MÉTODOS PARA CRIBAR BANCOS DE ANTICUERPOS.

Un método de cribar una genoteca de moléculas para identificar o seleccionar uno o más de sus miembros que son parejas de unión candidatas para una o más entidades dianas:

(a) poner en contacto una genoteca de expresión con una o más entidades dianas; (b) someter dichas entidades dianas a al menos una etapa de lavado; (c) separar las entidades dianas que han llegado a unirse a uno o más miembros de la genoteca de expresión de los miembros no unidos de la genoteca de expresión mediante separación a través de una fase orgánica, separando de este modo las parejas de unión candidatas para dichas entidades dianas de otros miembros de la genoteca, en donde dicha genoteca de expresión es una genoteca de expresión en fagos y en donde dicha entidad diana es una molécula de la superficie celular o una molécula que se une a una fase sólida

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/GB2005/003866.

Solicitante: Affitech Research AS.

Nacionalidad solicitante: Noruega.

Dirección: Oslo Research Park Gaustadalléen 21 0349 Oslo NORUEGA.

Inventor/es: STASSAR,Marike,Josée,Janneke,Gertrud, REIERSEN,Herald.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 7 de Octubre de 2005.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/10C15
  • C40B30/04 QUIMICA; METALURGIA.C40 TECNOLOGIA COMBINATORIA.C40B QUIMICA COMBINATORIA; BIBLIOTECAS, p. ej. QUIMIOTECAS (bibliotecas combinatorias in silico de ácidos nucleicos, proteínas o péptidos G16B 35/00; química combinatoria in silico G16C 20/60). › C40B 30/00 Procedimientos de selección de bibliotecas. › midiendo la capacidad para unirse específicamente a una molécula diana, p. ej. unión anticuerpo-antígeno, unión receptor-ligando.

Clasificación PCT:

  • G01N33/68 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos.

Clasificación antigua:

  • G01N33/68 G01N 33/00 […] › en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia.

PDF original: ES-2359724_T3.pdf

 

Ilustración 1 de MÉTODOS PARA CRIBAR BANCOS DE ANTICUERPOS.
Ilustración 2 de MÉTODOS PARA CRIBAR BANCOS DE ANTICUERPOS.
Ilustración 3 de MÉTODOS PARA CRIBAR BANCOS DE ANTICUERPOS.
Ilustración 4 de MÉTODOS PARA CRIBAR BANCOS DE ANTICUERPOS.
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MÉTODOS PARA CRIBAR BANCOS DE ANTICUERPOS.

Fragmento de la descripción:

Esta invención se refiere a un método de cribar una genoteca de expresión en fagos, para identificar o seleccionar uno o más de sus miembros que son parejas de unión candidatas para una o más entidades dianas, en donde dicha entidad diana es una molécula de la superficie celular o una molécula que se une a una fase sólida. La invención se refiere además a un método mejorado de separar las parejas de unión candidatas para dichas entidades dianas de otros miembros de la genoteca.

La tecnología de expresión de anticuerpos en fagos ha demostrado ser una técnica muy adecuada para el cribado y la selección de anticuerpos para antígenos dianas definidos (para una revisión véase Hoogenboom et al., 1998, Immotechnol., 4:1-20). La mayoría de las estrategias se han basado en la disponibilidad de antígenos purificados y/o recombinantes, que han sido cribados después de la inmovilización sobre un soporte sólido.

Sondar la diversidad de superficies celulares e identificar las parejas de unión para moléculas de la superficie celular específicas para ciertos tipos de células o estados relacionados con enfermedades es la propuesta más prometedora para el desarrollo de terapias dianizadas (es decir, dirigidas a dianas). Sin embargo, la identificación de dichas parejas de unión son frecuentemente experimentos que suponen un gran reto.

