MÉTODOS PARA PURIFICAR VIRUS.

Un método de purificación de adenovirus de una preparación viral,

que comprende las etapas sucesivas de: a) someter la preparación viral a cromatografía de intercambio aniónico, en la que el adenovirus se eluye de un medio cromatográfico de intercambio aniónico; y b) someter el eluato de la etapa a) que contiene el adenovirus a cromatografía de exclusión por tamaño, donde el adenovirus se eluye de un medio cromatográfico de exclusión por tamaño, donde el medio cromatográfico de intercambio aniónico y/o el medio cromatográfico de exclusión por tamaño se pone en contacto con un tampón que comprende sacarosa al 2-16%

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E06006494.

Solicitante: SCHERING CORPORATION.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 2000 GALLOPING HILL ROAD KENILWORTH, NJ 07033-0530 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: VELLEKAMP, GARY, J., BONDOC, LAUREANO, L., JR., TANG, JOHN, CHU-TAY.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 11 de Diciembre de 1997.

Fecha Concesión Europea: 11 de Agosto de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N7/02 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 7/00 Virus, p. ej. bacteriófagos; Composiciones que los contienen; Su preparación o purificación (preparaciones de uso médico que contienen virus A61K 35/76; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos virales, p. ej. vacunas virales, A61K 39/00). › Aislamiento o purificación.

Clasificación PCT:

  • C12N7/00 C12N […] › Virus, p. ej. bacteriófagos; Composiciones que los contienen; Su preparación o purificación (preparaciones de uso médico que contienen virus A61K 35/76; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos virales, p. ej. vacunas virales, A61K 39/00).
  • C12N7/02 C12N 7/00 […] › Aislamiento o purificación.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Portugal, Irlanda, Finlandia, Rumania, Lituania, Letonia.


Fragmento de la descripción:

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El cultivo y la purificación de virus se han vuelto cada vez más importante para el desarrollo de vacunas y terapia génica. Huyghe et al. (Human Gene Therapy 6: 1403-1416 (1995)) describieron una comparación de varios métodos para la purificación de adenovirus recombinantes, que incluían cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de afinidad por cinc inmovilizado, ultracentrifugación, concluyendo que el proceso preferido para la purificación de un adenovirus recombinante es el tratamiento con nucleasa de un lisado celular, seguido de filtración a través de filtros de membrana, seguida por cromatografía DEAE, seguida por cromatografía de afinidad por cinc. El documento EP0593339A se refiere a métodos de preparación de vacunas y antígenos de Hepatitis A. El documento WO 97/08298 se refiere a un proceso para la purificación de adenovirus y virus adenoasociados. El documento WO 98/00524 se refiere a un método para la producción de adenovirus recombinantes.

En vistas a la necesidad cada vez mayor de virus purificados, por ejemplo para su uso como vectores virales para terapia génica, serían altamente deseables métodos de purificación mejorados. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Un aspecto de la invención es un método de purificación de adenovirus a

partir de una preparación viral que comprende: a) someter a la preparación viral a cromatografía de intercambio aniónico, en la que el virus se eluye de un medio cromatográfico de intercambio aniónico; y b) someter el eluato de la etapa a) que contiene el adenovirus a cromatografía de exclusión por tamaño, en la que el adenovirus se eluye a partir de un medio cromatográfico de exclusión por tamaño, en el que el medio cromatográfico de intercambio aniónico y/o el medio cromatográfico de exclusión por tamaño se pone en contacto con un tampón que comprende sacarosa al 2-16%. La preparación viral puede ser un lisado celular, que se puede filtrar antes de la etapa A. El virus puede ser un adenovirus recombinante, tal como ACN53 (descrito en el documento WO

95/11984).

El medio de intercambio aniónico puede comprender grupos dietilaminoetilo en una estructura principal de poliestireno, poliacrilamida, celulosa, agarosa reticulada, tal como FRACTOGEL™-DEAE. El medio de exclusión por tamaño puede comprender un polisacárido reticulado y puede ser una mezcla de dextrano y agarosa reticulados. Un medio de exclusión por tamaño ejemplar es SuperdexRTM-200. El medio cromatográfico de intercambio aniónico puede lavarse extensivamente antes de la aplicación a la preparación viral.

