobertura (%) 94 (96) 93 (99) 100 (100) <I/c (I) > 5, 9 10, 1 12, 4 # Único (hkl) 3589 12680 41840 Redundancia 4, 9 4, 3 12, 1 Rsim (%) 15, 4 (34) 6, 2 (27) 6, 4 (34)

# Promotores en ASU 2 1 1

Refinamiento Rcrist (%) 33, 8 20 Rlibre (%) 27, 6 22 msd Enlaces (Å) 0, 009 0, 015 0, 007 msd ángulos (º) 1, 79 2, 0 1, 41 Valores B promedio --14 14

# Moléculas de agua 0 70

Rsymm = LhLi (Ihi-<Ih>) /LhI, donde Ih es la intensidad del factor de estructura promedio de i observaciones de reflexiones relacionadas con la simetría con índice de Bragg h. Rcrist = LhLillFobsIFcalcII) / LIFobsI) , donde Fobs y Fcalc son las amplitudes de los factores de estructura calculados. Rlibre = L (hkl) £1IIFobs (hkl) I-kIF (hkl) I/L (hkl) £1IFobs (hkl) I, donde el grupo 1 de reflexiones está omito el proceso de refinamiento. El 10% de los datos se incluyeron en el grupo 1 para el cálculo de Rlibre y no se incluyeron en el refinamiento. Los valores en paréntesis son para la capa de resolución

más elevada

Figura 2C

Figura 3

Figura 5

Figura 12 Figura 13