Los métodos convencionales para la identificación de parejas de unión para moléculas de la superficie celular se basan en la incubación de células en suspensión o cultivo con genotecas de fragmentos monocatenarios variables de anticuerpos (abreviadamente en lo sucesivo scFv por la expresión inglesa single-chain variable fragments) complejos de expresión en fagos seguido por diversos lavados (usualmente 5 o más) y elución ácida o alcalina de los fagos unidos (véase por ejemplo Hoogenboom et al., 1999, Eur. J. Biochem., 260: 774-784; Ridgeway et al., 1999, Cancer Research, 59: 27182723; Wong et al., 2001, Cancer lmmunol. lmmunother., 50: 93-101). Esto va precedido frecuentemente por la eliminación de las parejas de unión irrelevantes mediante rondas de cribados (denominadas en inglés panning) negativas sobre los tipos de células irrelevantes. Un método muy recientemente desarrollado y de una producción más alta es el cribado de células con una genoteca de expresión en fagos después de la inmovilización de las células sobre membranas de nitrocelulosa (Radosevic et al., 2003, J. Immunol. Métodos, 272:219-233).

Una propuesta alternativa y que ahorra tiempo respecto a la propuesta convencional para el cribado, selección y clasificación de péptidos que se unen a la superficie celular usando una genoteca de expresión en fagos ha sido descrita por Giordano et al., y se denomina el método BRASIL [(por la expresión inglesa Biopanning and Rapid Analysis of Selective Interactive Ligands, 2001), Nature Med.,11: 249-1253)]. Este método se basa en una separación de la fase orgánica, en una sola etapa, de fagos libres y unidos a células que tiene la ventaja de que se evitan las etapas de lavado esenciales del método convencional (es decir, las etapas en las cuales los fagos libres son eliminados de las células por lavado), que implican un trabajo intenso e ineficaz y da como resultado que se pierdan células y ligandos potenciales.

Sorprendentemente se ha encontrado ahora que, contrariamente a las enseñanzas del método BRASIL, un método significativamente mejorado para el cribado, selección e identificación de parejas de unión para moléculas de la superficie celular, implica someter las células a al menos una etapa de lavado antes de la separación de la fase orgánica. El método descrito también muestra mejoras significativas sobre el método convencional de lavado y elución descrito anteriormente.

En su aspecto más general, la presente invención proporciona por tanto un método de cribar una genoteca de moléculas para identificar o seleccionar uno o más de sus miembros que son parejas de unión candidatas para una o más entidades dianas, que comprende:

(a) poner en contacto una genoteca de expresión con una o más entidades dianas;

(b) someter dichas entidades dianas a al menos una etapa de lavado;

(c) separar las entidades dianas que han llegado a unirse a uno o más miembros de la genoteca de expresión de los miembros no unidos de la genoteca de expresión mediante separación a través de una fase orgánica, separando de este modo las parejas de unión candidatas para dichas entidades dianas de otros miembros de la genoteca, en donde dicha genoteca de expresión es una genoteca de expresión en fagos y en donde dicha entidad diana es una molécula de la superficie celular o una molécula que se une a una fase sólida.

Considerada desde un punto de vista alternativo, la presente invención proporciona un método mejorado de separar de una genoteca de expresión parejas de unión candidatas que han llegado a unirse a una entidad diana de otros miembros de la genoteca no unidos, que comprende las etapas (a) a (c) como se han definen en la presente memoria, en donde dicha genoteca de expresión es una genoteca de expresión en fagos y en donde dicha entidad diana es una molécula de la superficie celular o una molécula que se une a una fase sólida.

La genoteca de moléculas que han de ser cribadas de acuerdo con la presente invención es una genoteca de expresión de proteínas de una genoteca de expresión en fagos. Los ejemplos de genotecas de expresión son bien conocidos y descritos la técnica e incluyen genotecas de expresión, tales como genotecas de expresión en fagos (por ejemplo Winter et al., documento WO90/05144; McCafferty et al., documento WO92/01047), bacterias (por ejemplo, Samuelson et al., 2002, J. Biotechnol. 96, 129-154), genotecas de visualización covalentes o no covalentes, tales como genotecas de expresión en ribosomas (por ejemplo, como las publicadas en el documento WO92/02536 de The Regents de the University de Colorado, WO93/03172 de University Research Corporation y el documento WO91/05058 de Kawasaki), o genotecas de PROfusión (Phylos, Inc.), en donde la proteína expresada está unida al mRNA que la codifica, o sistemas de expresión covalentes o no covalentes en los cuales la proteína expresada está unida al DNA que la codifica (por ejemplo, mediante un enlace covalente como en los sistemas descritos en el documento WO98/37186 de Actinova Ltd o mediante proteínas de acción cis en los sistemas de expresión cis, como los descritos en el documento WO04/022746), o sistemas de expresión en levaduras (por ejemplo, los descritos por Wittrup, K. D. et al., WO 99/36569; Wittrup, K. D. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12, 395-399; Lee, S. Y. et al., (2003) Trends in Biotechnol. 21, 45-52), o sistemas híbridos de dos bacterias (por ejemplo, Chien et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578). Se conocen tipos alternativos de genotecas de expresión, tales como genotecas de expresión bacterianas u otras genotecas, en donde las proteínas se expresan y secretan en forma de fragmentos solubles. Las quimiotecas también pueden ser cribadas, por ejemplo, quimiotecas de péptidos sintéticos. Las genotecas para uso en la presente son genotecas de expresión en fagos.