El medio de exclusión por tamaño puede proporcionarse en una columna, que se prepara como un gradiente salino decreciente en fuerza iónica desde la parte superior de la columna hacia el fondo, teniendo la parte superior de la columna un tampón que tiene una fuerza iónica sustancialmente idéntica a aquella del producto de la etapa a.

Un aspecto adicional de la invención es un virus purificado mediante el método de la reivindicación 1. DESCRIPCIÓN DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

La presente invención se refiere a la purificación de un virus, particularmente adenovirus, que puede por ejemplo producirse por cultivo en un hospedador celular y después liberarse por lisis de las células y separación de los residuos celulares. El término “virus” incluye virus de tipo silvestre, mutantes y recombinantes, especialmente vectores adenovirales para la expresión de secuencias de ácidos nucleicos heterólogas.

Las realizaciones de la invención están incluidas en la estrategia general de cromatografía de adsorción de una preparación viral seguida de cromatografía de exclusión por tamaño. Típicamente la cromatografía de intercambio aniónico se realiza en una resina de intercambio aniónico que consiste en grupos básicos en cadenas laterales unidos a una estructura principal macromolecular. Los grupos básicos son grupos amino sustituidos preferiblemente, en particular grupos dialquilaminoalquilo inferiores en los que cada grupo alquilo inferior tiene de 1 a 4, preferiblemente 2, átomos de carbono y cada grupo alquilo tiene de 2 a 4, preferiblemente 2 átomos de carbono. La estructura principal puede estar compuesta de sílice o una matriz orgánica, por ejemplo agarosa, celulosa, poliacrilamida o poliestireno reticulados; se prefiere particularmente el uso de una resina de intercambio aniónico que consiste en grupos dimetilaminoetil (grupos DMAE) o especialmente grupos dietilaminoetil (grupos DEAE) en una estructura principal de agarosa reticulada; las resinas especialmente preferidas del tipo DEAE son aquellas comercializadas con el nombre comercial "Fractogel-DEAE", por ejemplo “FRACTOGEL™ EMD DEAE650M” y “FRACTOGEL™AE". En algunas realizaciones de la invención, la “estructura principal” puede ser un soporte sólido tal como un gránulo.

La resina de intercambio aniónico preferiblemente se lava intensivamente antes de cargar la preparación viral para eliminar conservantes tales como azida sódica y etanol y otros materiales excedentes, mediante el lavado de la columna con aproximadamente de 5 a 10 volúmenes de columna de una solución básica tal como NaOH 50 mM/NaCl 1 M, seguido por aproximadamente de 5 a 10 volúmenes de columna de una solución neutralizante tal como HCl 50 mM/NaCl 1 M, seguido por aproximadamente de 5 a 30 volúmenes de tampones de carga y/o elución. Opcionalmente, la columna se lava con un tampón de concentración salina más baja que el tampón de carga y/o elución antes del lavado con tampón de carga y/o elución.

Típicamente, una preparación viral tal como lisado celular se carga en el medio cromatográfico en una solución tamponada de aproximadamente pH 7,08,5, con una concentración salina de aproximadamente 100-360 mM. La sal es típicamente NaCl. En algunas realizaciones otros tampones tales como fosfato

o Tris se usan. Pueden eluirse preferentemente contaminantes lavando la columna con un tampón a una concentración salina de aproximadamente 250380 mM. El adenovirus puede eluirse después mediante una solución con una concentración salina de aproximadamente 360-600 mM. La sal es típicamente NaCl. Típicamente, aproximadamente de 5 a 50, más preferiblemente aproximadamente 30 volúmenes de tampón se usan para eluir el virus. Pueden recogerse fracciones y ensayarse respecto a la presencia de virus mediante la medida de la A260 o A280 y combinando las fracciones de pico; como alternativa, el eluyente que contiene el pico de A260 o A280 puede recogerse en una única fracción. Esta única fracción de A260 o A280 o fracciones combinadas en el eluyente que contienen el virus se denomina “combinación de intercambio aniónico” en el presente documento.

