Métodos para modificar restos de hidratos de carbono.

LA INVENCION SE REFIERE A METODOS PARA CONVERTIR GRUPOS DE GLUCOSILACION DE UN ELEVADO NUMERO DE RESTOS DE MANOSA EN GRUPOS DE GLUCOSILACION HIBRIDOS O COMPLEJOS.

Métodos para modificar restos de hidratos de carbono.

La invención se refiere a un procedimiento para convertir modelos de glucosilación en proteínas y proteínas producidas por recombinación, especialmente proteínas terapéuticas, que tienen un modelo híbrido o complejo. El procedimiento implica cultivar un hongo filamentoso o una levadura para producir una glucoproteína del tipo rica en manosa que es un sustrato aceptor para GlcNacTrI. El procedimiento también implica hacer reaccionar una glucoproteína del tipo rica en manosa con una α-1,2-manosidasa y GlcNac TrI en una levadura u hongo filamentoso para producir una glucoproteína híbrida.

La glucosilación afecta a muchas propiedades de una glucoproteína, incluyendo el plegamiento apropiado de la proteína, la sensibilidad/resistencia a proteasa, el tráfico intracelular y la compartimentalización, la secreción, las asociaciones inter e intramoleculares, las afinidades intermoleculares, la selección de diana tisular y la semivida biológica. Los modelos de glucosilación también alteran de manera significativa la actividad, solubilidad, aclaramiento, agregación intermolecular y antigenicidad biológicas, especialmente de aquellas proteínas que se administran terapéuticamente in vivo.

En las patentes de los EE.UU. 5.324.663 y 5.272.066 se describen métodos de síntesis para modificar estructuras de oligosacáridos en glucoproteínas.

La producción recombinante de muchas proteínas puede alterar mucho su modelo de glucosilación. Las proteínas expresadas en bacterias están completamente sin glucosilar. Los modelos de glucosilación de la levadura de panadería no son equivalentes a los homólogos mamíferos y son muy antigénicos en mamíferos (Ballou, C. E., 1982. En Strathern, J. N. et al. (eds). The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces. Metabolism and Gene Expression. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, págs. 335-360).

De manera similar, se observan restos de glucosilo no complejos cuando se utilizan células de insecto, tales como el popular sistema de expresión de baculovirus Sf9, para expresar proteínas de mamífero (Davidson et al., Biochemistry, 29:2828-2838 (1990); Bahl, O .P. et al., en Cell Surface and Extracellular Glycoconjugates - Structure and Function, D. D. Roberts et al., eds., Academic Press, Inc. 1993 págs. 245-270). Se sintetizan oligosacáridos híbridos y ricos en manosa (Man) en proteínas producidas en células de insecto. Las estructuras primarias de estos glucanos no son diferentes de las encontradas en ciertas proteínas de mamífero tales como ribonucleasa B, tiroglobina, activador tisular de plasminógeno (este último tiene en sus sitios de glucosilación una población mixta de estructuras complejas y ricas en manosa).

Los cultivos pequeños de células de mamífero son prácticos para el uso en experimentos de expresión génica de mamíferos en laboratorio. Sin embargo, el coste y las dificultades para expresar grandes cantidades de glucoproteínas recombinantes terapéuticas en cultivos de células de mamífero son prohibitivos. Por lo tanto, se necesita un huésped que pueda producir grandes cantidades de proteínas recombinantes y que posea, o pueda modificarse para que posea, un modelo de glucosilación que sea similar al producido por las células de mamífero.

Los hongos filamentosos, por ejemplo Trichoderma, tienen ciertas ventajas como huéspedes recombinantes. Es fácil hacer crecer grandes cantidades de estos hongos y tienen la capacidad de glucosilar y secretar de manera eficaz grandes producciones de proteínas recombinantes de mamífero hacia el medio, haciendo relativamente fácil el aislamiento. Además, el modelo de glucosilación en tales proteínas es más similar a los humanos que el de la levadura de panadería. Sin embargo, todavía hay diferencias, lo que coloca a los modelos de glucosilación fúngica de tipo natural en una desventaja estructural y funcional cuando la eficacia in vivo de una proteína requiere un tipo específico de glucosilación. Por ejemplo, los residuos terminales de ácido siálico son importantes en el funcionamiento de una proteína en un sistema de mamífero, ya que impiden el aclaramiento de la glucoproteína desde el torrente sanguíneo del mamífero. Se cree que el mecanismo detrás del aumento de la semivida biológica de moléculas sialiladas está en su menor reconocimiento por parte de lectinas (Drickamer, K., J. Biol. Chem. 263:9557-9560 (1988)). Sin embargo, las células fúngicas no pueden añadir tales unidades. Las glucoproteínas sintetizadas en células fúngicas no tienen siálico.

Otra desventaja presentada por la incapacidad de generar restos de glucoproteína complejos está en la presencia de residuos terminales de manosa. Las glucoproteínas que terminan en residuos de manosa son ligandos para proteínas que se unen a manosa en macrófagos y células del sistema reticuloendotelial (Ezekowitz et al., J. Cell Sci. Suppl. 9:121-133 (1988)). Mientras esto puede ser útil en algunos casos limitados, en lo que respecta a fines de selección de diana, esto tiene una consecuencia farmacológica indeseable para la mayoría de proteínas recombinantes - por ejemplo, el rápido aclaramiento del compuesto desde la sangre. El rápido aclaramiento puede afectar de manera deletérea a la farmacocinética del agente administrado y disminuir su potencial terapéutico y aumentar su toxicidad. Por tanto, los modelos de glucosilación no complejos producidos por recombinación dificultan el uso de glucoproteínas obtenidas por recombinación para uso terapéutico humano (Sareneva, T. et al., Interferon Res. 13:267-269 (1993)).