Las proteínas expresadas por la genoteca de expresión puede ser de cualquier longitud apropiada, siempre que dicha longitud sea suficiente para facilitar que actúe (o actúe potencialmente) como una pareja de unión para la entidad diana. Por tanto, dichas proteínas pueden ser péptidos lineales cortos (por ejemplo, de una longitud del orden de 5-50 o 730 aminoácidos), o péptidos o polipéptidos mayores que pueden estar plegados en lugar de estar en forma lineal. En contraste con el método BRASIL de la técnica anterior, como ha sido descrito por Giordano et al., supra, los métodos de la presente invención han demostrado ventajosamente ser útiles para cribar genotecas de expresión que comprenden polipéptidos más grandes, más específicamente genotecas de expresión de anticuerpos, en contraposición a genotecas de péptidos cortos.

Por tanto, las proteínas de la genoteca de expresión pueden ser codificadas por genes completos o sus fragmentos, por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican los miembros de la genoteca de expresión pueden ser una genoteca de cDNA o mRNA o sus fragmentos, por ejemplo, generados a partir de un tipo de célula particular o puede ser una genoteca de DNA genómico o sus fragmentos.

Las genotecas de expresión preferidas expresan parejas de unión a polipéptidos que son ligandos candidatos, receptores, enzimas, sustratos, antígenos etc., o sus fragmentos, y especialmente... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método de cribar una genoteca de moléculas para identificar o seleccionar uno o más de sus miembros que son parejas de unión candidatas para una o más entidades dianas:

(a) poner en contacto una genoteca de expresión con una o más entidades dianas;

(b) someter dichas entidades dianas a al menos una etapa de lavado;

(c) separar las entidades dianas que han llegado a unirse a uno o más miembros de la genoteca de expresión de los miembros no unidos de la genoteca de expresión mediante separación a través de una fase orgánica, separando de este modo las parejas de unión candidatas para dichas entidades dianas de otros miembros de la genoteca, en donde dicha genoteca de expresión es una genoteca de expresión en fagos y en donde dicha entidad diana es una molécula de la superficie celular o una molécula que se une a una fase sólida.

2. El método de la reivindicación 1, en donde dicha genoteca de expresión es una genoteca de expresión de anticuerpos.

3. El método de la reivindicación 2, en donde dicha genoteca de expresión de anticuerpos comprende anticuerpos scFv.

4. El método de una cualquiera de la reivindicaciones 1-3, en donde dicha molécula de la superficie celular es proporcionada, como un componente de células completas o una fracción de membrana de células.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha entidad diana es un antígeno.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dichas células se transforman o transfectan con ácido nucleico que codifica dicha entidad diana o se transforman o transfectan con ácidos nucleicos que codifican una genoteca de entidades dianas o son células que sobre-expresan dicha entidad diana.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dichas células son células eucariotas.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dichas células están asociadas con un estado morboso.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dichas células son células cancerosas.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 9, en donde dicha fase sólida es una fase sólida en forma de partículas.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde en la etapa (a) se proporciona más de una entidad diana.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde en la etapa (b) se llevan a cabo al menos 2, al menos 3, o al menos 4 etapas de lavado.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde en la etapa (b) se llevan a cabo 1, 2, 3 o 4 etapas de lavado.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde dicha separación a través de una fase orgánica se lleva a cabo por centrifugación.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde dicho método comprende además una o más rondas previas de cribados realizadas antes de la etapa (a) del método, en donde dicha genoteca de expresión se pone en contacto con una o más entidades no relevantes.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde las etapas (a) a (c) se repiten una

o más veces.