En la etapa de cromatografía de exclusión por tamaño, se separan las moléculas de acuerdo con el tamaño en un lecho preparado con un medio poroso inerte, especialmente un medio de gel inerte, que es preferiblemente una mezcla de polisacáridos reticulados, por ejemplo, dextrano y agarosa reticulados en forma de gránulos esféricos. Las moléculas más grandes que los poros más grandes en los gránulos de gel hinchados no atraviesan los gránulos de gel y por tanto se mueven a través del lecho cromatográfico más rápido. Las moléculas más pequeñas, que entran en los gránulos de gel en distinto grado dependiendo de su tamaño y forma, se retrasan en su paso a través del lecho. Las moléculas, por tanto, se eluyen generalmente en el orden de tamaño molecular decreciente. Los virus, debido a su gran tamaño, generalmente eluyen en el volumen hueco. Por ejemplo, los adenovirus tienen un diámetro de aproximadamente 80 nm. Los medios adecuados para cromatografía de exclusión por tamaño de adenovirus incluyen, pero sin limitación, tales resinas como G6000PWXL (TosoHaas); SB-806 Alltech); SephacrylRTM S-400 HR, SephacrylRTM S-500 HR, SephacrylRTM S-1000 SF, Sephadex G-200, SegharoseRTM CL-2B; SuperdexRTM calidad prep. 200, SuperoseRTM calidad prep. 6 (Pharmacia); TSK 6000PWXL (Bodman) y Ultrahydrogel 2000 (Waters).

Cromatografía de “exclusión por tamaño” como se usa en el presente documento pretende incluir cromatografía de filtración de gel. Un medio de exclusión por tamaño particularmente preferido es aquel comercializado con el nombre comercial “SuperdexRTM200”; véase el Catálogo de Pharmacia, 1996, páginas 338-339, código nº 17-1043-01 (a granel)...

 


Reivindicaciones:

1. Un método de purificación de adenovirus de una preparación viral, que

comprende las etapas sucesivas de: a) someter la preparación viral a cromatografía de intercambio aniónico, en la que el adenovirus se eluye de un medio cromatográfico de intercambio aniónico; y b) someter el eluato de la etapa a) que contiene el adenovirus a cromatografía de exclusión por tamaño, donde el adenovirus se eluye de un medio cromatográfico de exclusión por tamaño,

donde el medio cromatográfico de intercambio aniónico y/o el medio cromatográfico de exclusión por tamaño se pone en contacto con un tampón que comprende sacarosa al 2-16%.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la preparación viral es un lisado celular.

3. El método de la reivindicación 2, en el que el lisado celular se filtra antes de la etapa a).

4. El método de la reivindicación 2, en el que el adenovirus es recombinante.

5. El método de la reivindicación 1, en el que el adenovirus es ACN53.

6. El método de la reivindicación 1, en el que el medio de intercambio aniónico comprende grupos dimetilaminoetilo o grupos dietilaminoetilo en una estructura principal de poliestireno, poliacrilamida, celulosa o agarosa reticulados.

7. El método de la reivindicación 1, en el que el medio de exclusión por tamaño comprende un polisacárido reticulado.

8. El método de la reivindicación 7, en el que el polisacárido reticulado es una mezcla de dextrano y agarosa reticulados.

9. El método de la reivindicación 1, en el que el medio cromatográfico de intercambio aniónico se lava intensamente antes de la etapa a).

5 10. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa b) comprende adicionalmente la elución del adenovirus del medio cromatográfico de exclusión por tamaño en un tampón de baja salinidad, en el que el medio de exclusión por tamaño está en una columna que contiene un gradiente salino que disminuye en fuerza iónica desde la parte superior de la columna hacia el fondo

10 de la columna.

11. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una etapa de adición de glicerol a una fracción combinada que contiene el adenovirus.


 

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