Estas desventajas puede bloquear la utilidad biológica o farmacológica de las proteínas mamíferas generadas utilizando sistemas de transformación final. Por tanto, en la industria de glucoproteínas se ha sentido desde hace tiempo una necesidad de proporcionar modelos de glucosilación de tipo complejo o híbrido en glucoproteínas en huéspedes fúngicos, que pueden modificarse in vivo y/o in vitro, lo que les permite producir modelos de glucosilación similares a los encontrados en proteínas de eucariotas superiores.

Reconociendo la necesidad de una producción económica a gran escala de proteínas recombinantes que tienen un modelo de glucosilación mamífero, los inventores han investigado el tratamiento de residuo glucosilo en células de mamífero y fúngicas. Estos estudios han conducido al descubrimiento de que hongos filamentosos tales como Trichoderma pueden secretar una proteína deseada en forma de precursor inmaduro glucosilado que puede tratarse in vitro hasta un modelo de glucosilación mamífero de tipo híbrido. Este descubrimiento ha dado como resultado el desarrollo de métodos para preparar modelos de glucosilación de proteína complejos e híbridos, similares a los encontrados en huéspedes mamíferos.

Por consiguiente, en una primera realización, se modifica secuencialmente el modelo de glucosilación de una proteína glucosilada deseada (glucoproteína) mediante la reacción con N-acetilglucosaminil-transferasa I (GlcNAc Tr I), galactosiltransferasa y sialiltransferasa, de modo que se produce una proteína que tiene un modelo de glucosilación de tipo complejo o híbrido con ácido(s) siálico(s) terminal(es) similar al de las células de mamífero.

Por consiguiente, en una realización adicional, se modifica secuencialmente el modelo de glucosilación de una proteína glucosilada deseada en una levadura u hongo filamentoso con α-1,2-manosidasa, para mejorar la reacción con GlcNAc Tr I, galactosiltransferasa y sialiltransferasa, de modo que se produce un modelo de glucosilación de tipo híbrido con un residuo(s) ácido(s) siálico(s) terminal(es) similar al de células de mamífero.

Por consiguiente, en una realización adicional, glucoproteínas del tipo ricas en manosa se expresan en, y preferiblemente se secretan a partir de, un huésped fúngico filamentoso que se ha transformado con GlcNAc Tr I, y se modifican mediante reacción secuencial con galactosiltransferasa y sialiltransferasa de modo que se produce un modelo de glucosilación de tipo híbrido con un ácido siálico terminal, una estructura similar a la de las células de mamífero.

Por consiguiente, en una realización adicional, se modifica el patrón de glucosilación de la proteína glucosilada deseada producida en un huésped fúngico, tal como levadura u hongo filamentoso, preferiblemente Trichoderma... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para producir una glucoproteína híbrida, caracterizada porque dicho procedimiento comprende cultivar un hongo filamentoso de manera que produzca una glucoproteína del tipo rica en manosa que es un sustrato aceptor para GlcNAc Tr I, y hacer reaccionar dicha glucoproteína del tipo rica en manosa con GlcNAc Tr I.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha glucoproteína del tipo rica en manosa es una proteína que es homóloga a dicho hongo.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha glucoproteína del tipo rica en manosa es una proteína que es heteróloga a dicho hongo.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho hongo es Trichoderma o Aspergillus.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho hongo es Trichoderma reesei, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha glucoproteína del tipo rica en manosa se hace reaccionar con GlcNAc Tr I intracelularmente en dicho hongo.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha glucoproteína del tipo rica en manosa se hace reaccionar con α-1,2-manosidasa.

8. Procedimiento para producir una glucoproteína híbrida en una levadura u hongo filamentoso, caracterizado porque dicho procedimiento comprende

(a) hacer reaccionar una glucoproteína del tipo rica en manosa producida en una levadura u hongo filamentoso con una α-1,2-manosidasa in vivo; y
(b) hacer reaccionar la glucoproteína de la etapa (a) con GlcCAc Tr I.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la etapa (8) se produce intracelularmente.

10. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicha levadura se selecciona del grupo que consiste en un miembro de Pichia spp., Hansenula spp., Kluyveromyces lactis, S. cerevisiae, y Yarrowia lipolytica.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicha Pichia spp. es Pichia pastoris.

12. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicha Hansenula spp. es Hansenula polymorpha.

13. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicha levadura es S. cerevisiae.

14. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicho hongo es Trichoderma o Aspergillus.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que dicho hongo es Trichoderma reesei, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae.

16. Procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 8, en el que la glucoproteína del tipo rica en manosa se hace reaccionar con una UDP-GlcNAc.

17. Procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 8, que comprende además hacer reaccionar dicha glucoproteína híbrida con β-1,4-galactosiltransferasa.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que se hace reaccionar dicha glucoproteína híbrida con UDP-galactosa.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, que comprende además hacer reaccionar dicha glucoproteína híbrida con α-2,6-sialiltransferasa.

20. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que se hace reaccionar dicha glucoproteína híbrida con CMP-ácido siálico.

21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 17-20, en el que dichas etapas de reacción se llevan a cabo in vitro.

22. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que se hace reaccionar dicha glucoproteína híbrida con una α-1,2-manosidasa antes de dicha reacción con GlcNAc Tr I.

23. Procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 8, en el que dicha glucoproteína del tipo rica en manosa es una Man₅GlcNAc₂ que tiene la estructura

24. Procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 8, en el que dicha glucoproteína del tipo rica en manosa es una Glc-NAc-Man₅GlcNAc que tiene la estructura