17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde las etapas (a) a (c) se repiten 1, 2

o 3 veces.

18. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde dichas entidades dianas que se unen a uno o más miembros de la genoteca de expresión se someten a un análisis posterior.

19. El método de la reivindicación 18, en donde dicho análisis posterior es un análisis posterior de las parejas de unión candidatas y/o entidades dianas.

20. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, que comprende además una etapa en donde dichas parejas de unión candidatas se desprenden, eliminan, eluyen o aíslan de dichas entidades dianas, o se expresan o producen en el aislamiento de dichas entidades dianas.

21. El método de la reivindicación 19 o la reivindicación 20, en donde dicho análisis posterior de las parejas de unión candidatas comprende las etapas de:

i) poner en contacto una o más de dichas parejas de unión en solución con una o más entidades dianas;

ii) capturar las entidades dianas que han llegado a unirse a una o más de las parejas de unión candidatas en una fase sólida; y

iii) detectar la presencia de una entidad diana, con lo cual se detecta la presencia de una o más parejas de unión candidatas para la entidad diana.

22. El método de la reivindicación 21, en donde dicha entidad diana es como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

23. El método de la reivindicación 21 o la reivindicación 22, en donde dichas parejas de unión candidatas comprenden una etiqueta o marcador para facilitar la etapa de captura (ii).

24. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en donde dichas entidades dianas contienen o están asociadas con un resto indicador para facilitar la detección de las entidades dianas.

25. El método de la reivindicación 24, en donde dicho resto indicador es una molécula de DNA.

26. El método de la reivindicación 24 o la reivindicación 25, en donde dicha entidad diana es una molécula de la superficie celular y dicho resto indicador es una molécula de DNA presente en las células sobre las cuales se expresa la entidad diana.

27. El método de la reivindicación 25 o la reivindicación 26, en donde dicha molécula de DNA es un gen de mantenimiento endógeno o es un resto indicador exógeno.

28. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 27, en donde dicha fase sólida en la etapa (ii) es magnética y preferiblemente en forma de partículas.

29. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 28, en donde dicha etapa de captura es facilitada por una interactuación entre una molécula de captura en la fase sólida con una etiqueta o molécula asociada con la pareja de unión candidata.

30. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 29, en donde dicha etapa de detección se lleva a cabo detectando la presencia de resto indicador sobre o asociado con la entidad diana.

31. El método de la reivindicación 30, en donde la etapa de detección es por PCR.

32. Un método para aislar y/o identificar una entidad diana desconocida que comprende las etapas como las definidas en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 y que comprende además:

(d) aislar una o más miembros de la genoteca de expresión que se unen a dicha entidad diana y

(e) usar dicho miembro de genoteca para aislar y/o identificar la entidad a la cual se une, en donde dicha genoteca de expresión es una genoteca de expresión en fagos y en donde dicha entidad diana es una molécula de la superficie celular o una molécula que está unida a una fase sólida.

33. Un método de seleccionar, identificar y/o aislar un miembro de una genoteca que es una pareja de unión específica para una entidad diana, o un método de seleccionar, identificar y/o aislar una entidad diana, de una genoteca de expresión, comprendiendo dicho método las etapas que se han definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 para seleccionar moléculas que presentan ciertas propiedades y opcionalmente (e) identificar y/o aislar el(los) miembro(s) relevantes de la genoteca que son parejas de unión específicas para la entidad diana y opcionalmente (f) usar dicho miembro de la genoteca para identificar y/o aislar la entidad diana a la que se une.

34. El método de la reivindicación 32 o la reivindicación 33, en donde la etapa (e) de la reivindicación 32 o la etapa (f) de la reivindicación 33 comprende usar dicho miembro de la genoteca para cribar una genoteca de cDNA preparada a partir de células en las cuales se expresa la entidad desconocida.


 

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